一株产卡拉胶酶细菌的分离鉴定及其酶学性质

【目的】从红树林土壤腐叶中分离出能够产生卡拉胶酶的菌株,对其进行鉴定,并研究其酶学性质。【方法】利用以卡拉胶为唯一碳源的培养基,分离出产卡拉胶酶的菌株;通过形态学观察、16S r DNA序列分析对其进行种属鉴定;对该菌株所产卡拉胶酶进行纯化并采用DNS测酶活的方法测定酶学性质。【结果】从红树林土壤腐叶中分离出1株高产κ-卡拉胶酶的菌株ASY5,经鉴定该菌株为假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas sp.ASY5)。纯化得到的κ-卡拉胶酶的分子量约为30 k Da;酶学性质试验表明,其最适反应温度和p H分别为60℃和7.5,在50℃以下酶的稳定性较好,在p H 7.0-9.0范围内酶活力较稳定,对κ-卡拉胶具有良好的底物特异性,以κ-卡拉胶为底物时Km值和Vmax值分别为2.28 mg/m L和147.06μmol/(min·mg),Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Al3+等对酶活有显著的促进作用,而Ag+、Zn2+、Cd2+及SDS对酶活有强烈的抑制作用。【结论】分离到的细菌假交替单胞菌Pseudoalteromonas sp.ASY5产生的κ-卡拉胶酶在较高的温度和碱性条件下均具有较高的酶活性,为利用卡拉胶水解酶产生卡拉寡糖的研究和应用奠定了基础。     

卡拉胶酶的来源、性质、结构与应用研究进展

卡拉胶作为构成红藻植物细胞壁的主要成分,是一种由D-半乳糖通过交替的α-1,3和β-1,4糖苷键连接而成的线性硫酸多糖。由于具有良好的成胶能力和化学稳定性,卡拉胶作为增稠剂和胶凝剂等添加剂在食品和化妆品行业中得到了广泛的应用。卡拉胶酶属于糖苷水解酶,可以将卡拉胶降解成一系列偶数聚合度的寡糖。卡拉胶寡糖由于具有抗炎、抗凝和抗肿瘤等多种功能,引起了相关研究者的持续关注。因此,通过筛选、表征或者改造等手段获得具有优良特性的卡拉胶酶成为目前红藻多糖资源开发领域的研究热点。特别是,数十种不同来源的卡拉胶酶已经被分离、鉴定和表征,大大丰富了红藻多糖水解酶的研究领域。根据酶的底物专一性,可将其分为三类：λ-、ι-和κ-卡拉胶酶。本文综述了卡拉胶酶的来源、分类及生化特性的最新进展。此外,还详细介绍了不同家族卡拉胶酶的结构特点和催化机制,并讨论了卡拉胶酶在制备功能性寡糖方面的应用前景。     

卡拉胶酶研究进展

卡拉胶酶是一种多糖水解酶,可以通过降解卡拉胶的β-1,4糖苷键,来生成卡拉胶低聚糖。根据酶解底物的差异,将其分为κ-卡拉胶酶,■-卡拉胶酶和λ-卡拉胶酶。近年来,研究发现卡拉胶寡糖具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节及抗凝血等药理活性,有望成为新一代的海洋药物而卡拉胶酶不但可以作为工具酶用于卡拉胶寡糖的制备,而且有助于卡拉胶结构的研究;另外,卡拉胶酶还可用于藻类原生质体的制备、因此,卡拉胶酶的研究具有重要的理论意义和明确的应用前景。本文从卡拉胶酶的分类及家族归属、来源、性质、分子生物学研究以及应用等方面综述了近年来国内外卡拉胶酶的最新研究进展     

卡拉胶酶的研究进展

卡拉胶酶主要有κ－卡拉胶酶,ι－卡拉胶酶,λ－卡拉胶酶,是水解酶的一种。本文从酶的分类和来源,底物专一性和作用方式,酶的性质,产酶菌株及酶系,酶的应用五个方面综述了卡拉胶酶的研究进展。     

γ-谷氨酰转肽酶活性电泳染色新方法

目的：建立一种新的电泳活性染色方法,以快速地对活性电泳中γ-谷氨酰转肽酶（GGT）进行显色,从而准确鉴定和定位该酶,并可用于该酶的电泳法纯化制备。方法：低温下,样品活性电泳结束后立即将浸有γ-L-谷氨酰-α-萘氨和双甘肽混合底物溶液的滤纸贴在胶面上反应5min,然后再用浸有对氨基苯磺酸和亚硝酸钠混合显色液的滤纸覆盖在基质滤纸上显色。结果：在滤纸上很快显示出一条红色条带,经切胶酶促反应检验确定为GGT,经电泳法和高效液相色谱法确定GGT达到了电泳纯。结论：该法快速、灵敏、简单、直观,为GGT的鉴定和纯化提供了一条新思路。     

青稞中β-1,3葡聚糖酶的纯化及部分性质研究

β-1,3-葡聚糖酶[EC．3．2．1．39]存在于大多数的高等植物中,它们由一个小的基因家族编码,在植物不同的生理活动中起着重要的作用。采用NaCl抽提、硫酸铵分部沉淀和2步离子交换法和分子筛从青稞的胚芽中提纯得到了一种β-1,3-葡聚糖酶。在非变性电泳中纯化的β-1,3-葡聚糖酶用银染只有一条蛋白带,运用底物进行的活性染色时在相同位置也只显示一条酶活性带。此活性染色可以直接在电泳胶板上快速鉴定和检验β-1,3-葡聚糖酶。纯化的β-1,3-葡聚糖酶在还原及非还原条件下的SDS-PAGE变性电泳中,呈现一条分子量为32kD的主要蛋白带及2条低分子量的弱带,表明此酶无链内二硫键存在。等电聚焦分析显示其等电点为8．1。上述结果表明纯化得到的是一种碱性β-1,3-葡聚糖酶。     

小麦叶片β-1,3-葡聚糖酶的诱导、纯化与抗菌活性

三个小麦品种331、抗倒680和鲁麦23经氯化汞、水杨酸或核黄素处理后,叶片中的β-1,3-葡聚糖酶活性均有不同程度的升高.氯化汞处理24h对品种331该酶活性的诱导作用最强.因此取用氯化汞处理24 h的331小麦叶片研磨得到粗酶液.将粗酶液经硫酸铵分级沉淀、Phenyl-Sepharose Fast Flow疏水层析、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和Sephacryl S-100分子筛层析,得到了SDS-PAGE凝胶电泳谱带单一的β-1,3-葡聚糖酶样品.经SDS-PAGE(12%)和凝胶过滤层析,测得其分子量约为52.0～53.6 kD.抗菌试验测定显示,纯化的β-1,3-葡聚糖酶对供试的4种病原真菌的生长、孢子萌发或芽管伸长都有一定程度的抑制作用.     

海洋微生物几丁质酶分离纯化及其抗真菌活性

以实验室筛选的海洋产几丁质酶短芽胞杆菌属（Bacillus brevis sp．）菌株Bspl,经往复式摇床振荡培养96h后,发酵液先后采取了75％的硫酸铵盐析、透析、几丁质亲和层析、SDS—PAGE等方法对几丁质粗酶液进行分离纯化和鉴定。几丁质亲和层析一步纯化后,经过SDS—PAGE电泳测定该酶的分子量为23ku,其比活力为86．65．纯化倍数为1．707、产率为32．1％。纯化的几丁质酶能抑制病原真菌的生长,对病原真菌的拮抗作用具有广谱性。同时研究了几丁质酶的稳定性,以胶态几丁质为底物,分离的几丁质酶在pH7．5,55．0℃左右具有最大酶活性;Zn^2＋、Cu^2＋和Hg^2＋能强烈抑制几丁质酶活性;Ni^＋和EDTA抑制20％-40％;然而5mmol／LCo^2＋可以使几丁质酶活性提高1．4倍;Mg^2＋、Ca^2＋等也能使酶活性增加。     

假交替单胞菌Pseudoalteromonas sp. AJ5 产k-卡拉胶酶的培养条件优化

[目的]本研究的目的是优化Pseudoalteromonas sp. AJ5菌株的培养条件使之产生高活性的胞外κ-卡拉胶酶.[方法]通过富集培养技术从刺参肠道分离出一株卡拉胶降解菌AJ5,该菌株能利用卡拉胶作为惟一碳源和能源.依据形态学和生理学特征及16S rRNA基因序列分析,将该菌株鉴定为假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas).通过单因素试验和正交试验对Pseudoalteromonas sp. AJ5菌株产胞外κ-卡拉胶酶的培养条件进行了优化.[结果]单因素试验结果表明,Pseudoalteromonas sp. AJ5菌株的最佳培养条件为250 mL三角瓶装入75 mL发酵培养基、摇床转速150 r/min、接种量7%、pH8.0.单因素试验和正交试验结果显示该菌株的最佳培养基组成为κ-卡拉胶 1 g/L、牛肉膏2 g/L、 NaCl 20 g/L、K2HPO4·3H2O 1 g/L、 MgSO4·7H2O 0.5 g/L、 MnCl2· 4H2O 0.2 g/L、 FePO4 · 4H2O 0.01 g/L; 培养温度为28℃,培养时间为28 h.[结论]Pseudoalteromonas sp. AJ5菌株分泌胞外κ-卡拉胶酶,在最佳培养条件下,该菌株的κ-卡拉胶酶活力比优化前提高了4倍.     

黑木耳漆酶纯化及部分漆酶特性的研究

黑木耳漆酶研究可为漆酶的进一步分离纯化、基因克隆表达和大规模生产应用奠定基础。对黑木耳"黑29"菌株漆酶粗酶液进行硫酸铵分级沉淀后,通过Native SDS-PAGE电泳检测,存在3种漆酶LacA、LacB、LacC,分子量分别为60,34,19 kD。经硫酸铵分级沉淀和DEAE-Sephacel柱层析技术分离得一纯化成分LacC,纯化倍数7.60,酶活性回收4.28%。对LacC的pH、温度、金属离子和Km值等部分酶学性质进行研究发现,该酶氧化ABTS的Km值为1.18×10-6mol/L,催化氧化底物ABTS的最适pH为3.8,在pH 3.0~4.6表现出较强的稳定性;最适反应温度为55℃,低于50℃时有较好的热稳定性;金属离子Ag+对漆酶有激活作用,而Fe3+、Mn2+、Co2+则有抑制作用。     

重组菌BL21-HTa-cgkZ产κ-卡拉胶酶的发酵条件优化

【目的】优化重组菌BL21-HTa-cgkZ产生κ-卡拉胶酶的发酵条件。【方法】通过单因子筛选和响应面分析方法对在IPTG诱导下的κ-卡拉胶酶的产生菌BL21-HTa-cgkZ进行产酶条件优化。【结果】该菌产酶的最佳培养基组成为：乳糖7 g/L,胰蛋白胨10 g/L,酵母粉5 g/L,NaCl 10 g/L,CaCl2 0.666 g/L。最佳诱导条件为：在工程菌接种1.55 h后添加IPTG,IPTG的浓度为0.89 mmol/L,诱导时间为24 h,诱导温度为23.03 °C。并确定了在培养基中添加乳糖、Triton X-100对κ-卡拉胶酶分布的影响。【结论】实验结果为产κ-卡拉胶酶工程菌的规模化生产奠定基础。     

一种筛选胞外纤维素酶产生菌的快捷、灵敏、有效的方法

【目的】建立一种能快捷、灵敏、有效筛选高β-葡萄糖苷酶活性的胞外纤维素酶产生菌的方法,用于胞外纤维素酶产生菌检测筛选。【方法】将以微晶纤维素(Avicel)或羧甲基纤维素(CMC)为底物的胞外纤维素酶产生菌平板筛选法常用的刚果红或碘液浸泡染色改为碘液熏染,减少碘液的消耗和对环境的污染;建立以对硝基苯酚-β-1,4-葡萄糖苷(pNPG)为底物的β-葡萄糖苷酶发色底物平板筛选法;将两方法串联用于高β-葡萄糖苷酶活性的胞外纤维素酶产生菌的筛选。【结果】建立了分别以CMC和Avicel为底物结合碘液熏染的胞外纤维素酶产生菌平板筛选法和以pNPG为底物的β-葡萄糖苷酶发色底物平板筛选法,从56株真菌中筛选出了8株纤维素酶活性水平为++++的胞外纤维素酶产生菌,从后者筛选出4株高β-葡萄糖苷酶活性的胞外纤维素酶产生菌。【结论】将以CMC和Avicel为底物结合碘液熏染的平板筛选法和以pNPG为底物的发色底物平板筛选法串联,可快捷、灵敏、有效地用于高β-葡萄糖苷酶活性的胞外纤维素酶产生菌的筛选。     

2型猪链球菌β-半乳糖苷酶基因的克隆表达及酶活性测定

目的:克隆表达2型猪链球菌β-半乳糖苷酶(BgaC)编码基因,并测定其酶活性。方法:根据05ZYH33基因组序列设计引物,PCR扩增bgaC基因,构建重组表达质粒pET28a-bgaC,转化E.coli BL21,筛选阳性转化子进行IPTG诱导表达,产物通过SDS-PAGE鉴定;最后对表达产物进行亲和层析纯化,获得BgaC纯化蛋白后测定其酶活性。结果:bgaC基因在原核细胞中得到高效表达,重组表达的BgaC分子质量约为69kDa,其酶促反应最适温度为42℃,最佳反应时间为30min,最适反应pH为5.5,最佳底物浓度为10mmol/L。2型猪链球菌BgaC的体外酶活为1615U/ml,酶比活为1076U/mg。结论:2型猪链球菌强毒力株05ZYH33中含有bgaC基因,在原核系统高效表达的BgaC具有良好的酶学活性。     

云南传统发酵豆豉中高产豆豉纤溶酶菌株的筛选及其酶谱分析

从云南昆明、元阳、玉溪、昭通地区采集豆豉样品26个,通过琼脂-纤维蛋白平板试验,SDS-fibrin-PAGE蛋白电泳结合Zymography活性染色对相应酶谱进行分析;同时采用茚三酮法测定其豆豉纤溶酶活性,筛选得到5株豆豉纤溶酶活性较高的菌株,其中尤以ZT-13茵株纤溶酶活性达到97.09 U/mL,是工业化生产豆豉纤溶酶的潜在优良菌株.     

明胶酶谱实验方法的优化简

目的：优化明胶酶谱实验方法,并检测不同浓度凝血酶刺激人皮肤成纤维细胞分泌的明胶酶B（MMP-9）活性的变化。方法：用含明胶的聚丙烯酰胺凝胶电泳分开上清中各蛋白条带,经2．5％TritonX-100洗脱、明胶酶缓冲液孵育、考马斯亮蓝染色液染色及脱色液脱色后,经光密度扫描记录,应用ImageJ软件进行密度计量分析。结果：凝血酶刺激人皮肤成纤维细胞分泌MMP一9具有浓度依赖性。结论：利用优化的明胶酶谱实验方法可做出高质量的明胶酶谱图片,对检测明胶酶活性有重要意义。     

一株产纤溶酶菌株的分离鉴定及其纤溶组分分析

【目的】筛选性能良好的产纤溶酶菌株,对菌株进行多项分类鉴定,分析其纤溶酶系的组成特征及纤溶能力。【方法】通过酪蛋白培养基初筛,琼脂-纤维蛋白双层平板复筛,从海泥、土壤等环境中筛选纤维蛋白降解菌,以尿激酶为标准测定纤溶酶活性。通过形态学、生理生化特征研究,结合16S rDNA基因序列分析菌株种类及系统分类地位。通过SDS-PAGE和纤维蛋白酶谱法分析胞外纤溶酶系的组成特征。【结果】筛选到一株能降解纤维蛋白的细菌CNY16,鉴定其为沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)。该酶为胞外酶,SDS-PAGE和纤维蛋白酶谱结果表明该纤溶酶系有至少两种分子量大小不同的纤溶酶,分别约33 kD和23 kD。能有效溶解血块中纤维蛋白,并且对红细胞无降解作用。【结论】细菌CNY16是一株新的纤溶酶产生菌,纤溶酶活性及稳定性较好,具有潜在开发价值。为获取新型纤溶酶提供了一种新的菌源。     

脂肪酶酶活性的最新研究

通过胶柬酶学对传统脂肪酶酶活性测定的改进,提出适合于油包水微乳液体系中脂肪酶酶活性测定的分光光度方法。与传统方法相比,本法克服了底物乳化液难配制,不稳定等缺点,无需在pH缓冲液体系中进行酸碱滴定。与有关文献中微乳液方法相比,本法采用不同的反应设备,选取了更廉价的检测试剂,缩短了实验时间。因而是一种值得推广的脂肪酶酶活检测方法。     

测定淀粉分支酶活性方法的改进

以发育中的小麦籽粒为材料,对现有的淀粉分支酶活性测定方法从缓冲体系,酶液浓度、反应体系总体积、反应时间、到酶反应终止方式作了适当改进。改进后的酶活性测定方法能很好的区分不同小麦品种间的酶活性差异,实验重复性好,比原测定方法更快捷、省时、经济和易于操作。     

嗜热菌Bacillus fordii 3-2海因酶的纯化及性质

对自行筛选的海因酶法L-苯丙氨酸生产菌株Bacillus fordii 3-2中的海因酶进行了分离纯化及相关性质研究.该海因酶协同L-氨甲酰水解酶是海因酶法生产L-氨基酸的关键酶.B.fordii 3-2菌悬液经压力破碎离心后取上清液为粗酶液,粗酶液通过硫酸铵分级沉淀、Phenyl FF(high sub) 疏水层析以及Source 15Q离子交换层析,经SDS-PAGE分析达到电泳纯,亚基相对分子质量为55×103,海因酶的纯化回收率为20.5%,纯化倍数为149.23.该海因酶在pH 8.0～10.0的范围内具有较高的活性,在45～70℃具有很高的酶活力, 最适反应pH和温度分别为10.0 ℃和65 ℃.纯酶易氧化失活,DTT对该酶有一定的保护作用.二价金属离子,Mn2 、Co2 及Fe2 对酶活性有显著的促进作用,而Ca2 、Cu2 等对酶活性有抑制作用.相关研究可为该菌株及海因酶的进一步开发与应用提供理论指导.     

Aspergillus sp. RSD生淀粉糖化酶的分离纯化及酶学性质

【目的】纯化得到一种生淀粉糖化酶,并对其酶学性质进行分析。【方法】从曲霉RSD发酵液中,经过硫酸铵分级盐析,HiPrep DEAE FF16/10弱阴离子交换层析,凝胶过滤层析,Hiprep 16/10 source 30S阳离子交换层析最终纯化出一种电泳纯的生淀粉酶。【结果】粗酶液纯化倍数为12.65倍,活力回收率为9.02%,SDS-PAGE结果显示该酶的相对分子质量约为82 kD。对该酶的酶学性质分析结果表明,该酶最适作用温度为50°C,在50°C以下稳定性很好,对高温较为敏感;最适作用pH为4.5,在pH 3.5-7.0范围内酶活力较为稳定,在40°C、pH 4.6条件下以可溶性淀粉为底物时的Km值和Vmax值分别为7.44 g/L和1.45 g/(L·min);金属离子对酶活性的影响试验表明,Fe2+对该酶具有显著激活效果,EDTA、Cu2+、K+对该酶酶活力有不同程度的抑制作用;底物特异性研究表明该酶对麦芽糊精具有较高酶活力。【结论】与市售糖化酶及生淀粉糖化酶相比,该酶对生淀粉的降解能力更高,在工业应用上有较好的前景。