体外重组质粒pIB2及其性质的初步研究

本文报导了将大肠杆菌抗四环素质粒pSC101及抗卡那霉素、大肠杆菌素E1质粒pCR1,在体外经限制酶ECoR1和T4DNA连接酶作用,进行重组,经转化后,筛选得到了重组质粒pIB2。pIB2兼有抗四环素、卡那霉素和对大肠杆菌素E1免疫的特性。对pIB2 DNA进行电泳和电镜观察,计算分子量证明pIB2确为pSC101与pCR1的重组。测得pIB2的转化频率为4.0×10~(-6),每微克DNA转化体数为4.2×10~4。pIB2对四环素和卡那霉素的抗药水平分别为每毫升25～30微克和200微克,并与pSC101和pCR1作了比较。限制酶Bam H1在原pSC101上具有一个切点而在pCR1上无切点,因而预计pIB2与Bam H1配合使用,可作遗传工程研究中双耐药标记的分子运载工具。     

用凝胶电泳纯化具有生物学活性的质粒DNA

采用一般柱电泳装置,在琼脂糖凝胶上将质粒ColEl、pBR322、pSC101、pCRI的DNA与染色体DNA及小分子核酸杂质分开,切出含有质粒的凝胶薄片,电洗脱回收质粒DNA,产物可被限制酶Eco RI酶解;将pBR 322、PSC 101、pCRI DNA转化大肠杆菌C_(600),每微克DNA可产生10~4个转化子;从pSC 101、pCRI转化子细胞中再抽提出相应质粒,它们同样具有亲本质粒的遗传特性和分子特性。     

双功能质粒的构建与功能表达

将大肠杆菌抗四环素、氨基苄青霉素、氯霉素质粒pBR325和金黄色葡萄球菌/枯草杆菌抗新霉素、卡那霉素质粒pUB110,在体外经限制性内切酶EcoRI和T4 DNA连接酶作用,进行重组,获得了重组质粒pMM 1。pMM 1兼有抗四环素、氨基苄青霉素、卡那霉素和新霉素以及对氯霉素敏感的特性;用凝胶电泳法测定分子量,证明pMM1确为pBR325和pUB110两者的重组质粒。pMM 1在大肠杆菌中的转化频率为每微克DNA 0.79×10~3个转化子,在枯草杆菌受体中为每微克DNA 0.15×10~2个转化子。pMM1不仅能分别在大肠杆菌和枯草杆菌两种受体中复制,而且能同样表达,其抗药性水平为:对氨基苄青霉素不小于每毫升160微克,对四环素不小于每毫升120微克,对新霉素、卡那霉素不小于每毫升80微克。此外,用同样的方法构建了pBR 322和pUB 110的另一个重组质粒pMM 2,也获得了类似的结果。     

双抗性质粒pSC33、pSC48的构建及其特性研究

截短的短小芽孢杆菌质粒pCJ3与去除了复制功能的金黄色葡萄球菌质粒PUB110经EcoRI酶切,DNA连接酶连接后组建T_o~r及K_m~r的双抗性的重组质粒pSC33和和PSC48。根据电泳迁移率估算pSC33及pSC48的大小分别为6.7及6.27Kb。具有BamHⅠ、AVaⅠ、XbaⅠ及BgLⅡ等限制酶的单切点,其中BgLⅡ切点位于卡那霉素抗性基因内。pSC33及pSC48能转化枯草杆菌各种突变体的感受态细胞,转化率比亲本质粒高一个数量级,也能转化枯草杆菌的原生质体。pSC33及pSC48在枯草杆菌BR151中表现稳定,以PSC48和载体克隆了滑鼠蛇肝线粒体DNA片段。     

体外建成带有λ噬菌体DNA片段的重组质粒

将大肠杆菌抗四环素及抗氨苄青霉素的质粒pBR322的DNA、大肠杆菌λ噬菌体DNA在体外经限制性核酸内切酶Hind Ⅲ切割,并用T4DNA连接酶连接后,以大肠杆菌K12HB101(recA~-r(?)m(?))为受体进行转化,采用插入钝化(insertional inactivation)方法选择重组质粒。利用环丝氨酸浓缩Ap~rTc~3转化体。在648株Ap~r转化体中选出120株无性繁殖系为Ap~rTc~s。随机挑出3株含有重组质粒的无性繁殖系进行大肠杆菌素El(colicin El)免疫特性测定及显微镜观察,证明为大肠杆菌素El敏感,并为典型的大肠杆菌形态。随机挑出一株含有重组质粒pAG-5的无性繁殖系,采用Zasloff等酸酚法进行重组质粒DNA提取,用Hind Ⅲ消化重组质粒DNA后进行琼脂糖凝胶电泳分析,观察到重组质粒pAG-5除pBR322质粒DNA带外含有λ-Hind Ⅲ的第5 DNA带。用重组质粒DNA再次对HB101(recA~-r(?)m(?))及K12 802(Su_(11)~+m_K~+)受体进行转化,转化体在含氨苄青霉素培养基平皿上生长,但在含四环素培养基平皿上不生长,再次证明为Ap~rTc~5.每微克重组质粒DNA Ap~r转化体为4.0—4.6×10~3。     

质粒和λ噬菌体DNA简便的分离纯化方法

用甲酯化白蛋白硅藻土(MAK)柱层析方法分离纯化的质粒pBR322,ColE_1,pSC101,pCR1和λDNA,经EcoR_1限制性内切酶作用,琼脂糖凝胶电泳分析,抗药因子转化,结果表明这些材料可以用作DNA重组体的载体和限制性内切酶的底物。     

一个体外构建的重组质粒——pCBI

构建了质粒pBR322和pCRI 的重组质粒——pCBI。已通过转化技术将其送入大肠杆菌,在含有四环素和卡那霉素的培养基中筛选了转化子。在细菌培养液内加入氯霉素使转化子中的重组质粒扩增。采用琼脂糖凝胶电泳法及水溶性两相抽提法纯化重组质粒。重组质粒pCBI 的电泳速度低于两个亲本质粒。用限制酶EcoRI 降解重组质粒,在凝胶电泳上看到两条带,它们的位置分别对应于pBR322线性DNA和pCRI 线性DNA。电镜观察到环状pCBI DNA 并测得其长度为5.77±0.30微米,折合分子量为(11.9±0.6)×10~6道尔顿。     

大肠杆菌葡萄糖异构酶基因在变铅青链霉菌中的克隆与表达

本文用穿梭质粒载体pSE-3,进行了大肠杆菌葡萄糖异构酶基因在变铅青链霉菌中的克隆与表达。把含有1.6kb葡萄糖异构酶基因的pX1200(4.3kb)质粒与pGEM-3(2.9kb)质粒分别用EcoRI酶解,T4DNA连接酶连接,转化E.Coli HB101(Xy1~-,Neo(?)),得到的重组质粒被命名为pX1203(7.2kb);将pX1203与穿梭质粒载体pSE-3分别用HindⅢ酶解,T_4DNA连接酶连接,转化E.Coli HB101,在含有新霉素的木糖培养基上筛选到转化重组体,其重组质粒被命名为pSE×100(10.6kb);把pSE×100转化变铅青链霉菌TK54的原生质体,在硫链丝菌肽(50μg/ml)和新霉素(50μg/ml)的平皿上得到了重组体。经质粒提取,酶切分析,再转化和葡萄糖异构酶活性测定,结果表明,大肠杆菌的葡萄糖异构酶基因确实已在链霉菌中克隆和表达。     

大豆脲酶基因片段的无性繁殖

纯化的大豆细胞总DNA及质粒pBR322DNA分别经限制性内切酶HindⅢ切割,并用T_4DNA连接酶连接,进行重组。将重组后的DNA转化Escherichia coli C600。用四环素、环丝氨酸富集法浓缩和筛选对氨基苄青霉素具有抗性而对四环素敏感的重组转化子(Ap~rTc(?))。以酚红的显色反应及以脲素为唯一氮源从Ap~rTc~(?)转化子中筛选具有脲酶活性的无性繁殖系,获得一株转化子E.coli C600(pSH120),并从中分离了重组质粒pSH 120 DNA,经凝胶电泳法测定其分子量为12.9×10~6道尔顿。用重组质粒pSH 120 DNA分别转化E.coil C600和E.coliHB101,均能再产生具有脲酶活性的Ap~rTc(?)重组转化子。     

人Leptin的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

用 RT- PCR自脂肪细胞 RNA扩增人瘦素 (leptin)基因的 c DNA片段 (约 50 0 bp)并克隆至克隆载体 p SK(+) ,获得重组质粒 p SK- OB,DNA序列分析显示获得的 Leptin基因和文献报道一致 .用限制酶 Eco R 和 Bam H 从 p SK- OB切下并插入原核表达载体 p BV2 2 0的相应限制酶位点 ,转化大肠杆菌 DH5α.转化菌株经 42℃诱导 ,SDS- PAGE检测和 Western印迹鉴定 ,获得高水平重组人瘦素的表达菌株 ,其表达量达菌体总蛋白的 30 %以上 .     

质粒和λ噬菌体DNA简便的分离纯化方法

用甲酯化白蛋白硅藻土(MAK)柱层析方法分离纯化的质粒pBR322,ColE_1,pSC101,pCRl 和λDNA,经EcoR_1限制性内切酶作用,琼脂糖凝胶电泳分析,抗药因子转化,结果表明这些材料可以用作DNA 重组体的载体和限制性内切酶的底物。     

HCVNS3基因片段酵母展示文库的构建和鉴定

 HCV NS3特异的 CD4+T细胞反应与 HCV感染的良性转归相关 .为了筛选其 CD4+T细胞表位 ,构建了 HCV NS3基因片段酵母展示文库 .首先 DNase 不完全酶切 HCV NS3基因产生长度为 1 0 0～ 30 0 bp的随机片段 ,然后在它们两端加上含限制性内切酶 Bam H 作用位点的接头 ,再以接头序列作引物进行 PCR扩增 .最后扩增产物用 Bam H 酶切后与 Bam H 线性化的穿梭载体 p YD1连接 ,转化大肠杆菌 (E.coli) DH5α,共得到 2× 1 0 6个转化子 .转化菌落的 PCR扩增结果表明 ,约 50 %转化子含插入片段 .随机选择 5个插入片段测序 ,然后与 DNA序列数据库中的序列比较 .结果显示它们分别与 HCV NS3序列有 96%～ 99%的同源性 .用从转化菌落中提取的质粒转化酵母 (S.cerevisiae)菌株 EBY1 0 0 ,得到含 2× 1 0 5个插入片段的 HCV NS3基因片段酵母展示文库 .半乳糖诱导的酵母细胞通过和 FITC标记的抗体结合 ,用 FACS可以在 2 0 %的细胞表面检测到融合蛋白的表达 .     

插入烟草叶绿体启动基因片段的重组质粒转化大肠杆菌和枯草杆菌感受态与原生质体的比较

大肠杆菌(E.coli)N100携带的pK01-26质粒插入烟草(Nicotiana tobacHm var.)叶绿体启动基因片段的重组质粒。该质粒以大肠杆菌HB101为受体可以再转化,转化频率为4.93×10^-6,以枯草杆菌168为受体不能实现转化。上述两种受体菌株的原生质体,经处理,再生细胞壁后,分别获得转化子。经原生质体转化,以大肠杆菌HB101为受体的转化频率为2.7×10^-4频率为2.6×10^-5。以H     

病毒ki-ras表达质粒的构建

用重组DNA技术构建了病毒ki-ras表达质粒,用Eco R Ⅰ和Bam H Ⅰ酶解pUC-9DNA,小牛肠碱性磷酸酶脱磷酸,病毒ki-ras编码基因来源于Hi-Hi-3质粒DNA的Sat Ⅱ和Eco R Ⅰ酶切的0.6kb片段,用连接酶和DNA聚合酶Klenow片段将两个片段连接,转化大肠杆菌JM103,免疫筛选表达质粒,从156个转化克隆中得到两株表达质粒,其中一株pKras83的p21蛋白表达量为细菌总蛋白量的10％。     

单纯疱疹病毒2型特异性DNA片段的克隆和鉴定

用核酸限制性内切酶BamHI对单纯疱疹病毒2型(HSV—2)的DNA进行酶解,回收位于基因组中的反向重复序列区的Bam HIG片段,然后将其克隆在载体质粒PUC 8的Bam HI切点上,进一步用核酸限制性内切酶Eco RI和KPNI对这一重组质粒联合酶解,移去EcoRI—KPNI小片段,经末端修饰后,将其连接得到新的重组质粒pRC102,它含有一小段HSV—2的DNA序列。以此质粒为探针,分别与HSV—1、HSV—2及细胞DNA进行斑点杂交;与HSV—1和HSV—2酶解后的DNA片段进行Southern转印系交。两组实验结果显示,pRC102质粒DNA只与HSV—2 DNA特异性杂交,其HSV—2的型特异性良好。     

谷氨酸棒状杆菌质粒pXZ 10145的限制酶图谱和嵌合质粒的组建

从谷氨酸棒状杆菌中已经分离到质粒pxzl0145,该质粒带有氯霉素抗性。通过电子显微镜和BamH I酵切后在1％琼脂糖凝胶电泳上测定pXZl0145质粒的大小为5．3kb。用Bam—HI、PstI、EcoRI、saII等限制酶进行酶切,并用BamH I+sa1 I、BamH I+Pst I、Pst I+sal I、EcoR I+Pst I、EcOR I+BamH I等双重酶切,得到pxzlol45限制性内切酶的图谱。证明BamH I和Pst I为单一酶切点。将pxzl0 145与pBR322利用BamH I切点连接得到一嵌台质粒pxz34。这一质粒能在大肠杆菌中复制,在大肠杆菌中表现有氨苄青霉素和氯霉素的抗性,但是抗氯霉素的能力大大降低,只抗2Y／ml。     

臭鼩高重复顺序DNA的核苷酸顺序分析及其与树鼩TSr(Bgl Ⅱ)-1顺序的比较

将臭鼩DAN经过Bam H Ⅰ酶切得到的高重复顺序DNA最小片段重组到质粒pAT153上,转化后得到了含有臭鼩BMS(Bam H Ⅰ)-1高重复顺序DNA片段的克隆。再把此片段重组到M_(13)mp19噬菌体DNA上。用末端终止法测得全部苷酸顺序为495个碱基对。对臭鼬BMS(Bam H Ⅰ)-1片段的结构特点进行了分析,并和树鼩TSr(BglⅡ)-1高重复顺序DNA进行了比较。为确定树鼩在分类学上的地位,提供了一定的分子遗传学证据。     

脂肪嗜热芽孢杆菌质粒pFD101的限制性内切酶图谱

从脂肪嗜热芽孢杆菌T525中抽提得到的隐蔽性质粒pFD101,经纯化后通过琼脂糖凝胶电泳和电镜观察,确证为cccDNA。经测定,pFD101的分子量为3.83×10~6道尔顿。具有限制酶HindⅢ切点1个、SalⅠ和HpaⅡ切点各2个,没有EcoRI、BamHI和PstⅠ切点。根据限制酶片段的分子量作出了pFD101的简单酶切图。     

带有启动子DNA的片段在枯草芽孢杆菌中的克隆

用限制性核酸内切酶EcoR1酶切枯草芽孢杆菌168染色体DNA和pPL603质粒DNA然后用T4DNA连接酶连接,转化枯草芽孢杆菌BR151感受态细胞。在每毫升含有10微克氯霉素的SBPY选择培养皿上筛选,得到61个抗氯霉素的转化子。经快速琼脂糖凝胶电泳检测,从61个抗性转化子中得到49个比原载体pPL603质粒分子量大,并带有启动子DNA片段的重组质粒。测定了所有重组质粒表达的不同抗性水平,分析了部分质粒的一些特性,对抗性水平较高的7个重组质粒的分子量进行了测定,并用pBP61重组质粒DNA进行了第二次转化和酶切电泳分析。     

水稻叶绿体基因文库的构建和精细限制图谱的制作

水稻幼叶在加有高浓度抗坏血酸的缓冲液中匀浆,以获得完整的叶绿体,从中分离到ctDNA得率高达100μg/100g叶,纯度足以用于限制性核酸内切酶分析。ctDNA经Mbo I部分酶解得到的片段克隆到载体pcos 2 EMBL的Bam HI位点,重组DNA经体外包装后感染宿主菌,筛选表型Tc~5Km~R的重组子,通过计数克隆有效率达5×10~4重组菌落/1微克插入DNA。用λ-末端酶对重组环状双链DNA在cos位点切成线性分子,产生两个(ON-L及ON-R)可供标记和杂交的末端,线性Cosmid DNA经限制酶部分消化,凝胶电泳分离,干燥凝胶放射自显影,得到了6种限制性核酸内切酶的限制图谱。水稻ctDNA全长为129.5kb,在ctDNA上Pvu Ⅱ、Sal Ⅰ、Pst Ⅰ、Hind Ⅲ、Eco RI及Bam HI的切点分别为11、12、17、37、67和44个,1R A和B为21.7kb,LSC为73.7kb,SSC为12.4kb。