植物中合成蔗糖和淀粉的关键酶Ⅰ.腺苷二磷酸—葡萄糖焦磷酸化酶

植物中合成蔗糖和淀粉的关键酶Ⅰ．腺苷二磷酸┐葡萄糖焦磷酸化酶高振宇黄大年（中国水稻研究所,杭州３１０００６）关键词ＡＧＰＡＤＰＧ３－ＰＧＡ变构调节基因调控自本世纪８０年代初提出腺苷二磷酸（ＡＤＰ）－葡萄糖焦磷酸化酶（ＡＧＰ）是淀粉合成的中心酶以来,该...     

鲜食糯玉米采后糖代谢相关酶活性变化

鲜食糯玉米采后腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADPGPPase）、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UDPGPPase）、束缚态淀粉合成酶（GBSS）、淀粉脱分支酶（DBE）等活性均呈现单峰曲线变化,第1～2天出现峰值然后略有下降;可溶性淀粉合成酶（SSS）活性呈较大幅度上升趋势,活性远高于采收初期;淀粉分支酶（SBE）在第3天出现极高峰值。与20℃贮藏温度相比,采后0℃低温贮藏可增强UDPGPPase活性,促进蔗糖降解;降低SSS和GBSS活性,延缓淀粉合成进程;抑制SBE活性,增强DBE活性,促进直链淀粉生成。     

水稻ADP—葡萄糖焦磷酸化酶的cDNA基因克隆和结构分析

用ＰＣＲ技术从我国水稻品种“中花１０ 号”（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｖａｒ． ｊａｐｏｎｉｃａ ｃｖ． Ｚｈｏｎｇｈｕａ １０）的未成熟种子中克隆到ＡＤＰ－葡萄糖焦磷酸化酶基因,进行了全序列分析,并与国外已报道的同类基因进行了核苷酸及推导氨基酸序列的同源性比较。结果表明,作者克隆的ＡＤＰ－葡萄糖焦磷酸化酶基因全长１４６１ ｂｐ,编码１个由４８３ 个氨基酸组成的多肽,与国外基因的核苷酸和推导氨基酸同源率分别为９９．６％ 和９９．７％ 。此外,还对该基因进行了结构及进化分析。     

不同类型土壤上种植的小麦籽粒中与淀粉合成相关的酶活性变化

测定池栽条件下灰潮土、水稻土、砂姜黑土上种植的强筋小麦‘郑麦9023’籽粒灌浆过程中腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPP）、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UGPP）、可溶性淀粉合成酶（SSS）、淀粉粒结合淀粉合成酶（GBSS）、淀粉分支酶（SBE）5个与淀粉合成有关的酶活性变化的结果表明,不同类型土壤上种植的小麦籽粒中AGPP、UGPP、SSS、GBSS、SBE活性均呈单峰曲线变化,花后18d,AGPP、UGPP、SSS和SBE活性达到峰值,而GBSS则在花后24d达到峰值。AGPP、SSS、SBE活性峰值表现为灰潮土〉水稻土〉砂姜黑土,UGPP峰值表现为灰潮土〉砂姜黑土〉水稻土,GBSS峰值则表现为水稻土〉灰潮土〉砂姜黑土。     

Cd2+对三角褐指藻生长及尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因表达调控的影响

为了探究Cd2+对三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)生长及尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase,UGPase)基因表达调控的影响,研究以不同浓度Cd2+处理三角褐指藻,测定其生长、叶绿素荧光参数、UGP基因转录水平、UGPase活性和金藻昆...     

反义4CL与UGPase双价基因在烟草中的转化及表达分析

构建了携带紫穗槐尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UDP-glucose pyrophosphorylase,UGPase）基因和4-香豆酸：辅酶A连接酶（4-coumarate：coenzyme Aligase,4CL）反义基因的双价基因植物表达载体,用热激法转化至根癌农杆菌LBA4404中,并用制备的农杆菌工程菌进行了烟草转化。PCR及Southern杂交结果证实,双价基因已成功整合到烟草基因组中。综纤维素和硫酸木质素含量测定结果显示,转基因烟草纤维素含量增加,木质素含量减少,表明双价基因能够有效表达。     

植物对环境污染物的解毒

本文主要介绍植物对几种有机物和重金属的解毒作用。１　对有机化合物的解毒对一些有机化合物的污染,植物的主要解毒反应是形成糖苷等轭合物,使外来物质钝化,赋于水溶性,使其进入植物的液泡。有些有机物可直接形成轭合物,而另外一些必须先经化学改性后才能形成轭合物。１．１　对酚类的解毒　酚类化合物是一种常见的有机污染物,无论对动物、微生物都是剧毒的,但高等植物能很快解除其毒性。大部分和尿苷二磷酸葡萄糖（ＵＤＰＧ）反应形成糖苷。一般图１形成含有一个葡萄糖的熊果苷（图１）。在小麦的胚中可形成２、３葡萄糖苷。含有相…     

培养骨髓基质细胞的尿嘧啶核苷二磷酸半乳糖-4-表异构酶活性

本实验用液体静置法体外培养小鼠骨髓基质细胞。用细胞化学法观察处于不同分化阶段基质细胞中的尿嘧啶核苷二磷酸半乳糖－－４－表异构酶（Ｕｒｉｄｉｎｅｄｉｐｈｏｓｐｈｏｇａｌａｃｔｏｓｅ－４－ｅｐｉｍｅｒａｓｅ,ＵＤＰＧａｌ,ＥＣ５．１．３．ａ）活性。结果在各类骨髓基质细胞中均可见到很强的酶反应。在由原始网状细胞向成熟星状细胞分化过程中,酶活性逐渐增强。随着培养时间和延长（培养５、７、１０天）,星状细胞和成纤维细胞中酶反应的阳性率和阳性度逐渐增高。这证明在体外培养骨髓基质细胞中由ＵＤＰＧａｌ催化的代谢非常活跃     

尿苷二磷酸糖固定化酶合成法研究

利用生物酶进行体外催化反应合成不同种类的尿苷二磷酸糖（uridine diphosphate sugar,UDP-糖）,生物酶的重复利用率较低。为提高尿苷二磷酸糖的合成效率及增加产物种类,以镍螯合聚丙烯酸酯树脂为载体,对带有HIS标签的N-乙酰己糖胺激酶（N-acetylhexosamine kinase,NahK）和尿苷转移酶（uridine transferase,GlmU）进行固定化。以固定化NahK和固定化GlmU为催化酶,不同单糖作为底物,研究尿苷二磷酸糖的一锅法合成情况。利用Q柱对产物进行纯化,通过高效液相色谱法、质谱法、核磁共振氢谱法对反应产物进行检测。确定了镍螯合聚丙烯酸酯树脂对游离NahK和GlmU的实际载量分别为10和20 mg·g^-1。固定化酶量的最优配比为5.5 g固定化NahK和2.5 g固定化GlmU。固定化酶的最适pH和温度分别为8.0和35℃,且能在重复反应中稳定反应5个批次。葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖和甘露糖可以参与一锅法反应,生成UDP-糖的相对分子质量分别为566、607、566,而葡萄糖醛酸、半乳糖和果糖在该体系下不能合成相应的UDP-糖。基于固定化酶技术,一锅法可合成UDP-葡萄糖、UDP-N-乙酰氨基葡萄糖、UDP-甘露糖。     

慈菇（Sagittaria safittifolia）α－半乳糖苷酶的纯化与性质

以对硝基苯糖苷基为底物,测定了慈菇的１２种糖苷酶,其中α－甘露糖苷酶、α－和β－半乳糖苷酶活力较高;经硫酸铵分级沉淀,ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１５０分子筛层析,ＣｏｎＡＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析,ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－６Ｂ离子交换层析,从慈菇抽提液纯化了α－半乳糖苷酶。纯化酶的比活提高１０７２倍,活力回收１５．６％,在圆盘聚丙烯酰胺凝胶电泳和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上均显示１条蛋白质带,在α－半乳糖苷酶浓度为１５０ｍＵ／ｍｌ的溶液中测不到其他糖苷酶的活力。慈菇α－半乳糖苷酶的分子量用ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００凝胶过滤柱测定或在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上测定均为６０ｋＤ,酶反应的最适ｐＨ在５．８附近,最适温度为６０℃。该酶分解对硝基苯基－α－半乳糖苷的Ｋ＿ｍ值为３．７×１０￣（－４）ｍｏｌ／Ｌ,Ｖ＿ｍ值为２．１×１０￣（－４）ｍｏｌ／Ｌ。银离子、汞离子显著抑制酶活力,Ｄ－半乳糖和密二糖均竞争性地抑制该酶水解对硝基苯基α－Ｄ－半乳糖苷的活力,根据Ｄｉｘｏｎ作图求得其Ｋ＿ｉ值分别为０．９２×１０￣（－３）ｍｏｌ／Ｌ和１．９８×１０￣（－３）ｍｏｌ／Ｌ。２－脱氧－Ｄ－半乳糖和Ｌ－岩藻糖为酶活力的非竞争性抑制剂。化学修饰     

过量表达OsUgp2基因提高紫芝多糖含量

尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UDP-glucose pyrophosphorylase,UGPase）是多糖生物合成过程中重要的酶,水稻基因组中存在两个UGPase同源基因分别命名为OsUgp1和OsUgp2。构建了由构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子驱动OsUgp2表达的真菌过量表达载体,并通过农杆菌介导法将OsUgp2基因转入紫芝中,获得了潮霉素抗性的转化菌株。PCR和Southern杂交结果显示OsUgp2基因成功整合到受体紫芝基因组中。半定量RT-PCR检测结果显示外源基因OsUgp2在紫芝转     

休眠期间油桃花芽碳水化合物代谢及其相关基因的表达变化

以十年生大田和三年生盆栽‘曙光’油桃花芽为材料,分别测定了其休眠期碳水化合物含量、糖代谢相关基因的季节性表达及低温处理下相关基因的表达变化,旨在探讨碳水化合物及低温与休眠的关系。结果表明：休眠期间可溶性糖（主要是蔗糖）含量逐渐增加,淀粉含量则呈相反趋势。糖代谢相关基因表达明显不同：腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因口GPase）无明显变化;组氨酸H3基因（HisH3）和己糖激酶I基因（胱,）在进入内休眠前有明显上升,蔗糖合酶基因（SuSy）则与之相反;尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UGPase）表达总体上呈上调趋势,在进入内休眠后稍有下调。表明进入内休眠后,依赖HKl的糖信号转导途径起重要作用。在4℃处理后,与细胞分裂有关的基因HisH3含量急剧升高,而后下降,说明细胞分裂的减少并不是休眠期间抑制生长的原因;UGPase表现出与内休眠期一致的变化趋势,说明对低温有一定的适应性。     

胃癌癌旁肠化上皮酶组织化学研究

本文应用酶组化方法对６０例胃癌癌旁粘膜中４７例肠化上皮（７８．３％）的破性磷酸酶（ＡＬＰ）、酸性磷酸酶（ＡＣＰ）、胞嘧啶单核苷酸酶（ＣＭＰ）、葡萄糖－６－磷酸酶（Ｇ－６－ｐａｓｅ）、焦磷酸硫胺素酶（ＴＰＰａｓｅ）、５－核苷酸酶（ＳＮａｓｅ）、三磷酸腺苷酶（Ｍｇ２＋－ＡＴＰａｓｅ,Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ）和细胞色素氧化酶（ＣＣＯ）等九种细胞器标志酶进行了定位观察。结果发现肠化上皮吸收细胞上述酶活性均较强,且分布具有极性,杯状细胞酶反应较弱,主要位于细胞基底部。癌旁粘膜肠化阳性率为７８．３％,其中ＡＬＰ阳性的酶完全型肠化和ＡＬＰ阴性的酶不完全型肠化分别占５３．２％,４６．８％,两者出现率相近。酶完全型肠化ＡＬＰ阳性率在胃分化型癌及未分化型癌瘤旁分别占６９．２％和３３．３％。ＡＬＰ阳性率在胃分化型及未分化型癌组织内分别为３５．５％和０％。提示肠化上皮具有与肠上皮相似的代谢特征,酶完全型肠化和酶不完全型肠化可能是肠化的二种不同的形式,在致癌环境下,二者都有可能转变成癌,其中酶完全型肠化与分化型癌的关系较为密切。     

来源于蓝藻、铜绿微囊藻的尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因的克隆和鉴定

以已知的尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因的保守区为基础,自行设计一对简并引物,该对引物从形成水华的蓝藻（Synechocystis PCC6803)铜绿微囊藻FACHB 905株(Microcystis aeruginosa FACHB 905)的基因组DNA中扩增到一个476bp的DNA片段。通过TAIL-PCR和连接介导的PCR两种方法分离该片段的侧翼序列,最后得到大小约2．5kb的DNA片段。序列分析揭示其中有一个编码462个氨基酸的开放阅读框,我们将此开放阅读框对应的蛋白命名为Mud。该Mud蛋白的氨基酸序列与蓝藻(73％相同,87％相似)和细菌(Bacillus subtilis)(51％相同,67％相似)的尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶氨基酸序列表现高度的同源性。将该mud基因克隆于p-GEX-4T-1融合表达载体并在大肠杆菌中表达GST—Mud融合蛋白,经过酶活力测定发现,GST—Mud蛋白具有一定的尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶活性。用抗GST-Mud蛋白的多抗对Maeruginosa FACHB 905的胞质蛋白组分进行Western印迹分析,结果显示一条分子量大小约49kD的专一条带,这个分子量与从基因推断出的蛋白分子量大小基本一致。综上所述,我们认为从微囊藻克隆到的Mud蛋白基因是尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因,该酶在其他生物如植物和细菌中参与多糖合成,是多糖合成的关键酶之一,而在藻类中对尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶开展研究却是首次报道。     

化学修饰单克隆抗体模拟谷胱甘肽过氧化物酶

化学修饰具有底物谷胱甘肽（ＧＳＨ）结合部位的单克隆抗体（４Ａ４）,使其结合部位上的丝氨酸（Ｓｅｒ）转变成谷胱甘肽过氧化物酶（ＧＰＸ）的催化基团硒代半胱氨酸（Ｓｅ－Ｃｙｓ）,因而产生高活力的含硒抗体酶（Ｓｅ－ａｂｚｙｍｅ）．突变的４Ａ４（ｍ４Ａ４）的ＧＰＸ活力达到了天然酶活力的１９％,并对ｍ４Ａ４的酶学性质和动力学性质进行了研究;硒代谷胱甘肽（ＧＳｅＨ）连到４Ａ４结合部位,其ＧＰＸ活力由３．８６Ｕ／μｍｏｌ提高到５９８．９Ｕ／μｍｏｌ用黄嘌呤氧化酶／次黄嘌呤为中心的心肌线粒体自由基损伤模型证明Ｓｅ－ａｂｚｙｍｅ（ｍ４Ａ４）可减轻活性氧对线粒体的损伤。     

蔗糖酶和GOD的共固定化研究

本文研究了用吸附交联技术共固定化蔗糖酶和葡萄糖氧化酶（ＧＯＤ）的方法,考查了共固定化酶的动力学性质。试验结果表明：与溶液酶相比较,固定化蔗糖酶和ＧＯＤ的响应滞迟期分别为３分钟和２分钟,４态响应时间增加６分钟和４分钟,Ｋｍ值增大,ｐＨ─活力曲线变宽,最适ｐＨ值分别增大０．７和０．６４,最适温度则降低７．３℃和１６℃。以活性氧化铝作载体,戊二醛作交联剂制备的共固定化蔗糖酶和ＧＯＤ,其蛋白质固定化率为９２．９％,分解葡萄糖的总速度为４４１．６ＩＵ,当蔗糖浓度在０．２％以内时其反应速度与蔗糖浓度呈正相关（ｒ＝０．９９６）,使用半衰期１６２３次,在４℃下保存１２０天活力残存为８３．７％。     

反义4CL与UGPase双价基因在烟草中的转化及表达分析

构建了携带紫穗槐尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase, UGPase)基因和4-香豆酸: 辅酶A连接酶(4-coumarate: coenzyme A ligase, 4CL)反义基因的双价基因植物表达载体, 用热激法转化至根癌农杆菌LBA4404中, 并用制备的农杆菌工程菌进行了烟草转化。PCR及Southern 杂交结果证实, 双价基因已成功整合到烟草基因组中。综纤维素和硫酸木质素含量测定结果显示, 转基因烟草纤维素含量增加, 木质素含量减少,表明双价基因能够有效表达。     

盐生杜氏藻甘油-3-磷酸脱氢酶的分离纯化及其特性的研究

利用ＰＥＧ分级,ＤＥＡＥ离子交换层析,ＢｌｕｅＳｅｐｈａｒｏｓｅ拟亲和层析,ＭｏｎｏＱ离子交换层析等手段,分离纯化盐生杜氏藻（Ｄｕｎａｌｉｅｌａｓａｌｉｎａ（Ｄｕｎａｌ）Ｔｅｏｄ．）甘油三磷酸（Ｇ３Ｐ）脱氢酶（ＥＣ１．１．１．８）,得到比活为１２．６Ｕ／ｍｇ的电泳纯的酶,并对此酶的生化特性进行了研究。４％～２０％非变性聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳测得全酶分子量约为２７０ｋＤ,ＳＤＳＰＡＧＥ表明该酶只有一种分子量约为６５ｋＤ的亚基,据此推测该酶应为同四聚体。酶催化磷酸二羟丙酮（ＤＨＡＰ）还原的最适ｐＨ值为７．５,催化Ｇ３Ｐ脱氢的最适ｐＨ值为１０。该酶对４个底物还原型辅酶Ⅰ（ＮＡＤＨ）,二磷酸吡啶核苷酸（ＤＨＡＰ）,辅酶Ⅰ（ＮＡＤ）,Ｇ３Ｐ的表观Ｋｍ值分别为６３μｍｏｌ／Ｌ,２７２μｍｏｌ／Ｌ,１．５３ｍｍｏｌ／Ｌ,６．５２ｍｍｏｌ／Ｌ。该酶在保存过程中易失活。ＮＡＤＨ能降低酶失活的速度,而ＮＡＤ则不然。低浓度ＮａＣｌ对酶略有保护作用,但高浓度ＮａＣｌ加快酶的失活,且浓度越高效应越明显。     

基于双酶偶联法合成尿苷二磷酸葡萄糖醛酸的研究

尿苷二磷酸（uridine diphosphate,UDP）-葡萄糖醛酸是细胞内重要的糖基供体,参与多种代谢途径,也是体外进行糖基化反应的重要糖基供体,但其价格昂贵、工艺复杂,限制了其大量使用,无法满足生产需求。基于此,利用双酶偶联法氧化UDP-葡萄糖生成UDP-葡萄糖醛酸,并研究反应产物的合成情况。以UDP-葡萄糖为底物、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+）为辅因子,利用化脓性链球菌Streptococcus pyogenes源的尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶（UDP-glucose dehydrogenase,UGD）、猪源的乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）,双酶偶联催化合成UDP-葡萄糖醛酸,并通过高效液相色谱、质谱及核磁共振氢谱对反应产物进行检测,确定产物的结构及产物的生成量。结果表明,利用双酶偶联法氧化UDP-葡萄糖所得到的产物为UDP-葡萄糖醛酸。在UGD的作用下,氧化UDP-葡萄糖生成UDP-葡萄糖醛酸,同时辅因子NAD+在LDH的作用下实现循环再生,减少高能产物辅酶还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide,NADH）对反应的反馈抑制作用,产物的生成率约为60.17%。研究提高了产物UDP-葡萄糖醛酸产物生成量,为后续工业化制备提供了新思路。     

棉花法呢基焦磷酸合酶cDNA克隆,序列分析及其在种子发育过程中的？…

根据法呢基焦磷酸合酶（ＦＰＳ）保守域设计简并引物,应用Ｎｅｓｔ ＰＣＲ和ＰＣＲ－９６孔板筛库技术分离到亚洲棉法呢基焦磷酸合成酶的ｃＤＮＡ。序列分析表明,该ｃＤＮＡ全长１２８０ｂｐ,开放阅读框共编码３４２个氨基酸残基,推断蛋白质分子量约为３９ｋＤ,推测的氨基酸顺序与拟南芥和青蒿的ＦＰＰ合酶序列同源性为７８．９％和８０．７％。应用ＲＴ－ＰＣＲ定量分析ｆｐｓ１基因在“苏棉６号”（Ｇ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ Ｌ