H_(18)细胞中Epstein-Barr病毒DNA复制的抑制和恢复

采用~(32)P标记的EBV DNA BamH Ⅰ-W片段为探针,通过细胞点杂交测出每个H_(18)细胞中EBV基因组拷贝数约207个。在PAA存在下,这些病毒基因组数快速下降。每毫升细胞培液中加75γPAA后第11天,每个细胞中EBV基因组平均拷贝数降到17个,只占未处理细胞的8%,而后既使继续处理也稳定地维持在该水平。然而EBV-VCA的合成被完全地抑制了,只是EBV-EA的合成不受影响。如去除PAA,第3天时细胞中EBV基因组数可恢复到对照组的29%,而第40天则可恢复到90%。但是在去除PAA处理的同时加n-BA处理则明显地抑制这种恢复。一般认为EBV附加体DNA的复制由宿主细胞DNA多聚酶催化,病毒线状DNA由病毒诱导的PAA敏感的DNA多聚酶复制。由于n-BA能有效地阻碍宿主的DNA复制功能,因而我们的实验结果提示,宿主细胞和病毒诱导的DNA多聚酶??可能都参与了去除PAA处理后的H_(18)细胞中EBV DNA的恢复。     

人巨细胞病毒的生物素DNA探针的制备和应用

本研究用克隆的HCMV AD169株DNA片段,制备了生物素标记的DNA探针,建立了检测临床脐带血、尿标本中HCMV DNA的核酸探针杂交方法。该探针可测出100pg同源DNA,不与人胚肺细胞、Hep-2细胞DNA以及其他疱疹病毒的DNA发生反应。用核酸杂交方法检测了30份脐带血标本,有11例阳性,阳性率为33％。10例孕妇尿标本中,3例阳性,阳性率为30％。检测结果表明：我们建立的生物素标记的HCMV DNA探针的点杂交法,具有高度的特异性、敏感性,比分离病毒法更迅速,可用于HCMV感染的临床标本的病毒核酸检测。     

分子生物学技术讲座（五）：放射性标记的DNA和RNA探针的制备

放射性标记的核酸探针（DNA和RNA探针）目前已被广泛地应用于分子生物学的各个领域,例如克隆的筛选,Southern杂交分析,基因表达水平的测定等等。放射性核酸分子探针是指特定的已知核酸分子片段,内含放射性核素（例：‘千、‘H和”S）,并能与被检测的核酸分子退火杂交（核酸序列互补）,因此可用于待测核酸样品中特定基因序列片段的探测。1探针的种类和选择根据核酸分子探针的来源及其性质可将其分成3大类,即：DNA探针、RNA探针和人工合成的寡聚核青酸探针。而DNA探针又可分为基因组DNA探针和。DNA探针。探针的选择是根据不…     

Epstein-Barr病毒DNA Bam HI W片段在不同淋巴细胞株中量的比较

本实验用核酸点杂交方法,用EB病毒DNA的Bam HI W片段定量地检测了Burkitt淋巴瘤细胞株和正常人外周血B淋巴细胞株中病毒基因组这一片段的含量。对照组为BJAB和K562细胞。细胞点样从10~5数开始倍比稀释,最终点为1600个细胞。在以1—2×10~7cpm[~(32)P]标记的EB病毒W片段杂交后做放射自显影以及测各点的放射性强度。如以Raji细胞中病毒DNA W片段含量为1。其他各株细胞W片段含量分别如下:H7918 3.48、P_3H- R-1 3.33、H7922 1.95、H18C_1L_1 1.50、BJAB~+ 0.31。H7918、P_3HR-1、H7922和H18C_1L_1为VCA阳性反应,而Raji,BJ-AB~+为VCA阴性反应,因此上述初步结果表明,虽然病毒基因组的表达受寄主细胞的控制,但EB病毒基因组含量与病毒基因表达之间仍存在一定程度的相关性。     

一种基于寡核苷酸微阵列芯片的多重可扩增探针杂交技术

多重可扩增探针杂交技术(multiplex amplifiable probe hybridization,MAPH)是近年来发展起来的一种用于基因组中DNA拷贝数检测的新技术。并发展了一种基于寡核苷酸微阵列芯片的MAPH技术。该方法根据所检测的DNA序列,制备若干具有通用引物的FCR产物作为可扩增探针组,与固定在尼龙膜上待测的基因组DNA杂交。用磁珠回收特异性杂交的探针,经生物素标记的通用引物扩增后,与相应的寡核苷酸微阵列芯片杂交。该特异性的寡核苷酸微阵列芯片包括10个抗肌营养不良基因的外显子探针和阴性、阳性探针。杂交清冼后,链霉亲和素-Cy3染色用芯片扫描仪得到杂交的荧光图像。分析荧光信号的强度差异给出特定基因片段拷贝数的变化。该方法用微阵列技术代替MAPH中的电泳检测技术,可大幅度增加检测的通量。选择了一个正常男性、一个正常女性和一个肌营养不良症患者的基因组DNA来进行验证。结果表明,该方法能够同时给出抗肌营养不良基因多个外显子中的基因片段拷贝数差异信息。     

间接核酸杂交方法的建立

建立了一种新的核酸杂交手段一间接核酸杂交方法,其突出的优点是用一种共同的核酸标记物就可检查不同的基因组或不同的基因。我们重组乙型肝炎病毒或EB病毒的核酸片段于噬菌体M_(13)mp8载体,以此重组的单链DNA为第一夹心层,用~(32)P标记的双链噬菌体DNA作为共同探针,检查乙型肝炎病毒和EB病毒的核酸,获得满意的结果。应用该法进行细胞内的原位杂交,检查细胞内存在的EB病毒基因效果亦佳。     

用碘标记核酸检查鼻咽癌上皮细胞中的EB病毒基因

用同位素碘化钠直接标记核酸。以细胞内原位杂交实验检查鼻咽癌上皮细胞中的EB病毒基因。共检查病理确诊的10例鼻咽癌活检标本的细胞涂片,其中9例直接证实有EB病毒核酸。本文建立并改进了细胞内原位核酸杂交技术,首先使用重组的单链DNA作探针,并将碘标记的核酸用于原位核酸杂交实验。     

柯萨奇病毒B3 cDNA生物素探针的制备研究

本文将柯萨奇B组3型病毒(CVB3)cDNA的重组质粒DNA(pGP51B)转化到E.coli HB101菌株中.筛选转化阳性菌株,经培养扩增后,提取重组质粒DNA,用缺口求移法制备生物素标记探针,通过原位杂交技术检测CVB1.CVB3感染的Hela细胞及正常Hela细胞对照.结果该探针只与CVB杂交,而不与细胞对照杂交,且可检测出病毒感染5h尚未出现病变细胞中的病毒核酸.表明该探针具有良好的特异性和敏感性.     

用核酸杂交法检查北京地区幼儿园正常儿童尿中人巨细胞病毒DNA

以克隆的人巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus,简称HCMV)DNA片段做探针,用核酸杂交方法检查了50例北京地区幼儿园正常儿童的尿标本。查出HCMV DMA阳性者24例,占48％。在两个群体和两个年龄组之间,阳性检出率有显著性差异。利用探针可查出同源DNA5～10pg,而不与其它病毒或细胞DNA杂交。标记不同的探针,使用不同的固定方法,其敏感性不同。此法可在分子水平上查出HCMV基因,比分离病毒更迅速敏感。     

“缺口翻译”法制备~(32)P 标记DNA探针和几种核酸杂交技术

定性或定量检测天然DNA或重组DNA中某些特殊的顺序片段,分子杂交是最常用的方法。近几年,核酸的分子杂交技术日趋完善,以不同材料为支持物的固相杂交技术取得了更为迅速的发展。核酸分子杂交方法的灵敏性主要取决于同位素标记杂交探针的比放射性强度。因此制备高比放射性探针是提高灵敏性的关键。用缺口翻译方法制备较稳定的高比放射性强度的杂交探针,大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ是一个理想的工具。本文介绍我们建立并改进“缺口翻译”制备P标记的探针方法,以及几种重要的核酸固相杂交技术。     

棉铃虫核多角体病毒基因库及其物理图谱

本文报道棉铃虫核多角体病毒DNA经限制性内切酶BamHI酶解,琼脂糖凝胶电泳分离,得到大小不同的11种片段。所得片段与BamHI酶解的pBR_(322)质粒DNA进行体外重组并转化大肠杆菌LE392菌株。根据菌落杂交和插入片段的分子量等鉴定,证明获得11个插入了病毒DNA片段的重组质粒,但其中两个大片段克隆的分子量比原片段小。通过限制酶EcoRI和BamHI酶解片段的交叉吸印杂交及用~(32)p标记的克隆片段与病毒DNA酶解片段杂交等方法,构建了病毒基因组BamHI的物理图谱。杂交结果表明,病毒基因组主要由独特的序列组成。     

DNA探针体外标记及其应用

本文介绍了DNA探针在体外标记的几种方法,主要包括同位素标记法和非同位素标记法两大类。并介绍了标记的DNA探针在细胞原位杂交、Southern转印杂交、分子克隆筛选、核酸的分离和鉴定以及遗传性疾病的分析和诊断等方面的应用。     

斑点杂交生物素法检测流行性出血热病毒RNA

为寻找一种用于检测流行性出血热病毒的分子杂交方法,以生物素-7-dATP标记流行性出血热病毒(EHFV)R_(22)株M片段的cDNAR_3克隆作探针,与人源性的EHFVH-114、H-435株RNA基因组进行斑点杂交,得到阳性结果,可检出5pg的cDNA或RNA。此探针与疱疹病毒DNA不出现杂交信号。以上结果说明这种标记探针具有EHFV特异性,可以扩大应用范围,结果还表明动物源性和人源性EHFV均具有共同的保守核苷酸序列。     

银杏雌雄基因组DNA间的差异性分析

本研究应用RAPD技术,应用300个10bp随机单引物及200对随机双引物组合,检测了雌雄异株银杏基因组DNA的多态性。结果表明:雌雄基因组间具有极高的相似性,在检测到的3450个标记中,仅获得1个与银杏雄性基因组相关的RAPD标记。以该标记为探针,与雌雄银杏基因组DNA的Southern杂交分析,其杂交信号在两性之间表现为限制性片段长度多态性,该结果为寻找银杏早期性别鉴定的探针以及在细胞和分子水平进一步研究其性别问题奠定了基础。     

牙龈卟啉菌特异性克隆探针的筛选

目的 从牙龈卟啉菌47A－1的基因文库中筛选出特异性片段,制备成特异性克隆探针,方法 将牙龈卟啉菌47A－1基因文库中的重组质粒大量扩增和纯化,采用地高辛标记法制备成探针,与口腔中14种常见细菌DNA进行杂交鉴定,检测其特异性,从中筛选出对牙龈叶卟啉菌具有特异性的克隆探针。结果 重组质粒pZJ1与牙龈卟啉菌47A－1杂交,而与其它细菌DNA均不杂交,包括牙龈卟啉菌ATCC33277和W83。结论 重组质粒pZJI可制备成高特异笥克隆探针。     

七株昆虫核型多角体病毒基因组同源性的测定

应用限制性内切酶图谱分析法,结合Southern印迹法和核酸杂交技术,对茶毛虫、棉蛉虫,油桐尺蠖、斜纹夜蛾以及蓖麻蚕等5种昆虫的7株核型多角体病毒DNA,进行了基因组同源性测定。结果表明,不同种昆虫多角体病毒DNA的酶切图谱不相同,DNA片段与不同源的DNA标记探针之间无杂交带出现。而同种昆虫病毒的不同分离株间,除少数DNA片段的电泳迁移率稍有不同,以及出现一些互不相同的亚克分子带之外,它们的DNA酶切图谱基本一致,並且几乎所有片段都可与同种的标记探钟杂交。对一些DNA片段迁移率的改变及亚克分子带出现的原因进行了讨论。     

用磁珠富集法从AFLP片段中分离微卫星DNA标记

将花生(Arachis hypogaea L.)基因组DNA经酶切后转变成AFLP DNA片段,然后用生物素标记的简单重复序列(SSR)作探针与其杂交,杂交复合物固定到包被有链亲和素的磁珠上,经过一系列的洗涤过程,含有SSR的AFLP片段被吸附在磁珠表面.这些片段经洗脱下来后,先用对应的AFLP引物扩增,再进行克隆和测序,根据SSR两端的保守序列设计引物,经过多态性分析后,便可得到微卫星DNA标记.整个实验过程操作简单、消耗少,可在一周内完成,可作为从植物中分离SSR的一种简单有效的方法.     

三种核型多角体病毒核酸同源性的研究

用分子杂交技术研究了黑点银纹夜蛾(Arqyrogramma agnata Stgr,)单粒包埋型核型多角体病毒(简称A,A,SNPV),斜纹夜蛾(Prodenia litura)多粒包埋型核型多角体病毒(简称PL MNPV)以及用A,A,SNPV感染斜纹夜蛾幼虫所获得的多粒包埋型核型多角体病毒(暂称PoI MNPV)三种病毒核酸的同源性,用SDS-Tris酚法分别提取病毒核酸,用内切酶Eco RⅠ酶解,比较了病毒核酸的酶解图谱及分子量,用〔α-~(32)P〕dATP标记的三种病毒核酸Eco RⅠ酶解片段作探针,分别与各病毒核酸的Eco RI酶解片段杂交,结果表明PoI MNPV与PL MNPV的病毒核酸同源,而A,A,SNPV DNA不与PoI MNPV DNA、PL MNPV DNA杂交,无同源序列。     

~(125)Ⅰ标记乙型肝炎病毒DNA探针的制备及应用

本文报道用国产~125I-碘化钠标记乙型肝炎病毒DNA制备探针,可得到较高比度的产物,一般稳定在10~7—10(?)cpm/μg DNA。用该探针对不标记的乙型肝炎病毒DNA进行点分子杂交。可检测到5pg左右DNA。对17例血液标本进行点分子杂交,结果与32p-标记乙型肝炎病毒DNA探针杂交结果基本一致。     

重复DNA顺序pRRD9在稻属中的拷贝数测定

本文应用狭缝印渍杂交方法,把水稻基因组总DNA和含水稻中度重复顺序片段的质粒(pRRD9)DNA分别转移到尼龙膜上形成狭缝印渍、然后用~(32)P标记的 pRRD9插入片段进行杂交、根据各狭缝印渍的放射性强度,测定水稻(Oryza)一些栽培种和野生种基因组中重复DNA顺序的拷贝数,并就拷贝数与水稻进化关系及基因组型的联系进行讨论.