高分子量和低分子量尿激酶的分离纯化及动力学性质研究

人尿激酶粗品经苯甲脒亲和柱纯化和Ｐｒｏｔｅｉｎ－ＰａｋＳＰ柱分离后,得到两种分子量的尿激酶（ＵＫ）,即高分子量尿激酶（ＨＵＫ）和低分子量尿激酶（ＬＵＫ）,采用民斯亮蓝法测定蛋白质浓度,纤维蛋白板法测定活力,测得ＨＵＫ比活为２．９×１０＾５ＩＵ／ｍｇ蛋白,ＬＵＫ为３．５１０＾５ＩＵ／ｍｇ蛋白,活力回收为７０％以上,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定,ＨＵＫ和ＬＵＫ均呈单一条带,分子量分别为５４ｋＤ和３３ｋＤ,Ｈ     

一种新的植物低分子量ATPase的纯化及性质研究

采用丙酮粉技术,DEAE-Sephadex A50及FPLC离子交换层析技术从玉米花粉胞质中分离纯化了一种具有ATPase活性和GTPase活性的低分子量可溶性蛋白,纯化倍数为105倍.用SDS-PAGE、二维电泳及薄层扫描技术分析了分离样品的纯度.亚基分子量约为38ku,非变性PAGE测定的全酶分子量为76ku,表明该酶分子是由两个相同亚基组成的二聚体蛋白.等电聚焦电泳测定其等电点为5.6,是酸性蛋白质.用抗牛脑dynamin或kinesin的抗体进行Western-blotting,结果表明该酶蛋白与它们无免疫交叉反应.药理学研究表明:38ku蛋白对Na₃VO₄及NEM均非常敏感.     

新型溶血栓剂——低分子量单链尿激酶

尿激酶是由人肾合成人尿释放的一种血纤溶酶原激活剂(Plasminogen Activator)。尿激酶以多种分子形式存在,主要有三种,一种是高分子量双链尿激酶,它的分子量为54000道尔顿,由A、B两条肽链组成,A、B二链由二硫键相连。     

一个小麦低分子量谷蛋白基因的分离

以新疆小麦日喀则基因组DNA为模板,采用Glu-D3位点特异引物进行PCR扩增。PCR产物插入pUCm-T载体,转化感受态大肠杆菌E．coli DH5a,获得阳性克隆。经测序发现该插入片段长度1287bp,包括了部分启动子序列和完整的编码序列。编码序列推导的蛋白质含有8个半胱氨酸残基,属于6类LMW-GS中的TypeI类,为以后这类基因的功能研究提供了基因材料。     

利用双水相萃取技术分离纯化尿激酶

通过研究双水相萃取系统的各种影响因素：乙醇／（NH4）2SO4的组成比例、pH值、无机盐的加入、粗酶的浓度等,探索以乙醇／（NH4）2SO4组成的双水相萃取体系纯化尿激酶的最佳条件。建立以乙醇／（NH4）2SO4组成的双水相萃取体系分离纯化尿激酶的新途径。结果表明：双水相萃取系统冰乙醇浓度为65％,（NH4）2SO4浓度为10．0％,pH8．0,酶加入量为30％,且不加入任何其他无机盐的条件下,尿激酶的纯化倍数可达到9．2倍,回收率最高达92％。     

大鼠,小鼠胰蛋白酶的分离纯化及动力学性质

采用ＳＴ１－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ亲和层析的方法,从鼠新鲜胰脏中分离得到纯的胰蛋白酶。大鼠胰蛋白酶的比活为２４６１５ＢＡＥＥＵ／ｍｇ蛋白,总活性回收率４７％;小鼠胰蛋白酶的比活为３２７６８ＢＡＥＥＵ／ｍｇ蛋白,总活性回收率５５％。经ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,二者的等电点均匀呈现单一蛋白带,两者的分子量都是２４ｋＤ。用等电聚焦电泳测定。二者的等电点均为ｐＩ９．５以上,对它们的动力学性质作了研     

高分子量尿激酶和低分子量尿激酶的分离、纯化及其某些性质的比较

就分子量而言尿激酶以两种形式存在,即高分子量尿激酶(H-UK)和低分子量尿激酶(L-UK)。分子量分别为54,000和33,000。临床实践表明H-UK治疗血栓症的效果明显比L-UK好。动力学的研究也证明H-UK激活其天然底物溶纤酶原(PG)     

基因工程人胰岛素原和胰岛素的分离纯化及性质研究

E. coli DH 5 alpha cells harboring a plasmid pWR 590-BCA 4 for fused human proinsulin production were cultured. The fused human proinsulin was isolated from the fermented cells and then subjected it to cleavage with BrCN. The cleaved product was then converted to crude proinsulin-S-sulfonate using oxidative sulfitolysis. The isolation of human proinsulin-S-sulfonate was accomplished by ion exchange chromatography on QAE-sephadex A-25, followed by gel filtration on sephadex G-50. The purified human proinsulin-S-sulfonate was folded using a disulfide interchange method. The folding mixture was then chromatographed on sephadex G-50 and purified proinsulin was obtained. The proinsulin was then converted to human insulin and C-peptide by a combination cleavage with trypsin and carboxypeptidase B. The total yield of human insulin was about 5 mg/L The Zinc insulin crystals were obtained with amorphous human insulin using citrate method. The amino acid composition N-terminal sequences as well as C-terminal amino acid residues are in agreement with expected results. The hypoglycemic activity of purified human insulin is 26-27 U/mg, as judged by mouse convulsion assay, and the RIA activity is about 99% of that of porcine insulin.     

β—葡萄糖苷酶的分离纯化和性质研究

采用分子筛和离子交换层析技术从黑曲霉Ｌ－２２菌株发酵液中分离提纯了一个由两个相同的亚基组成的β葡萄糖苷酶。研究了其酶学性质和底物专一性。     

小麦低分子量麦谷蛋白亚基分离条件优化

目的：优化一种有效分离小麦LMW-GS的实验条件。方法：以面包小麦L88-6作为材料,采用SDS-PAGE技术,通过对麦谷蛋白提取液、分离胶浓度、分离时间、电泳缓冲液等条件进行实验比较。结果与结论：含0.3mol/LNaI和1.4%4-VP的麦谷蛋白提取液能有效提取LMW-GS成分,分离胶浓度为T=14%C=3%、分离时间为40h、Tris-硼酸或Tris-甘氨酸电极缓冲液的分离条件分离效果好、重复性好、简单易行,为小麦低分子量麦谷蛋白亚基深入研究的第一个限速步骤提供了良好的解决方案。     

可溶性尿激酶受体的表达、纯化和结晶

克隆尿激酶受体可溶区域(suPAR)到果蝇胚胎细胞分泌表达载体pMT/Bip/v5-his,重组质粒与pCoHygro共转染果蝇S2细胞,筛选多拷贝稳定表达细胞系suPARS2.suPAR表达蛋白经尿激酶N端片段亲和柱、ResourceQ阴离子交换柱两步纯化后,得到高纯度的、稳定的suPAR单体.纯化后的蛋白质,与其抗体ATN615及尿激酶N端片段结构域等摩尔混合,浓缩至10g/L,以透析法进行该三元复合物晶体生长,获得衍射分辨率为1.9#的蛋白质晶体.     

尿激酶催化结构域在毕氏酵母中的表达、纯化及结晶

利用重叠延伸PCR方法扩增尿激酶催化结构域的突变体基因片段,将其克隆至表达载体pPICZαA上,转化酵母X-33,用Zeocin筛选高拷贝数的酵母菌落.重组蛋白通过阳离子琼脂糖柱纯化,纯度达到99%,该仅含尿激酶催化结构域的突变体(C279A/N302Q),无需激活即具有尿激酶活性.用气相扩散法获得蛋白质晶体,其衍射分辨率达1.45!.     

湖北推广小麦品种(系)高分子量麦谷蛋白亚基组成分析

应用SDS-PAGE技术分析了45份湖北推广小麦品种(系)籽粒的高分子量麦谷蛋白亚基组成。40份材料的高分子量麦谷蛋白亚基组成为同质,5份为异质。在Glu-1位点共检测到9种等位基因变异类型,其中Glu-A1位点有“1、2^ 、Null”3种变异类型,Glu-B1位点有“7、7 8、7 9、14 15”4种,Glu-D1位点有“2 12、5 10”2种。“Null、7 8、2 12”是主要亚基,它们的频率分别是62．5％、60％和72．5％。亚基组合类型有12种,其中(Null,7 8,2 12)亚基组合占30．0％,(1,7 8,2 12)、(1,14 15,2 12)、(Null,7 9,2 12)、(Null,7 8,5 10)4种组合的频率都在10％以上,这5种亚基组合占总组合的72．5％。供试小麦材料品质评分在5～10之间,平均评分为7．0。含5 10亚基的品种(系)所占比例低,是湖北小麦烘烤品质较差的部分原因。     

急性缺血性中风早期中小剂量溶栓治疗的初步研究

目的 研究用中、小剂量尿激酶（UK）溶栓治疗急性缺血性中风的临床效果,寻找一个安全的适合静脉溶栓的UK剂量和方法。方法 净急性缺血性中风患者分为两组：溶栓组18例,中小剂量UK溶栓,视病情变化予以追加。常规治疗组（对照组）12例,除不用UK外,其它治疗措施相同。每例患者于治疗前后进行欧洲卒中量表（ESS）评分,以评价疗效。结果 溶栓组溶栓后2h、6h、1天、2天、3天、7天和14天的ESS评分均比溶栓前升高,无并发出血现象,溶栓组治疗后第1天、第2天、第3天、第7天和第14天ESS评分与治疗前ESS评分的差值明显高于常规治疗组治疗后第1天、第2天、第3天、第7天和第14天ESS评分与治疗前ESS评分的差值。结论 用中小剂量UK溶栓,实行剂量个体化,效果较好,且副作用小。     

一株高分子量多环芳烃降解菌的筛选、鉴定及降解特性研究

采用富集培养方法从多环芳烃污染土壤中筛选分离得到1株能以苯并[a]芘(B[a]P)为唯一碳源和能源生长的菌株.形态特征观察和16S rDNA序列分析结果表明,该菌株为副球菌属(Paracoccus sp.),编号为HPD-2.HPD-2在3.0 mg/L的B[a]P液体培养基中生长较慢,培养5 d后B[a]P的降解率为89.7%.同时,该菌株对四环的芘和荧蒽也具有较好的降解能力,培养7 d后芘和荧蒽的降解率分别达到47.2%和84.5%.可见,该菌株对高分子量PAHs具有很好的降解潜力.     

Low-molecular-weight chromium-binding substance from chicken liver and American alligator liver

Low-molecular-weight chromium-binding substance (LMWCr), also known as chromodulin, is a chromium-binding oligopeptide proposed to have a function in chromium transport and insulin signaling in mammals. In this work, LMWCr has been isolated and purified for the first time from non-mammalian sources: chicken and American alligator. Milligram quantities of the oligopeptide can be obtained from kilogram quantities of liver. The LMWCr's from both sources are asparatate- and glutamate-rich oligopeptides which possess multinuclear chromium assemblies. The composition and physical and spectroscopic properties of the avian and reptilian LMWCr's are extremely similar to those of their mammalian analogues, suggesting the multinuclear sites of the biomolecule from all three classes of animal possess very similar structures. The chicken and alligator oligopeptides may possess intrinsic phosphotyrosine phosphatase activity.     

关于重组乙肝表面抗原纯化收率的研究

本文采用回归分析法研究了超速离心纯化时,固定一次溴化钾密度梯度比例,选择不同的二次溴化钾梯度比例对下一步ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－４Ｂ柱层析纯化收率的影响。结果表明：回归分析不仅能揭示纯化的最佳条件,即,二次溴化钾超速离心时溶液由２４０ｍｌ（１．０４ｇ／ｍｌ）：８００ｍ１（１．２８ｇ／ｍｌ）：６００ｍｌ（１．３２ｇ／ｍｌ）：５０ｍｌ（１．３４ｇ／ｍｌ）构成时柱层析收率最高。而且还能解释层析纯化中出现的异常结果。     

甲基对硫磷水解酶的重组表达及其纯化和性质研究

用PCR方法获得甲基对硫磷水解酶编码基因,构建了重组表达质粒pET29a_mpd,将其转化至Escherichia coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,得到C末端含有6个寡聚组氨酸的甲基对硫磷水解酶,用NiNTA亲和层析纯化得到具有活性的甲基对硫磷水解酶。测定了环境因素对酶活性的影响及酶动力学参数。甲基对硫磷水解酶水解甲基对硫磷时,最适pH86～8.8,最佳反应温度15℃;Mn2+、Zn2+、Cu2+可使酶活性增加15%～20%,Ca2+、Mg2+微弱地促进酶的作用,Ni2+对酶活性几乎无影响;1mmol/L EDTA·Na2+几乎不影响酶的活性,而10mmol/L EDTA·Na2+对甲基对硫磷水解酶有较强的抑制作用。甲基对硫磷水解酶水解乙基对硫磷时,最适pH86。25℃时,该酶对甲基对硫磷的米氏常数Km为（68.6 ± 5.1）μmol/L,kcat为（45 ± 6 ）S-1;对乙基对硫磷的米氏常数Km为（59.5 ± 6.0）μmol/L,kcat为（8 ± 1） S-1。Kcat/Km表明甲基对硫磷水解酶对甲基对硫磷的催化效率更高。     

链霉亲和素纯化和鉴定方法的研究

对链霉亲和素进行纯化、鉴定,采用冷钝化的方法去除培养液中大部分杂蛋白,用亲和层析法从链霉菌L-183的培养液中纯化链霉亲和素（SA）,经试验,SA回收率为75％～85％。鉴定表明,自制SA的分子量为74．5kD,每分子SA可结合3．2个生物素分子,活性为11．2U／mg,pI为7．4。自制SA各项生物学性质与文献报道相符。     

江浙蝮蛇蛇毒中抗肿瘤蛋白的分离纯化及活性研究

利用离子交换和凝胶过滤层析等分离技术从江浙蝮蛇蛇毒中分离纯化到一种抗肿瘤蛋白,经SDS-聚丙酰胺凝胶电泳检测其分子量为58．2ku。MTT法测定该蛋白对K562细胞的LC50为4．96μg／mL,电子显微镜观察其能引起K562细胞的凋亡,琼脂糖凝胶电泳可见典型的DNA梯状条带,实验结果表明该蛋白对K562细胞有明显的抑制作用。