花生幼苗下胚轴质膜氧化还原系统

花生幼苗下胚轴细胞膜制剂具有氧化NAD(P)H,还原Fe(CN)_6~(3-)与EDTA-Fe~(3 )的能力,当Fe(CN)_6~(3-)浓度为1mmol/L时,膜制剂氧化NADH和NAD(P)H的K_m分别为100和110μmol/L;V_(max)为1400和710nmol mg~(-1) proteinmin~(-1),最适pH为8.0。NADH 0.25 mmol/L浓度下,膜制剂还原Fe(CN)_6~(3-)的K_m为40,V_(max)为1300;还原EDTA-Fe~(3 )的K_m为125,V_(max)为180,最适pH分别为8.0与7.0。氧为该系统天然受体,鱼藤酮、抗霉素A与CN~-对其活性无影响,10μmol/L的DCCD抑制其活性约20％,10μmol/L的SHAM抑制近50％活性。     

3β,20α-羟基甾体脱氢酶的动力学性质

3β,20α-羟基甾体脱氢酶(3β,20α-Hydroxysteroid dehydrogenase,3β,20α-HSD)是从胎羊血中分离得到的。分子量为35kD。该酶以NADPH为辅酶,有两种底物。以孕酮为底物时,Km=30.8μmol/L,Vmax=0.7nmol min~(-1)(nmol enzyme)~(-1);以5α-二氢睾酮(5α-Dihydrotestosterone,5α-DHT)为底物时,Km=74μmol/L,Vmax=1.3nmol min~(-1)(nmol enzyme)~(-1)。5α-DHT竞争性抑制20α-还原活性,Ki=102μmol/L。16α-溴代乙酰氧基(16α-Bromo acetoxyprogesterone,16α-BAP)是3β,20α-HSD不可逆竞争性抑制剂,t_(1/2)=75min。对3β和20α还原活性的抑制常数Ki分别为23μmol/L和58μmol/L。     

盐生杜氏藻质膜ATPase及其对高渗震动的反应

用水溶性多聚物 ( dextran T5 0 0 PEG 335 0 )两相法制备盐生杜氏藻细胞质膜 ,经检测质膜纯度较高 ,原位膜约占 78%。质膜 ATPase的动力学常数 Km 和 Vmax分别为0 5 8mmol L和 4 3 5 9μmol Pi ( mg protein· h) ;最适 p H值是 7 5。质膜 ATPase的活性随Mg Cl2 和 Ca Cl2 浓度的升高而增加 ,但较高浓度的 Mg Cl2 和 Ca Cl2 有轻微的抑制作用 ;KCl促进质膜 ATPase的活性 ,在 1 0 0 mmol L时达到最大 ,高于 1 0 0 mmol L时抑制效应显著。钒酸钠、DES、DCCD和 NEM明显地抑制质膜 ATPase的活性 ;而 Na N3、Na NO3、Na Mo O4和KCN对质膜 ATPase的活性影响不大。高渗震动刺激了质膜 ATPase的活性。     

3种海洋鱼类肝微粒体EROD活性的测定

根据鱼类的生态习性选择了暖温性近岸底层岩礁鱼类褐菖鲉和浅海底层鱼类黄鳍鲷和黑鲷作为实验动物,系统地研究了0#柴油WSF诱导组和对照组褐菖鲉肝微粒体EROD动力学反应系统的测定条件,确定了最适测定条件为:pH值7.60、温度15℃、底物7-乙氧基异吩恶唑浓度0.5μmol/L、样品蛋白量100—800μg、还原型辅酶II NADPH 70 nmol/mL。诱导组和对照组的最适反应条件没有差别,但是诱导组的酶活性比对照组的高;对照组和诱导组EROD的Km值分别为0.144μmol/L和0.357μmol/L,Vmax值分别为0.466 nmol min-1mg-1蛋白和2.360 nmol min-1mg-1蛋白。首次在我国建立了褐菖鲉肝微粒体EROD活性检测技术。此外,比较了上述3种实验鱼类肝微粒体EROD反应系统的最适pH值和最适温度。结果表明,与褐菖鲉不同,黄鳍鲷和黑鲷肝EROD反应最适pH值都是7.80,最适温度都是25℃。     

盐生植物盐地碱蓬酪氨酸酶的酶学特性

酪氨酸酶是植物甜菜素生物合成的限速酶,但是,其酶学特性尚不了解。以黑暗培养3d的盐地碱蓬幼苗为材料,采用NaF抽提、饱和硫酸铵沉淀法提取盐地碱蓬中的酪氨酸酶,以研究其酶学特性。结果表明,酪氨酸酶氧化活性的最适温度为35℃,最适pH值为6.6,最适条件下Km=1.09mmol·L-1,Vmax=71.43μmol·g-1（FW）·min-1;酪氨酸酶羟化活性的最适温度为40℃,最适pH值为6.6,最适条件下Km=3.16mmol·L-1,Vmax=0.645μmol·g-1（FW）·min-1。Na2S2O3是盐地碱蓬酪氨酸酶的强效抑制剂,0.05mol·L-1Na2S2O3几乎完全抑制酪氨酸酶氧化及羟化活性。而0.01mmol·L-1的Cu2＋可以显著激活酪氨酸酶的氧化及羟化活性,分别为对照的126%和128.2%。这些结果表明盐地碱蓬中酪氨酸酶的羟化活性是影响甜菜红素合成速率的关键,也为深入研究盐地碱蓬酪氨酸酶在甜菜素合成中的作用及其与环境之间的关系奠定了基础。     

粘质沙雷氏菌H3010发酵型D-乳酸脱氢酶基因的克隆表达、纯化及酶学性质研究

通过PCR技术从粘质沙雷氏菌H3010基因组DNA中扩增出该D-乳酸脱氢酶基因,连接至pET-28a（＋）表达载体,转入大肠杆菌BL21（DE3）中进行了重组表达,优化了酶纯化的条件,并对其酶学性质进行初步研究。结果表明,获得的该酶编码基因全长993bp,编码330个氨基酸,大小为37kDa。经优化表达及纯化条件后重组酶纯度可达90％。酶学性质研究发现,该重组酶最适反应温度为60℃,最适酶促反应pH为7．5（O．2mol／L磷酸盐缓冲液）,37℃下测得对底物丙酮酸的动力学参数Km=3．39mmol／L,Vmax=6．87mmol／（mg·min）,对辅酶NADH的动力学参数Km=1．43mmol／L,Vmax=1．61mmo]／（mg·min）。为酶法生产D-乳酸及利用代谢工程构建产D-乳酸的基因工程菌打下基础。     

弗氏柠檬酸菌dhaT基因的克隆表达、序列分析、酶的纯化及特性研究

1,3-丙二醇（1,3-propanediol,1,3-PD）是一种重要的化工原料,越来越受到广泛的关注。以弗氏柠檬酸菌(Citrobacter freundii)基因组DNA为模板,通过PCR得到1,3-丙二醇氧化还原酶(1,3-propanediol dehydrogenase,PDOR) 的基因dhaT,序列显示与来源于C.freundii DSM 30040 (Genbank U09771)相应基因的相似性为78%。将此基因构建于表达载体pSE380,得到重组质粒pSE-dhaT。重组质粒转化到宿主菌E.coli JM109中进行了表达,重组酶通过镍柱及Sephacral S-300进行纯化,重组酶SDS-PAGE结果显示有非常明显的单一的42kDa特异性蛋白条带出现。以丙醛为底物测定重组酶还原反应的最适温度为37℃、最适pH为8.0,对丙醛的Km值为10.05mmol/L,最大反应速度Vmax为37.27umol/ min /mg;以1,3-PD为底物测定重组酶氧化反应的最适温度为25℃、最适pH为10.5,对1,3-PD的Km值为1.28mmol/L,最大反应速度Vmax为25.55umol/min/mg。重组酶的还原反应比活为49.50U/mg,氧化反应比活为79.72U/mg。该酶同样具有假定的结合Fe2+的G-X-X-H-X-X-A-H-X-X-G-X-X-X-X-X-P-H-G模体保守结构。此研究为工程菌高效生产1,3-PD奠定了基础。     

渗透调节对低温伤害敏感大豆种子质膜氧化还原活性的影响

选用对吸胀冷害敏感的大豆[Glycine max(L.)Merr.]品种"黑河23"种子为试材,研究了渗透调节增强大豆种子活力过程中种子质膜氧化还原活性的变化.结果表明,大豆种子活力指数与种子质膜氧化还原活性呈正相关.与对照相比,渗控12 h显著提高大豆种子活力,表现在发芽指数、活力指数和TF生成量的提高,种子质膜NADH和NADPH氧化速率及Fe(CN)63-和EDTA-Fe3 还原速率明显上升;随着引发时间的延长,种子活力上升变缓,种子质膜NADH和NADPH氧化速率及Fe(CN)63-还原速率上升速度变慢,EDTA-Fe3 的还原速率在渗控24 h后开始下降,但渗控72 h仍高于对照.     

杜氏盐藻细胞质膜氧化还原系统

杜氏盐藻细胞质膜具有氧化ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、还原Ｆｅ（ＣＮ）和Ｏ２的氧化还原系统。当Ｆｅ（ＣＮ）浓度为０．６ｍｍｏｌ／Ｌ时,氧化ＮＡＤＨ的Ｋｍ为９６μｍｏｌ／Ｌ,Ｔｍａｘ为１５９ｎｍｏｌ１０－８ｃｅｌｌｓｍｉｎ－１,最适ｐＨ为８．５。ＴｒｉｔｏｎＸ－１００可促进ＮＡＤＨ和Ｆｅ（ＣＮ）的氧化还原活性。ＮＡＤＨ能促进藻细胞的氧吸收,最适ＰＨ为８．５。在无外源电子供体存在时,细胞质电子供体提供的电子使Ｆｅ（ＣＮ）还原。培养液ＰＨ影响正常呼吸链、交替氧化酶途径和质膜电子传递链的耗氧比例;当有外源ＮＡＤＨ存在时,ＳＨＡＭ明显促进细胞的氧吸收,并且质膜电子传递链的耗氧比例增加。     

甲基紫精对水稻幼苗根细胞膜微囊Ca^2＋-ATP酶活性的影响

10μmol／L甲基紫精(MV)预处理水稻幼苗可明显提高其抗冷力,但这种功效可被钙的螯合剂EGTA(10 mmol／L)和钙调素(CaM)的抑制剂氯丙嗪(CPZ,0．5mmol／L)所抑制。MV预处理提高了幼苗质膜、液泡膜Ca^2 -ATP酶活性,同时也有提高质膜Fe(CN)6^3-还原速率和这些活性的冷适应性,但这些效果均可被EGTA和CPZ所抑制。离体条件下,膜微囊的Ca^2 -ATP酶活性对H2O2、O2^-、-0H敏感。结果显示,MV预处理提高幼苗的抗冷力可能是通过钙信使介导起作用的,钙信使或CaM可能刺激了质膜、液泡膜Ca^2 -ATP酶活性;而该预处理有增加质膜、液泡膜Ca^2 -ATP酶的冷稳定性则可能与该处理有提高细胞抗氧化能力、稳定冷胁迫下细胞膜系统结构有关。     

钙调素在胞外促进玉米根细胞原生质体跨质膜氧化还原反应

以膜不透性的铁氰化钾为胞外电子受体,测定了钙调素（ＣａＭ）在胞外对玉米（ＺｅａｍａｙｓＬ．）根细胞原生质体跨质膜的氧化还原反应的影响。结果表明,大分子的ＣａＭ抑制剂Ｗ７ａｇａｒｏｓｅ、小分子抑制剂ｃａｌｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ及ＣａＭ的抗血清对跨质膜铁氰化钾的还原均有不同程度的抑制作用,半抑制浓度分别为１０μｍｏｌ／Ｌ、１．５μｍｏｌ／Ｌ和１０ｍｇ／Ｌ。ＣａＭ可完全恢复ｃａｌｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ的抑制作用。外源纯化的ＣａＭ有专一性促进作用。说明ＣａＭ对玉米根细胞原生质体跨质膜的氧化还原反应有调节作用,其作用位点在质膜外侧。推测ＣａＭ可能与质膜上的ＣａＭ结合蛋白结合而直接或间接地调节质膜氧化还原系统的活性。这可能是胞外信息传递至胞内的途径之一。     

冷和盐预处理提高水稻幼苗抗寒性期间细胞Ca^2＋—ATP酶活性的变化

冷和盐预处理显著提高水稻（OryzasatwaL．）幼苗的抗寒性,但两预处理诱导提高的抗寒性可为钙的螫合剂EGTA和钙调素的抑制剂CPZ所抑制。冷预处理有提高很质膜、液泡膜和叶片的叶绿体Ca2 ．ATPase活性和质膜Fe（CN）3-6还原活性的作用,其中对提高根质膜Ca2 －ATPase活性和Fe（CN）3-6还原活性的作用尤为显著。盐预处理对提高根质膜、幼叶叶绿体Ca2 ATP酶活性和质膜Fe（CN）3-6还原活性的作用类似于冷预处理。虽然盐预处理苗液泡膜Ca2 －ATPase活性有所下降,但其活性仍明显高于未预处理苗,表明在低温胁迫下,两预处理苗都有较强的维持Ca2 稳态能力。结果揭示,冷和盐预处理诱导水稻幼苗抗寒性的提高,可能均与在低温胁迫下两预处理能有效地维持或激活Ca@ －ATPase活性有关,两者有着类似的适应机制。     

高分子量和低分子量尿激酶的分离纯化及动力学性质研究

人尿激酶粗品经苯甲脒亲和柱纯化和Protein-PahSP柱分离后,得到两种分子量的尿激酶（UK）,即高分子量尿激酶（HUK）和低分子量尿激酶（LUK）．采用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度,纤维蛋白平板法测定活力,测得HUK比活为2.9×105IU／mg蛋白,LUK为3.5×105IU／mg蛋白,活力回收为70％以上．经SDS-PAGE鉴定,HUK和LUK均是单一条带,分子量分别为54kD和33kD．HUK和LUK水解显色底物S2444的动力学常数,分别测得HUK的Km为64μmol/L,Kcat为15s-1,LUK的Km为49μmol／L,kcat为13s-1,LUK的催化效率（Kcat／Km）稍高于HUK．     

胡杨愈伤组织质膜的两相分离法及其H＋-ATPase的特性

以胡杨愈伤组织为材料,用PEG 3350/DextranT 500构成的两相系统提取质膜微囊,研究质膜H+-ATPase的特性.结果显示由6.3% PEG 3350、6.3% Dextran T500、KCl、磷酸缓冲液(pH 7.8)和蔗糖构成的两相系统提取膜微囊的H+-ATPase活性分别被Na3VO4、KNO3、NaN3抑制了约75%、2.6%和1.3%.方向性检测显示原位膜微囊占提取质膜微囊的90%,翻转膜微囊仅占10%.去垢剂对质膜H+-ATPase活性的影响说明0.015%的Triton X-100和0.01%～0.1%的Brij 58适用于测定质膜H+-ATPase活性.Lineweaver-Burk动力学分析该酶的Km值为0.65 mmol*L-1,Vmax为37.59 μmol Pi*mg-1 protein*h-1.研究结果表明两相法提取的质膜微囊主要是正向密闭的膜微囊;胡杨愈伤组织质膜H+-ATPase的最适pH为6.5,最适温度为37℃左右.     

胡杨愈伤组织质膜的两相分离法及其H~+-ATPase的特性

以胡杨愈伤组织为材料,用PEG3350/DextranT500构成的两相系统提取质膜微囊,研究质膜H+-AT-Pase的特性。结果显示:由6.3%PEG3350、6.3%DextranT500、KCl、磷酸缓冲液(pH7.8)和蔗糖构成的两相系统提取膜微囊的H+-ATPase活性分别被Na3VO4、KNO3、NaN3抑制了约75%、2.6%和1.3%。方向性检测显示原位膜微囊占提取质膜微囊的90%,翻转膜微囊仅占10%。去垢剂对质膜H+-ATPase活性的影响说明0.015%的TritonX-100和0.01%～0.1%的Brij58适用于测定质膜H+-ATPase活性。Lineweaver-Burk动力学分析该酶的Km值为0.65mmol·L-1,Vmax为37.59μmolPi·mg-1protein·h-1。研究结果表明:两相法提取的质膜微囊主要是正向密闭的膜微囊;胡杨愈伤组织质膜H+-ATPase的最适pH为6.5,最适温度为37℃左右。     

花生下胚轴组织H~ 分泌与质膜氧化还原系统的某些特性

花生幼苗下胚轴细胞表面存在氧化NADH与还原Fe(CN)_6~(3-)的氧化还原系统(redox system),它的活性随反应介质pH的上升而增加,氧是该系统的天然电子受体,受DCCD抑制。在NADH与Fe(CN)_6~(3-)被氧化与还原的同时,组织的H~ 分泌明显受到促进,并随反应介质pH上升而增加。质膜H~ -ATPase专一抑制剂Na_3VO_4(0.1 mmol/L)对组织H~ 分泌抑制绝对量基本上不受介质pH的影响,表明质膜H~ -ATPase与redox system共同参与该组织的H~ 分泌,部分redox system支配的H~ 分泌是依赖氧的。     

干旱胁迫下植物质膜功能蛋白研究现状

介绍了植物质膜中3种主要的功能蛋白,质质膜H^ -ATPase、质膜Ca^ -ATPase、质膜氧化还原蛋白的基本性质和生理功能,并对近年来有关逆境下这些膜功能蛋白（酶）活性变化的研究进展进行综述,指出需要进一步研究的问题。     

β—1,4—内切木聚糖酶的分离纯化及其性质

通过硫酸铵分级盐析、DEAE-SephadexA50和DEAE－SepharoseCL-6B离子交换层析、FPLC等一系列分离纯化手段,从拟康氏木霉（TrichodermapseudokonigiRifai）固体培养基发酵抽提液中分离得到了Native－PAGE电泳纯的木聚糖酶,SDS-PAGE显示该酶为单肽链结构,分子量约为66kD。该酶的酶反应最适温度为55℃。酶反应的最适pH为4．5。该酶作用于山毛榉木聚糖（Beech－xylan）的Km为20mg/mL,Vmax为3．3μmol·min-1·mg-1。Hg2 、Cu2 对酶反应有较强的抑制作用,而Fe2 、Mn2 对该酶反应则有促进作用。     

小麦根质膜原位膜微囊与翻转膜微囊的氧化还原特性比较

用二相法和不连续蔗糖梯度离心分别制得小麦根质膜的原位膜微囊和翻转膜微囊。两者比较可知：质膜内外两侧均表现出较高的氧化还原活性;膜内侧的ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ氧化和Ｆｅ（ＣＮ）还原速率高于外侧。质膜内外两侧都能还原ＥＤＴＡ－Ｆｅ３＋,但外侧的还原活性高于内侧。质膜内外两侧均有Ｏ２吸收,同时都可被ＳＨＡＭ刺激,被ＫＣＮ抑制。质膜内侧和外侧都可产生,最适ＰＨ值为６．０;既可被ＳＨＡＭ刺激,也可被ＳＯＤ、过氧化氢酶和ＫＣＮ抑制。     

弗氏柠檬酸杆菌植酸酶的分离纯化及其酶学性质研究

从弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)中分离纯化了一种植酸酶并进行了酶学性质研究,其反应最适pH为4.0~4.5,最适温度为40℃,在37℃下以植酸钠为底物的Km值为0.85nmol/L,Vmax为0.53IU/(mg.min),具有较好的抗胰蛋白酶的能力。酶蛋白的分子量大小约为45kDa,成熟酶蛋白N端序列为QCAPEGYQLQQVLMM。