以壳聚糖为亲和层析载体提纯胰蛋白酶

以自制的壳聚糖为亲和层析载体,鸡蛋粘蛋白作配基,通过戊二醛交联构建成亲和吸附剂,对胰蛋白酶的亲和层析提纯进行了研究。结果表明,胰蛋白酶活性回收率达70％,纯度经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定为一条带,实验有操作安全、简单、快速和收率高等优点。     

亲和层析法分离胆固醇氧化酶

利用胆固醇氧化酶和底物胆固醇之间的亲和力,以胆固醇为吸附剂构成底物亲和层析柱.发酵液经盐析、透析后直接进行亲和层析.研究了洗脱液A和B的流速、洗脱液B中表面活性剂的浓度,确定了适合的层析条件,使比酶活从0.45U/mg提高到15.5U/mg.     

亲和层析技术在生物科学中的应用及发展

近几十年来,亲和层析技术发展十分迅速,广泛应用于生物分子(如结合蛋白、酶、抑制剂、抗原、抗体、激素、激素受体、糖蛋白、核酸及多糖类等)及组织(如细胞、细胞器、病毒等)的分离和纯化,是蛋白质组学研究中重要的技术之一.介绍了亲和层析的基本类型及配体合成的研究进展,概述了亲和层析技术在蛋白质组学以及在其他方面的应用和发展动态.     

以壳聚糖为载体亲和层析胰蛋白酶

用活化的壳聚糖为载体,鸡卵粘蛋白(CHOM)为配基,制备了胰蛋白酶的亲和吸附剂。采用该吸附剂亲和层析胰酶,所得产物经SDS-PAGE电泳检测,带中只有一条带颜色较深,且与标准胰蛋白酶带位置几乎相同。实验结果表明1 g壳聚糖可以固定60 mg鸡卵粘蛋白,制成的亲和吸附剂可吸附胰蛋白酶的最大量为118 U/g。以壳聚糖为载体的亲和吸附剂制备过程简单、安全。     

定向合成化学配基亲和层析纯化碱性磷酸酶

设计合成一种含有碱性磷酸酶抑制剂－对氨基苄基磷酸的化学配基并将其耦联到琼脂糖凝胶上,制备出新型的亲和层析介质,分离纯化从小牛肠中提取的碱性磷酸酶。经过对不同配基浓度吸附剂碱性酸酶吸附容量的考察,确定配基浓度为６μｍｏｌ／ｇ的吸附剂具有最高的酰选择性。     

壳聚糖固定化酶一步纯化抑肽酶研究

采用化学改性与修饰微珠壳聚糖为载体,共价法偶联牛胰蛋白酶,制成抑肽酶亲和吸附剂,单位活力５１９０ＫＩＵ／ｇ（湿）,蛋白偶联率６０．５％,酶活性回收率５５％;将其直接亲和层析牛肺提取液,分离纯化高比活抑肽酶。方法过程简单,样品比活力５７００ＫＩＵ／ｍｇ,质量稳定,成本较低;该吸附剂机械强度高,抗污染能力较强,非特异性吸附较小,可以反复使用,价格低廉,适合工业化生产。     

改性与修饰壳聚糖固定化酶纯化抑肽酶研究

采用化学改性与修饰微珠壳聚糖为载体,共价法偶联牛胰蛋白酶,制成抑肽酶亲和吸附剂,单位活力5 190 KIU/g（湿）,蛋白质偶联率60.5％,酶活性回收率55％;将其直接亲和层析牛肺提取液,分离纯化高比活抑肽酶.方法过程简单,样品比活力5 700 KIU/mg,质量稳定,成本较低;该吸附剂机械强度高,抗污染能力较强,非特异性吸附较小,可以反复使用,价格低廉,适合工业化生产.     

用壳聚糖作为配基载体亲和层析提纯淀粉糖化酶的研究

以自制的壳聚糖作配基载体,植物血球凝集素(PHA)作配基,通过戊二醛交联研制成一种用于淀粉糖化酶提纯的新型亲和吸附剂。对淀粉糖化酶的亲和层析研究表明:提纯倍数为1.8,酶活性收率达80％,纯度经聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳(IEF-PAGE)鉴定为一条带,没有非特异性吸附作用。具有简单、安全、快速和高收率等优点。     

免疫亲和层析技术研究:间隔臂对配体偶联效率及固相抗体活性的影响

 本文研究了两种二胺类间隔臂EDA、IBPA在免疫亲和层析中的应用。结果表明,与无间隔臂的支持物(DST-支持物)比较,间隔臂的引入可大幅度降低固相抗体(单克隆和多克隆)活性的损失。这项工作可供免疫吸附剂的设计及固相配体性质的研究作为参考。     

大肠杆菌His_6融合表达载体及其表达产物的一步纯化

构建了Ｔ７启动子控制下的融合表达载体,使外源蛋白以Ｎ端与６个连续的组氨酸残基（Ｈｉｓ６）融合的形式表达。这些载体含有强Ｔ７启动子、终止子、翻译起始区、多克隆位点以及噬菌体ｆ１复制起始区,使外源基因不仅可以得到高效表达而且可以利用ｈｅｌｐｅｒｐｈａｇｅ包装单链ＤＮＡ,从而不需亚克隆就可以直接进行测序及点突变。在多数情况下,表达产物均得到可溶性表达。Ｈｉｓ,融合表达产物可经金属离子（Ｎｉ２＋）配体亲和层析一步纯化,纯化既可在天然状态下进行,也可以在变性状态下进行。利用上述融合表达载体高效活性表达了Ｈｉｓ,融合的小鼠ｃＡＭＰ依赖的蛋白激酶催化亚基,并经金属离子（Ｎｉ２＋）配体亲和层析一步分离纯化得到均一蛋白。     

利用环状糊精纯化淀粉水解酶类

环状糊精是由环状糊精葡萄糖基转移酶作用于淀粉所产生的一组非还原性环状低聚糖 ,最常见的有α,β和γ型 ,它们分别是由 6、7或 8个葡萄糖单元以α 1,4糖苷键联结而成的。由于其特殊的“内疏水外亲水”分子结构 ,使得环状糊精能与多种有机分子形成特殊结构的包合物 ;同时环状糊精还能与酶的活性 /非活性部位相互作用 ,所以以环状糊精为配体 ,利用亲和层析纯化水解淀粉的酶类     

亲和层析法分离纯化猪血浆α_2-巨球蛋白

本文报道通过聚乙二醇分级沉淀,Cibacron Blue F3GA Sepharose4B染料亲和层析和Zn螯合Sepharose4B亲和层析从猪血浆中分离纯化的方法,经高pH不连续PAGE、低pH不连续PAGE和SDS-PAGE检测证明为电泳纯。N-末端氨基酸为丝氨酸,亚基分子量为182000。     

单克隆抗体亲和层析法纯化重组溶葡萄球菌酶

溶葡萄球菌酶能够特异性杀灭金黄色葡萄球菌且不易产生耐药性, 有望成为治疗葡萄球菌属细菌引发感染的特效药物。为获得高纯度的重组溶葡萄球菌酶以达到药用标准, 本研究构建了一种以重组溶葡萄球菌酶单克隆抗体为配体的亲和层析纯化方法。纯化后的重组溶葡萄球菌酶纯度大于95%, 得率大于90%, 即使重复使用30多次, 纯化效率不变。且经比色法鉴定纯化后的重组溶葡萄球菌酶仍具有良好的活性。该方法步骤简单, 纯化效果好, 为生产高纯度重组溶葡萄球菌酶奠定了基础。     

免疫亲和层析法纯化苦瓜几丁酶

用扁豆几丁酶免疫家兔,获得抗扁豆几丁酶的抗体,将此抗体与Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ偶联,制备免疫亲和吸附剂,用以纯化苦瓜几丁酶．苦瓜叶片的粗提液经过免疫亲和吸附柱后,可获得电泳纯的几丁酶,其分子量为３５ ｋＤ,与用几丁质凝胶为亲和吸附剂的纯化结果一致．表明利用植物几丁酶在结构上的保守性,用免疫亲和法可纯化不同植物的同类几丁酶．与几丁质凝胶亲和柱相比,免疫亲和法纯化植物几丁酶具有快速、亲和柱可重复使用等的优点．利用免疫亲和层析获得的纯化样品,研究了苦瓜几丁酶对真菌的抑制试验,研究结果表明,苦瓜几丁酶能分解棉花枯萎病菌的菌丝体细胞壁制备物,并对其孢子芽管的伸长有一定抑制作用．     

金属螯合亲和层析分离蛋白质的研究

金属螯合亲和层析是近20年发展起来的一项新型分离技术。它以配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用性强等特点,逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一。本文从单组分蛋白质入手,考查了pH值、铵离子浓度、不同铵盐等对蛋白质洗脱的影响,并进行了分析。还对不同的金属螯合柱和不同性质蛋白质的洗脱性能进行了研究,比较了不同金属离子与蛋白质亲和力的区别,为实际体系的分离研究打下了基础。     

用免疫亲和层析法纯化萝卜 PHGPx 天然蛋白

萝卜磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶 (RsPHGPx) 是一个定位于线粒体的蛋白质 . 为了阐明该蛋白质线粒体定位信号的准确切割位点,采用了免疫亲和层析方法纯化天然的 RsPHGPx. 用重组 RsPHGPx 蛋白免疫兔子获得了抗 RsPHGPx 的多克隆抗血清,以重组 RsPHGPx 蛋白为配体,采用亲和层析技术对抗血清进行了纯化,得到了单特异性的抗 RsPHGPx 的抗体 . 将纯化好的抗体偶联到一个 N- 羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 预先激活的琼脂糖柱子上,装配成一个以单特异性的抗 RsPHGPx 抗体为配体的免疫亲和层析柱 . 经过对纯化条件的摸索和优化,形成了一个简单、特异的一步法纯化方案 . 按照该方案,从萝卜幼苗线粒体总蛋白质提取物中纯化到一个分子质量与预期值相一致的特异蛋白质 . 免疫印迹分析表明,该蛋白质被抗 RsPHGPx 的抗血清特异识别 . 酶活性分析表明,该蛋白质具有显著的 PHGPx 活性 . 这些结果表明,纯化到的特异蛋白质是萝卜的 RsPHGPx 天然蛋白 . 这是首个关于定位于植物细胞器的 PHGPx 蛋白纯化的报道 . 这一结果为准确测定 RsPHGPx 信号肽的切割位点奠定了基础,并将有助于对植物 PHGPx 的亚细胞定位机制及其生理功能的深入研究 .     

明胶亲和层析纯化人血浆纤维连接蛋白及其糖链结构的初探

应用明胶亲和层析并结合凝胶过滤的方法,纯化人血浆纤维连接蛋白(Fn),此法仅二步层析,步骤简化且操作简便。纯化的Fn经凝胶电泳鉴定为一条蛋白条带,免疫鉴定仍保持原有的抗原性,得率为36％。用ConA亲和层析鉴定纯化的Fn分子中糖链结构为N-连接型复杂型糖链二天线,此均一糖链结果佐证了Fn的纯度。还对凝胶过滤分离得到的具有Fn抗原性的Fn片段进行了讨论。     

用亲和层析技术鉴别布氏菌强弱毒差异抗原成分

采用CDI和CCA两种方法活化Sepharose4B,制备亲和层析柱,并对这两种方法的优劣进行了比较。分别用超声液破碎和Ribi机器压榨制备布氏菌强毒M28株和疫苗M25株的可溶性抗原,作为亲和层析柱的配基。抗M28的血清经过M28和M5柱,洗脱液中的抗体再分别和M28、M5抗原反应经电转印检查证实,M28抗原中的一条蛋白带只与M28柱洗脱液反应,不与M5柱洗脱液反应。这种只与M28柱洗脱液反应的蛋白可能即是布氏菌强毒M28株所特有的抗原成分,也就是强毒株和弱毒株的差异抗原成分。     

单克隆抗体亲和层析纯化长叶车前花叶病毒

长叶车前花叶病毒上海分离株(HRVsh)单克隆抗体1H2,经纯化后以溴化氰活化法偶联于Sepharose 4B上制成亲和层析柱。HRVsh感染的三生烟提取液,经一次聚乙二醇沉淀初步纯化,悬浮液上亲和层析柱,于磷酸缓冲液中吸附,蒸馏水洗脱。收集的病毒制剂接种心叶烟有感染性,电镜观察见典型的HRVsh粒子,紫外吸收光谱与常规方法提纯的病毒相似,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳呈一条带。结果表明单克隆抗体亲和层忻得到高度纯化的HRVsh。最后讨论了单克隆抗体亲和层析方法的优点。     

血浆蛋白分离纯化的进展——亲和技术的重要作用

从血浆中分离纯化各种药用蛋白质仍然是生物技术的重要产业。分离纯化技术的进展使得一血多用成为可能 ,大大降低了产品成本。其中 ,亲和技术扮演了重要的角色。经过 2 0多年的进展 ,亲和层析已经从实验室走进产业化 ,以其高选择性、高活性回收率和高纯度等特点 ,成为纯化蛋白质等生物大分子最有效的技术之一。在血浆分离中 ,以乙醇沉淀或离子交换层析预处理后血浆组分为原料 ,用亲和层析可高效地获得目标血浆蛋白。综述了近年来各种亲和层析在血浆蛋白分离制备中的应用 ,并展望了血浆蛋白分离纯化发展的趋势。