辛德毕斯病毒复制子载体系统的构建

To construct vector system of XJ-160 virus,a Sindbis virus isolated in China,recombinant vector pBRepXJ together with its helper plasmid pBR-H were derived from XJ-160 viral infectious clone pBR-XJ160 by overlap-PCR.To quantitatively and qualitatively verify the function of the replicon system,recombinant plasmids pSinRep-EGFP,pBRepXJ-EGFP,pSinRep-R and pBRepXJ-R were constructed by cloning report genes of enhanced green fluorescent protein(EGFP) or Renilla luciferase(R.luc) into pBRepXJ or pSinRep5,a comme...     

XJ-160病毒复制子型表达载体的构建

XJ-160病毒是我国首次分离的辛德毕斯病毒,全基因组测序已经完成.本文利用该病毒全基因序列首先构建了全基因组cDNA克隆质粒,在此基础上,利用基因重组技术将病毒结构基因序列替换为含有多个单酶切位点的序列,得到复制子表达载体质粒pRepxj160.为验证载体的功能,将报告基因绿色荧光蛋白(EGFP)和β-半乳糖苷酶基因(lacZ)分别插入到载体的多克隆位点,得到两个表达质粒;经体外转录获得的转录体RNA转染BHK-21细胞后14h,可检测到报告基因的表达.结果表明我们构建的XJ-160病毒复制子型表达载体具有自主复制功能,可以表达异源基因.本研究为进一步开发具有我国自主知识产权的甲病毒载体奠定了基础.     

XJ-160病毒为辛德毕斯病毒新亚型

ＸＪ－１６０病毒是我国首次分离的辛德毕斯病毒,在对其全基因组核苷酸序列测定的基础上,对病毒基因组序列、病毒同源性和病毒系统进化等进行了较为详细的分析,结果表明：ＸＪ－１６０病毒具有典型的甲病毒属德毕斯病毒的序列特征。该病毒ｎｓｐ３蛋白基因中１１处制失及两处插入（４５１７￣５４８５）,涉及９０年核苷酸。核苷酸序列的系统进化分析表明,ＸＪ－１６０病毒属于辛德毕斯病毒欧洲／非洲亚组。病毒全基因组核苷酸序     

XJ—160病毒复制子型表达载体的构建

D-160病毒是我国首次分离的辛德毕斯病毒,全基因组测序已经完成。本文利用该病毒全基因序列首先构建了全基因组cDNA克隆质粒,在此基础上,利用基因重组技术将病毒结构基因序列替换为含有多个单酶切位点的序列,得到复制子表达载体质粒pRepxjl60。为验证载体的功能,将报告基因绿色荧光蛋白(EGFP)和β-半乳糖苷酶基因(lacZ)分别插入到载体的多克隆位点,得到两个表达质粒;经体外转录获得的转录体RNA转染BHK-21细胞后14h,可检测到报告基因的表达。结果表明我们构建的XJ-160病毒复制子型表达载体具有自主复制功能,可以表达异源基因。本研究为进一步开发具有我国自主知识产权的甲病毒载体奠定了基础。     

中国首次分离的辛德毕斯病毒XJ-160病毒株感染性全基因组cDNA克隆的构建与分析

报告了中国首次分离的辛德毕斯病毒XJ-160株的感染性全基因组cDNA克隆的构建与鉴定。利用RT—PCR方法获得覆盖病毒全长基因组的cDNA片段,以低拷贝质粒pBR322作为骨架,将基因组cDNA置于SP6RNA聚合酶启动子之后,基因组3’末端带有35个连续的A,通过DNA重组技术组装成病毒基因组全长cDNA克隆。该克隆可在大肠杆菌DH5a中稳定扩增。经体外转录,RNA转录体转染BHK-21细胞,细胞发生病变,恢复病毒滴度达到10^7～10^8PFU／ml。全基因组cDNA克隆构建过程中引入的沉默突变(8453位核苷酸由C变为T)产生XbaⅠ酶切位点作为遗传标记,在子代恢复病毒的基因组中稳定存在。从细胞病变的特征、BHK-21细胞的空斑形态、病毒的抗原性、病毒在细胞中的生长动力学特征以及对乳鼠的致病性等方面比较,恢复病毒和亲本病毒XJ-160没有显著区别,提示获得了具有感染性的XJ-160病毒全长cDNA克隆。该病毒感染性全基因组cDNA克隆可以作为反向遗传学系统,为进一步研究病毒复制和致病机制,以及开发相应的载体表达系统提供分子生物学工具。     

辛德毕斯病毒载体的研究进展

辛德毕斯病毒（Sindbis virus,SIN）属于披膜病毒科（Togaviridae）甲病毒属（Alphavirus）,全世界各大洲均有分布,是由吸血的蚊虫等传播的虫媒病毒,可引起“辛德毕斯综合热”,表现为发热、倦怠、头痛、关节痛和皮疹等,可自愈。无论从病毒形态、结构、病毒复制和翻译等功能辛德毕斯病毒均集中体现了动物病毒的特征,使其成为研究动物病毒基本规律的模型病毒,因此对该病毒的研究成为热点。 　　自1983年Brenard Moss首次将痘苗病毒改造为痘苗病毒载体以来［1］,病毒载体的研究一直是病毒学中一个十分活跃的领域。早期的人们主要把精力集中在DNA病毒载体上,如痘苗病毒、腺病毒、疱疹病毒等［1］。     

昆津病毒复制子——一种新型病毒载体

病毒复制子 (Replicon) 是指来源于病毒基因组的能够自主复制的RNA分子,保留了病毒非结构蛋白基因,而结构蛋白基因缺失或由外源基因替代。昆津病毒 (Kunjun virus) 为黄病毒科黄病毒属成员,其复制子具有表达效率高、细胞毒性低、遗传稳定等特点,在病毒基因组复制调控机制、外源蛋白表达、新型疫苗和基因治疗等领域得到了广泛应用。以下就昆津病毒复制子系统的构建、特性及应用方面的研究进展作一综述。     

基于DNA和RNA的双功能Semliki森林病毒复制子载体的构建

以semliki森林病毒衍生的复制子载体pSFV1和辅助载体pSFV-helper2为骨架, 用CMV IE和T7启动子替换SP6启动子并在3′ UTR下游插入BGH转录终止子,构建了基于DNA和RNA的复制子表达载体pSMCTA和辅助载体pSHCTA。在DNA和RNA二种递送方式上证实该表达载体可高水平表达外源基因,与辅助载体共转染可制备具有感染能力并能表达外源基因的重组病毒颗粒。构建的基于DNA和RNA的双功能复制子载体显著地提高SFV载体应用范围,在体外可用于高水平表达外源基因及大规模制备重组病毒颗粒,在体内也可用于研制复制子疫苗和基因治疗载体。     

基于Semliki森林病毒复制子的新型RNAi质粒载体的构建

目的:以semliki森林病毒复制子为基础,构建一类可迅速高效表达shRNA的新型RNAi载体。方法:以Semliki森林病毒衍生的复制子载体pSFV1为骨架,用CMV IE启动子替换SP6启动子并在3′-UTR下游插入SV40 polyA转录终止子,在原26S亚基因组启动子后插入带有相应改良多克隆位点的shRNA表达元件,同时加入抗新霉素选择复合体,并去掉3′-UTR的重复序列。所获载体用于沉默EGFP基因,通过体外细胞转染、病毒颗粒制备、荧光显微镜观察、RT-PCR分析等初步验证、评估其效果。结果:构建了基于Semliki森林病毒复制子的新型RNAi质粒载体pSFV-RNAi Ready。经体外实验初步证实,该载体直接转染细胞,或与辅助载体共转染,制备成具有感染能力的重组病毒颗粒后使用,均可高水平表达shRNA,沉默目的基因。其中使用病毒颗粒抑抑效率可高达90%以上。结论:该载体的成功构建,可望显著拓宽SFV载体的应用范围,丰富RNAi实施手段,并用于相关科学研究及基因药物技术开发。     

辛德毕斯病毒非结构蛋白nsP2在细胞内的分布

应用免疫电镜技术,直观地显示出辛德毕斯病毒的nsP2蛋白存在于细胞核中以及它在核内的分布.将含有nsP2蛋白的一段SbV的cDNA转染细胞,结果表明,单独表达的nsP2仍可进入细胞核中.     

一种基于塞姆利基森林病毒复制子的新型复制子载体

RNA复制子是能自主复制的病毒RNA。基于RNA复制子的表达载体和基因疫苗比常规真核表达载体和DNA疫苗具有更大的优越性。以塞姆利基森林病毒RNA复制子衍生的真核表达载体pSFV1为骨架 ,插入CMV立即早期启动子和SV40晚期Poly(A)信号 ,构建了一种完全基于DNA的复制型表达载体pSFV1CS ,将增强型绿色荧光蛋白基因EGFP插入其中 ,构建了重组质粒pSFV1CS EGFP ,通过转染 2 93T细胞 ,证实外源基因能在其中高效表达。该载体可用于表达真核蛋白和构建复制子载体疫苗。     

基于甲病毒复制子载体的猪瘟DNA疫苗的免疫效力评价

此前已构建了基于Semliki Forest病毒（Semliki Forest virus,SFV）复制子载体的表达猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）E2基因的新型猪瘟DNA疫苗pFV1CS-E2,通过动物试验证实,该疫苗以600μg/头的剂量免疫3次,免疫猪能抵抗致死剂量猪瘟强毒的攻击。为进一步评价该疫苗在较低的免疫剂量和较少的免疫次数情况下的免疫效力,将DNA疫苗pSFV1CS-E2和空载体pSFV1CS按100μg/头的剂量,接种猪只2次,然后用致死剂量的猪瘟强毒石门株进行攻击。结果表明,pSFV1CS-E2免疫组（n=5）所有免疫猪在加强免疫后均产生了猪瘟特异性中和抗体,攻毒后所有猪只抗体迅速升高,除了短期体温升高外,未出现任何其它临床症状,部分猪出现短期轻微病毒血症,个别猪的部分脏器出现轻微病变;而空载体免疫组（n=3）猪只在攻毒前一直没有检出特异性抗体,攻毒后全都出现典型的猪瘟临床症状和严重的病毒血症,有2头猪分别于攻毒后第10和11d死亡,剖检时可见典型猪瘟病理变化。结果表明,基于甲病毒复制子载体的猪瘟DNA疫苗有望成为具有开发价值的猪瘟标记疫苗。     

基于甲病毒复制子载体的猪瘟DNA疫苗的免疫效力评价

此前已构建了基于SemlikiForest病毒(SemlikiForestvirus,SFV)复制子载体的表达猪瘟病毒(classicalswinefevervirus,CSFV)E2基因的新型猪瘟DNA疫苗pFV1CS-E2,通过动物试验证实,该疫苗以600μg/头的剂量免疫3次,免疫猪能抵抗致死剂量猪瘟强毒的攻击。为进一步评价该疫苗在较低的免疫剂量和较少的免疫次数情况下的免疫效力,将DNA疫苗pSFV1CS-E2和空载体pSFV1CS按100μg/头的剂量,接种猪只2次,然后用致死剂量的猪瘟强毒石门株进行攻击。结果表明,pSFV1CS-E2免疫组(n=5)所有免疫猪在加强免疫后均产生了猪瘟特异性中和抗体,攻毒后所有猪只抗体迅速升高,除了短期体温升高外,未出现任何其它临床症状,部分猪出现短期轻微病毒血症,个别猪的部分脏器出现轻微病变;而空载体免疫组(n=3)猪只在攻毒前一直没有检出特异性抗体,攻毒后全都出现典型的猪瘟临床症状和严重的病毒血症,有2头猪分别于攻毒后第10和11d死亡,剖检时可见典型猪瘟病理变化。结果表明,基于甲病毒复制子载体的猪瘟DNA疫苗有望成为具有开发价值的猪瘟标记疫苗。     

日本脑炎病毒(JEV)复制子表达载体的构建及其鉴定

在以往构建的JEV疫苗株SA14-14-2感染性克隆pBRkpn-JTF的基础上,构建了去除JEV结构区域基因(prM基因和E基因),保留非结构区域基因的复制子表达载体pCTCJEV、pCTMJEV,转染BHK-21细胞后,通过反转录PCR(RT-PCR)和间接免疫荧光实验(IFA)检测该载体的自主复制能力和蛋白表达情况,结果证实该载体在BHK-21细胞中能够自主复制并且表达非结构蛋白。进一步在该载体中插入报告基因EGFP,检测外源蛋白的表达情况,结果显示在转染复制子载体的24h后,荧光显微镜下能够看见绿色荧光蛋白的表达,阳性信号持续增强,能够维持10d左右,证实了构建的复制子载体pCTCJEV能够有效地表达外源蛋白,这为进一步建立以乙脑病毒复制子为基础的疫苗载体系统打下基础。     

日本脑炎病毒C蛋白对其复制子载体自主复制活性的影响

为了研制具有高效自主复制能力的日本脑炎病毒 (JEV) 复制子载体,验证其作为新型复制子疫苗载体的可能性。以保留全长核心蛋白C基因的JEV复制子载体pCTCJEV为基础,通过PCR的方法减短C蛋白的部分基因序列,分别保留C23和C68位氨基酸,以Lac Z基因作为报告基因,构建了C基因长短不同的JEV复制子载体pCMW-2M-1LACZ、pCMW-2M-3LACZ。将复制子载体转染表达JEV结构蛋白的细胞系CME-4,通过Lac Z的表达检测JEV复制子载体表达外源蛋白的能力,反映了JEV的系列复制子载体的自主复制能力。结果保留C基因全长,C68、C23的复制子载体表达外源蛋白的能力相当,以上结果说明仅仅保留C蛋白的69个核苷酸即可保留JEV复制子载体的自主复制能力,为进一步优化JEV复制子载体,将该载体开发研制成为高效表达外源蛋白的疫苗载体提供了依据。     

我国首次分离的辛德毕斯病毒(XJ-160病毒株)全基因组核苷酸序列测定

对我国首次分离的辛德毕斯病毒ＸＪ－１６０病毒株全基因组核苷酸序列进行测定,阐明该病毒基因组与国外株的差异,了解其分子致病机理。测序结果显示,ＸＪ－１６０病毒全基因组除５’末帽子结构和３’末多聚腺苷酸尾外共１１６２６个核苷酸,编码３７３１个氨基酸。非结构基因的编码区长７４６４核苷酸（６０ｎｔ￣７５２３ｎｔ）,编码２４８６氨基酸,翻译成四种非结构蛋白（ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ,ｎｓｐ     

猪瘟甲病毒复制子载体DNA疫苗与重组腺病毒活载体疫苗联合免疫效果评价

本实验室先前分别将构建的猪瘟病毒E2基因重组腺病毒疫苗(rAdV-E2)和猪瘟甲病毒复制子载体DNA疫苗(pSFV1CS-E2)在猪体上进行了免疫效力评价,结果显示,rAdV-E2免疫组所有猪虽然在加强免疫后产生了比较高的猪瘟特异性中和抗体,但攻毒后个别猪表现短期体温升高和轻微病变;而pSFV1CS-E2免疫组猪只虽然在攻毒后得到了保护,但产生的抗体水平较低。为了增强猪瘟甲病毒复制子载体疫苗和猪瘟重组腺病毒活载体疫苗的免疫效果,本研究应用了复制子载体DNA疫苗初免和重组腺病毒疫苗加强免疫的初免-加强(Prime-boost)免疫策略,并在猪体上进行了评价。结果显示,所有免疫猪均产生了高水平的猪瘟特异性的中和抗体,用猪瘟强毒攻击后,pSFV1CS-E2初免组所有猪(n=5)均没有出现任何猪瘟的临床症状和病理变化,攻毒后在猪血液中也没有检测到猪瘟病毒RNA,而重组腺病毒初免组(n=5)有一头猪出现短期发热和病毒血症及轻微病理变化。这表明初免-加强免疫策略能显著提高重组疫苗的免疫效力。     

基于DNA的Semliki森林病毒复制子载体体内外高水平表达外源基因

基于DNA的复制子载体显著地提高了复制子载体的应用范围,在体外可用于高水平表达外源基因,大规模制备重组病毒颗粒,在体内可用于复制子疫苗和基因治疗载体研究.将复制子RNA的cDNA置于RNA聚合酶Ⅱ启动子和转录终止子控制下时,基于RNA的复制子载体可转变为基于DNA的复制子载体.当DNA载体转染细胞后,第一阶段,RNA聚合酶Ⅱ启动子在核内起始合成RNA,经过加工和修饰后运输到细胞质中,相当于复制子RNA,第二阶段,该RNA自我复制及表达外源基因,相当于病毒RNA复制循环.在成功地构建了基于DNA和RNA的双功能复制子表达载体pSCTA和辅助载体pSHCTA的基础上,为了获得高效的基于DNA的复制子载体,对其进行改进而构建了共4种不同的基于DNA的semliki森林病毒复制子,通过对表达载体和相应的辅助载体表达报告基因及对制备重组病毒颗粒的能力进行比较,获得了复制能力提高的复制子载体pSCAR和pSHCAR.该表达载体pSCAR可高水平表达外源基因,与辅助载体pSHCAR共转染可制备高滴度的重组病毒颗粒,并且也能表达抗原基因.另外,报告基因在DNA复制子载体注射的小鼠体内得到了高水平表达,并且DNA免疫小鼠后也诱导产生高滴度特异性抗体以及细胞免疫反应.结果表明,经过改造SFV复制子载体,获得了高效的基于DNA的SFV复制子载体.该复制子载体增强了原复制子载体应用能力,并有潜力作为复制子疫苗和基因治疗载体.     

辛德毕斯病毒E2包膜蛋白可溶性表达条件的优化

目的:通过优化表达条件,提高辛德毕斯病毒E2包膜蛋白胞外区的可溶性表达量。方法:构建含E2基因胞外区的重组表达质粒pGEX-6p-1-E2,筛选合适宿主菌和诱导温度,并构建5种分子伴侣共表达系统(即pG-KJE8、 pGro7、pKJE7、 pG-Tf2和pTf16 5种分子伴侣质粒分别与重组表达质粒pGEX-6p-1-E2共表达),筛选最适分子伴侣质粒。结果:(1)E2蛋白的表达量在E.coli BL21、BL21 (DE3) pLysS、Rosetta (DE3)及Origami B (DE3) 4种表达菌中没有明显差别;(2)16℃诱导时E2蛋白在上清中可溶性表达量最高;(3)分子伴侣质粒pG-Tf2使目的蛋白的可溶性表达量提高了15.7%,作用最为显著。结论:通过优化表达条件及使用分子伴侣共表达系统提高了E2蛋白的可溶性表达,为进一步E2蛋白的相关研究奠定了基础。