提高重组原动蛋白2表达水平的优化策略

原动蛋白2(PK2)是近年发现的一个具有多种生物学功能的蛋白质因子。采用Design-Expert 7.0.0软件对重组PK2表达的最优诱导条件进行响应面分析。结果表明,诱导起始时机与诱导物浓度是影响重组PK2表达水平的显著性因子。同时,诱导时间-诱导时机、诱导时机-诱导物浓度之间的相互作用对PK2的表达水平具有显著性影响。试验数据拟合与极值分析表明最优诱导条件为:工程菌OD600为0.60时,采用终浓度为0.62 mmol/L的IPTG在37℃诱导培养2.82 h,此时重组PK2的表达水平为170.73 mg/L。优化后的诱导条件导致重组PK2的表达水平提高了51.1%,而所需IPTG减少38.0%,诱导时间缩短53.0%,有利于大量制备重组PK2进行后续功能研究及应用研究。     

重组人GST-TCF4βBD在大肠杆菌中的表达条件优化与活性鉴定

在大肠杆菌中优化重组人GST-TCF4βBD(recombinant human GST-TCF4β-catenin binding domain,rhGST-TCF4βBD)的表达条件及其生物学活性初探。化学合成的人TCF4βBD基因片段与pGEX-6P-1表达载体连接,构建重组质粒,再将其转化到Escherichia coli Rosetta(DE3)感受态细胞中诱导目的蛋白质表达。通过优化诱导时间、诱导温度和IPTG浓度,确定rhGST-TCF4βBD可溶表达的最佳条件。以GSTrapTM亲和柱分离纯化rhGST-TCF4βBD后,再以GST Pull-down实验进行生物学活性鉴定。SDS-PAGE结果表明,在大肠杆菌中成功进行了rhGST-TCF4βBD的可溶表达,确定诱导温度25oС、诱导时间8 h和0.2 mmol/L IPTG作为rhGST-TCF4βBD可溶表达的最佳表达条件,此时表达量达24%,趋于表达量峰值。GSTPull-down实验结果表明,纯化的rhGST-TCF4βBD能与重组人β-catenin和细胞内源β-catenin特异性结合,具有良好的生物学活性。本文成功进行了rhGST-TCF4βBD在大肠杆菌中的表达条件优化与活性鉴定,为靶向β-catenin/TCF4相互作用小分子抑制剂筛选模型的建立奠定了实验基础。     

乳糖诱导重组尿酸酶基因在大肠杆菌中的表达

对用乳糖替代异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组产朊假丝酵母尿酸酶基因在E.coli JM109(DE3)中表达进行了研究,拟建立一种高效低成本的生产重组尿酸酶的工艺路线。通过摇瓶试验对诱导所采用的乳糖浓度,诱导时机和诱导持续时间进行了优化,并考察在乳糖诱导下的目的产物表达动力学,随后在5 L发酵罐上进行扩大化培养以验证摇瓶优化的结果,进一步将乳糖作为诱导剂应用于高密度发酵过程。实验结果表明乳糖诱导的最佳浓度为5 g/L,最佳诱导时机是对数生长期中后期,诱导持续时间为9~10h;按照优化的条件在摇瓶和5 L发酵罐上进行分批培养,重组尿酸酶最大表达量可达菌体总蛋白的26%左右,可溶性蛋白的36%左右,略高于IPTG的诱导效果;高密度发酵过程菌体终密度达到OD600值40以上,尿酸酶表达量占菌体总蛋白25%左右。     

高产信号分子AI-2乳酸菌的筛选及其Pfs基因的克隆和表达

【目的】从锡盟地区酸马奶酒分离的乳酸菌中筛选出高产信号分子自体诱导物2(Autoinducer-2,AI-2)的乳酸菌,通过优化其重组蛋白Pfs的诱导条件体外合成信号分子AI-2。【方法】利用生物学发光法对不同乳酸菌产信号分子AI-2的产量进行比较,以高产信号分子AI-2乳酸菌基因组DNA为模板,扩增其S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(S-adenosylhomocysteine nucleosidase,Pfs)基因,构建原核表达载体。利用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行重组蛋白的诱导表达,通过优化培养基、诱导温度、诱导前菌体密度、IPTG浓度以及诱导时间得到高表达的Pfs蛋白,使其与底物作用最终体外合成信号分子AI-2。【结果】10株乳酸菌均可产信号分子AI-2,其中屎肠球菌8-3分泌信号分子AI-2的产量明显高于其他菌株;重组蛋白的最佳诱导条件为:选取SOC(Super optimal broth with catabolite repression)作为诱导表达培养基,菌液OD600为0.5–0.7时加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG,37°C诱导12 h;利用最优诱导条件获得了浓度为4.08 g/L的纯化Pfs蛋白,体外合成了信号分子AI-2。【结论】酸马奶酒中分离出的10株乳酸菌均可产生信号分子AI-2,且屎肠球菌8-3可通过Pfs基因的作用生成信号分子AI-2。     

重组人β-catenin原核表达条件的优化及生物学活性鉴定

优化重组人β-catenin(138～686 aa)在大肠埃希菌中的原核表达条件,经分离纯化后进行生物学活性鉴定。利用基因工程技术,将构建的重组质粒β-catenin-pET-30a(+)转化到Escherichia coli Rosetta(DE3)中,经IPTG诱导后进行β-catenin原核表达。为了提高β-catenin表达量,从诱导时间、诱导温度与IPTG诱导浓度3个单因素方面进行原核表达条件优化。β-catenin经HisTrap层析柱分离纯化后,以荧光偏振实验和酶联免疫吸附测定实验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)进行生物学活性鉴定。构建的工程菌经原核表达条件优化后,确定诱导温度25℃、诱导时间10 h、0.2 mmol/L IPTG作为β-catenin最佳原核表达条件。荧光偏振实验和ELISA实验说明,纯化的β-catenin具有良好的生物学活性。本研究成功进行了重组人β-catenin原核表达条件的优化与生物学活性鉴定,为深入研究β-catenin在肿瘤免疫抵抗中的生物学功能奠定了实验基础。     

野葛糖基转移酶PIUGT2蛋白原核表达及其适宜条件探讨

通过单因素试验分别研究温度和IPTG浓度对重组大肠杆菌BL21(DE3)/pProEXHTa-PIUGT2诱导表达野葛糖基转移酶PlUGT2蛋白量的影响。利用150 ml LB液体培养基培养重组大肠杆菌BL21(DE3),并优化发酵条件。结果表明,在温度20℃和IPTG浓度为0.75 mmol/L条件下,PIUGT2蛋白表达量最高。     

乳糖诱导的重组人血管内皮抑素(rhEndostatin)蛋白的表达

研究用乳糖替代IPTG作为诱导剂进行重组蛋白的表达,观察乳糖对乳糖操纵子调控的基因工程菌发酵及重组血管内皮抑素表达的影响,从而选取最佳诱导表达条件。以重组人血管内皮抑素表达工程菌pETrhEN/BL21(DE3)作为研究对象,分别用IPTG和乳糖作为诱导剂,在摇瓶中进行表达实验。并对重组蛋白质表达量进行分析。然后在5 L发酵罐中进行验证。在摇瓶培养条件下,乳糖浓度大于0.5 g/L即可以诱导目的蛋白的表达。乳糖浓度1 g/L时诱导目的蛋白表达量与1 mmol/L的IPTG相当,当乳糖浓度为10 g/L,目的蛋白表达量达到最大。在发酵罐培养条件下,补料4 h后葡萄糖浓度基本耗尽,此时开始加入乳糖。诱导后1 h,即有重组蛋白表达,在诱导后4 h达到高峰(占菌体可溶性蛋白的56%),与此同时,诱导后5 h菌体浓度也达到最高值。在以乳糖操纵子为调控手段的工程菌表达系统中,可以使用乳糖作为诱导剂,诱导应在葡萄糖消耗完后进行。     

人Nek2蛋白原核表达纯化及其多克隆抗体制备 *

目的通过原核表达系统表达人Nek2蛋白,优化表达条件并纯化Nek2蛋白,制备抗Nek2多克隆抗体.方法 将Nek2基因片段构建到原核表达载体pET30a(+)上,转化大肠杆菌BL21 (DE3);加入诱导剂IPTG诱导表达,对诱导温度,诱导剂IPTG终浓度,诱导时间等条件进行优化;利用12% SDS-PAGE后250mmol/L KCl染色切胶纯化蛋白质,将纯化后的Nek2蛋白进行质谱鉴定;纯化Nek2蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,运用ELISA,Western blot和免疫荧光实验检测多克隆抗体效价和特异性.结果 构建了pET30a(+)-Nek2重组原核表达质粒,诱导的重组人Nek2蛋白主要以包涵体的形式存在;蛋白质的最适诱导表达条件为28℃,180r/min条件下加入终浓度为0.2mmol/L IPTG诱导32h;质谱分析纯化后的蛋白质为Nek2蛋白,最终获得浓度为1.35mg/ml纯化后的Nek2蛋白;纯化蛋白免疫小鼠,多克隆抗体效价大于1∶243 000,且具有良好的抗原特异性;免疫荧光实验显示Nek2主要定位于细胞质和细胞核.结论: 利用重组人Nek2蛋白获得具有良好抗原特异性的抗Nek2多克隆抗体.     

家蝇抗菌肽AMPs17蛋白原核表达条件的优化及其抗真菌活性检测

目的:优化AMPs17重组蛋白的原核表达条件,分析重组蛋白的抗真菌活性。方法:比较不同的诱导温度(25℃、28℃、30℃、32℃、34℃)、异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导浓度(0. 025mmol/L、0. 05mmol/L、0. 1mmol/L、0. 3mmol/L、0. 5mmol/L、0. 8mmol/L、1. 0mmol/L)和诱导时间(12h、15h、18h、21h、24h)对AMPs17重组蛋白表达量的影响,筛选AMPs17重组蛋白的最佳表达条件;采用镍离子金属螯合剂亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,SDS-PAGE和ImageJ图像分析系统对表达结果进行分析,Western blot对AMPs17重组蛋白进行鉴定,高效液相色谱分析重组蛋白的纯度,微量液体稀释法及菌落计数法检测其抗真菌活性。结果:在诱导温度为32℃、IPTG浓度为0. 05mmol/L的条件下诱导培养15h,AMPs17重组蛋白的表达量最高且最为稳定;HPLC色谱仪分析显示AMPs17重组蛋白纯度可达到90%以上;优化后的AMPs17重组蛋白能有效抑制白色念珠菌的生长。结论:优化了家蝇抗菌肽AMPs17的诱导表达条件,获得了高表达、稳定且具有抗真菌活性的蛋白质,为后续抗菌机制及应用研究提供一定的实验基础。     

乳糖诱导重组多价人精子表位肽在大肠杆菌中的表达

旨在研究用乳糖替代IPTG作为诱导剂进行重组多价人精子抗原表位肽的表达及诱导表达的优化条件.在摇瓶发酵条件下,通过改变培养基组成、诱导时机、诱导温度、诱导剂浓度、诱导时间和诱导方式等条件,利用SDS-PAGE电泳和AlphaEase凝胶电泳图像分析系统,研究以上条件改变对GST-重组多价人精子抗原表位肽融合蛋白表达量的影响,并与IPTG诱导结果相比较.结果显示,在摇瓶试验中,最优表达条件为选用TB培养基,在菌体对数生长的中期进行诱导,诱导温度37℃、乳糖诱导终浓度3 mmol/L、诱导时间6 h.GST-重组多价人精子抗原表位肽融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的30.5％,且主要以可溶形式表达,与IPTG的诱导结果相同.分批流加乳糖和一次性加入乳糖诱导,效果一样.乳糖可以替代IPTG作为诱导剂诱导GST-重组多价人精子抗原表位肽融合蛋白的表达,优化条件下可获得与IPTG相同的诱导表达效果.     

大肠杆菌细胞周质底物结合蛋白gsiB基因的克隆及其表达条件的优化

为深入研究大肠杆菌谷胱甘肽转运系统的蛋白质结构和功能, 对该系统中的gsiB基因进行了克隆和表达条件的优化。根据大肠杆菌谷胱甘肽转运系统中底物结合蛋白gsiB基因序列, 利用PCR方法扩增到该基因的编码区序列, 利用SLIC (Sequence and ligation–independent cloning)方法直接将其插入pWaldo-GFPe中, 成功构建了重组表达质粒pWaldo-GFP-GsiB。将重组质粒转化不同的大肠杆菌表达菌株进行诱导表达, 通过改变培养温度和IPTG浓度等条件, 得到了能够大量表达目标蛋白的重组子。结果表明: 大肠杆菌BL21(DE3)是 gsiB基因表达的最佳宿主菌; 18℃低温诱导培养有利于gsiB基因的大量表达; 0.1 mmol/L IPTG足够诱导gsiB基因表达, 增加IPTG浓度(0.1 mmol/L~1.0 mmol/L)并不能明显地促进gsiB基因的表达。Western blotting结果显示目标蛋白质有表达, 其分子量大小与预期相符。     

多表位恶性疟疾疫苗M.RCAg-1在大肠杆菌表达的条件优化和大规模培养

通过以培养基配方、IPTG浓度、金属离子复合液浓度、镁离子浓度、表达时间、接种量、诱导时间点等发酵的重要条件对重组蛋白表达量影响的研究,确定多表位恶性疟疾疫苗M.RCAg-1蛋白最佳表达条件为以改良TB培养基培养、最优Mg2+,诱导剂IPTG和金属离子复合液浓度分别为10mmol/L,0.5mmol/L,6μl/ml,接种量为10%,表达时间为4.5h,将优化后的参数用于50L发酵罐进行连续3批中试规模的发酵,最终收获菌体湿重平均为31.8±1.78g/L,目的蛋白表达量可占菌体总蛋白的50%左右,试验确定了恶性疟疾多表位随机组合蛋白M.RCAg-1在大肠杆菌中的最优表达条件,该条件能够适合大规模培养需要。     

重组大肠杆菌表达绿色气球菌丙酮酸氧化酶的条件优化

本文优化了表达绿色气球菌丙酮酸氧化酶的重组大肠杆菌的诱导条件。优化了诱导温度、诱导剂IPTG浓度、诱导时重组大肠杆菌的浓度、溶氧等条件后发现最佳的诱导条件为25℃、IPTG 0.5 mmol/L、OD_(600)0.5细胞浓度、250 m L摇瓶中50 m L发酵液。该条件下重组大肠杆菌诱导24 h后最终的丙酮酸氧化酶活力达到7 396.9 U/L,与优化前相比提高了4倍,是目前报道的最高水平。本研究结果为大肠杆菌大量表达有活性的丙酮酸氧化酶,以及丙酮酸氧化酶的生产应用奠定了基础。     

枯草杆菌可溶性YlyA蛋白的诱导表达与纯化研究

YlyA是枯草杆菌一种功能未知蛋白.本研究旨在建立可溶性YlyA的诱导表达体系和纯化方法,为其功能研究奠定基础.PCR扩增ylyA序列,将其克隆到pETMCSⅢ中构建表达载体pNG252,用IPTG诱导6×His-YlyA融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,对表达产物进行分析,最后对可溶性YlyA重组蛋白进行Ni2+-WTA亲和层析加以纯化.结果表明pNG252中ylyA的插入方向正确,序列无突变;用0.5 mmol/L IPTG,37℃诱导3 h时,YlyA虽高效表达,但为包涵体形式;调整诱导条件至0.05 mmoL/L IPTG,25℃,5 h时,高效表达的YlyA部分转为可溶性蛋白.纯化后的YlyA浓度达204.2119 μmoL/L;调整洗涤液中的咪唑浓度至15 mmol/L,pH至9,可使纯化蛋白的产量大幅提高.本文成功构建了YlyA高效可诱导表达载体,建立了可溶性蛋白的诱导表达条件,确立了Ni2+-NTA亲和层析纯化方法,所得的6×His-YlyA融合蛋白,可用于YlyA晶体结构和与功能分析.     

草莓FaMYB5基因原核表达的响应面优化

利用中心组合设计(CCD)探究p ET-32a(+)-Fa MYB5融合蛋白原核表达的最优条件。以不同的诱导温度、诱导时间、菌液初始浓度和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)终浓度为4个考察因素,以可溶性蛋白含量为考察指标,在大肠杆菌中表达p ET-32a(+)-Fa MYB5融合蛋白,采用玻璃珠法破菌,提取蛋白质后通过SDS-PAGE凝胶电泳鉴定表达产物。经响应面优化后,在37℃培养工程菌至菌液OD600=0.74后,加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.40 mmol/L,在25.51℃条件下诱导培养8 h,可获得最高产量的可溶性目的蛋白,为128μg/m L。最优表达条件的获得,为后期纯化该可溶性蛋白和鉴定Fa MYB5蛋白与顺势作用元件的作用情况提供了一定的理论依据。     

乳糖诱导木聚糖酶基因在大肠杆菌中的可溶性表达

以构建好的大肠杆菌工程菌BL21(DE3)/xylanase为研究对象,研究了以IPTG和乳糖作为诱导剂时重组蛋白的表达规律。在摇瓶发酵条件下研究了诱导剂浓度、诱导时机、诱导培养时间和诱导培养温度对目标蛋白表达的影响。实验结果表明,乳糖作为诱导剂时,重组菌产酶活力33.9 U/mg略高于IPTG作为诱导剂时重组菌产酶活力28.10 U/mg,这为乳糖作为诱导剂应用于重组大肠杆菌生产木聚糖酶提供了参考依据。     

人β防御素3和植物des-pGLu1-brazzein融合蛋白表达菌的诱导条件优化及其活性分析

对人β防御素3和植物甜蛋白des-pGlu1-Brazzein嵌合基因的工程菌株BL-pET-hBD3-Bra的IPTG诱导表达条件进行了研究,同时对所表达的目的蛋白进行了纯化和活性分析.IPTG浓度、诱导时间和诱导温度对菌株生长和目的蛋白表达的试验结果显示:所取的IPTG浓度(0.2～1.0 mmol/L)对菌株生长和目的蛋白的表达无显著影响(P>0.05);菌株的生物量随着诱导时间的延长而增加,6 h优于4 h(P<0.01),但是蛋白的表达量无明显增加(P>0.05);其中温度是重要的影响因素,在30℃诱导时,目的蛋白的表达量占总蛋白的35%左右.进一步的研究表明,菌株在30℃-32℃生长,在30℃诱导最优.对目的蛋白的活性分析表明,所得到的hBD3-Bra融合蛋白有甜味,其甜度大约是蔗糖的200倍,但是其杀菌活性很弱,经凝血酶切割后,des-pGlu1-Brazzein的甜度大大提高,大约为蔗糖甜度的600倍,重组hBD3对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有明显的抑菌活性.     

β-蒎烯合成酶(QH6)在大肠杆菌中的表达及其产β-蒎烯的研究

蒎烯是一种重要的平台化合物,可以用来合成高密度燃料、精细化学品及材料。将来源于黄花蒿的β-蒎烯合成酶基因与外源杂合甲羟戊酸(MVA)途径一起整合到BL21(DE3)中共表达,通过气相色谱-质谱(GC-MS)和气相色谱(GC)对发酵产物进行了定性及定量检测。通过发酵条件优化,对影响发酵产β-蒎烯的因素(诱导温度、诱导剂浓度和N源)进行了考察。结果表明:来自黄花蒿的蒎烯合酶可以在宿主细胞内高效表达,且能高效催化β-蒎烯的合成。通过对重组菌进行发酵条件优化得到最佳培养条件:诱导温度为28℃,IPTG浓度为0.1 mmol/L,最佳有机N源为MD牛肉粉。在此条件下,检测出β-蒎烯产量达到22.89 mg/L,比优化前(4.60 mg/L)提高了3.98倍。     

乳糖替代IPTG诱导脱色酶TpmD基因在大肠杆菌中的高效表达

本文考察了乳糖代替IPTG诱导三苯基甲烷类染料脱色酶TpmD在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的可行性, 分别对用乳糖作为诱导剂时的诱导时机、乳糖浓度、诱导持续时间和添加方式进行优化并与IPTG诱导的差异等方面进行了比较分析, 确定了乳糖诱导的最佳条件。结果表明, 在工程菌对数生长中期(OD600约为0.8)添加终浓度为0.4 mmol/L的乳糖诱导6 h的条件下能获得最大量的目的蛋白和菌体量。由于乳糖可以作为碳源被菌体利用, 分批添加乳糖效果优于一次性添加。乳糖诱导条件下目的蛋白表达量占总蛋白的35.62%, 与IPTG诱导条件下的35.03%无明显差异。乳糖诱导后外源蛋白的表达时间有所滞后, 但收获的菌体量高于IPTG诱导, 显示出了乳糖同样是一种T7启动子的廉价高效诱导剂, 可以代替昂贵的IPTG用于脱色酶TpmD的规模化发酵, 同时也为其他重组蛋白的生产提供了有益的参考和借鉴。     

人乙醛脱氢酶2的原核表达及其活性的鉴定

商品化的乙醛脱氢酶主要从动物细胞、肝细胞线粒体中提取,其来源受到很大的限制,而且价格昂贵。为了解决乙醛脱氢酶原料有限的问题,利用微生物发酵法获取乙醛脱氢酶。将人乙醛脱氢酶2基因(aldh2)克隆至原核表达载体p ET32a中,构建重组载体p ET32a-ALDH2。将构建的重组载体转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)进行诱导,SDS-PAGE电泳结果显示目的蛋白得到大量表达;且对诱导表达条件进行优化。结果显示,在37℃,1.0 mmol/L IPTG诱导表达6 h为最优表达条件。由于目的蛋白几乎都是以包涵体形式表达,为了得到有活性的乙醛脱氢酶,对包涵体变性、复性和纯化进行了研究。试验数据显示,酶的最终得率为14.49 U/L。并通过用Bradford法,测定复性蛋白的浓度约为77μg/m L,进行活性检测表明,该复性蛋白具有乙醛脱氢酶活性,酶活性约为1.449 U/m L。通过构建重组载体p ET32a-ALDH2和优化表达条件,aldh2在原核表达宿主E.coli BL21(DE3)得到大量表达;此外,利用透析复性法得到的复性蛋白酶活性有所提高。