FGFR2IIIc胞外段的原核表达及其对前列腺癌细胞增殖的抑制作用

将FGFR2IIIc胞外段基因转入pET3c载体,并通过大肠杆菌使其以包涵体形式表达。经透析法复性和肝素亲和层析纯化,得到纯度95%以上的目的蛋白。通过免疫共沉淀方法证实复性后的FGFR2IIIc胞外段与FGF2之间可特异性结合,并对前列腺癌DU145细胞的增殖具有明显的抑制作用（MTT法）。免疫印迹结果显示FGFR2IIIc胞外段可显著下调DU145细胞膜上FGFRs的磷酸化水平,提示由于有效阻断FGFs的细胞内信号通路,从而导致FGFR2IIIc胞外段对肿瘤细胞增殖的抑制。     

胰岛素受体的配体结合结构域的克隆与表达

用ＰＣＲ方法从人胎盘ｃＤＮＡ 中获得编码胰岛素受体α亚基中结合胰岛素的相对独立的结构域Ｌ１、Ｌ２以及人工设计的Ｌ１－（Ａｌａ）１０－Ｌ２的基因,克隆入含Ｔ７噬菌体ＲＮＡ聚合酶启动子的表达质粒ｐＥＴ－３ａ中,转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,用ＩＰＴＧ诱导表达成功。ＤＮＡ测序、氨基酸组成分析以及蛋白质Ｎ端测序证明所表达的蛋白质正确。经过包涵体的分离、洗涤、溶解和纯化,得到了纯的变性状态受体的胰岛素高亲     

FGFR2Ⅲc胞外段的原核表达及其对前列腺癌细胞增殖的抑制作用

将FGFR2Ⅲc胞外段基因转入pEt3c载体,并通过大肠杆菌使其以包涵体形式表达.经透析法复性和肝素亲和层析纯化,得到纯度95%以上的目的蛋白.通过免疫共沉淀方法证实复性后的FGFR2Ⅲc胞外段与FGF2之间可特异性结合,并对前列腺癌DU145细胞的增殖具有明显的抑制作用(MTT法).免疫印迹结果显示FGFR2Ⅲc胞外段可显著下调DU145细胞膜上FGFRs的磷酸化水平,提示由于有效阻断FGFs的细胞内信号通路,从而导致FGFR2Ⅲc胞外段对肿瘤细胞增殖的抑制.     

重组人ASCT2的C-末端胞外结构域的原核表达、纯化及鉴定

中性氨基酸转运蛋白（ASCT2）是人类内源性病毒的包膜蛋白合胞素在细胞膜上的主要受体,其最大的胞外结构域存在于C-末端的105个氨基酸（以下简称TAIL）。通过RT-PCR方法从人乳腺癌MCF-7细胞中克隆ASCT2基因编码区全长序列,再从中扩增ASCT2的TAIL序列,与pET-41b（克隆位点的N-和C-端分别有谷胱甘肽转移酶和His6标签序列）连接构建原核表达载体,重组质粒在大肠杆菌中获得表达,免疫印迹显示重组蛋白TAIL在细菌裂解液上清和沉淀（包涵体）中均有表达,可溶性部分经亲和层析纯化获得高纯度的TAIL蛋白,该蛋白可结合在表达合胞素的MCF-7细胞表面,提示其可能具有结合合胞素的活性。     

CD34分子的胞外结构域cDNA分离与表达

CD34分子是一种重要的造血干／祖细胞表面标志,广泛用于造血干／祖细胞的鉴定和分选。由于CD34分子具有受体样结构并能传递细胞同型聚集的信号,故它是一种信号分子,但其在造血系统的天然配体与确切的生理功能至今仍不明确。研究中我们分离了CD34分子的细胞外结构域cDNA,并进行了原核融合表达及纯化。DNA序列分析和竞争结合抑制实验证明我们获得了纯化的CD34分子的细胞外结构域的重组蛋白,可作为CD34可溶性受体,用于进一步研究CD34分子的生理功能。     

重组人ASCT2胞外结构域ECL2在大肠杆菌中的表达及其鉴定

中性氨基酸转运蛋白(ASCT2)是人类内源性病毒的包膜蛋白合胞素在细胞膜上的主要受体,ECL2是该受体的其中一个较大的胞外结构域.通过RT-PCR方法从人乳腺癌MCF-7细胞中克隆ASCT2基因编码区全长序列,再从中扩增ASCT2的胞外区ECL2序列,与pET-41b连接构建原核表达载体,重组质粒在大肠杆菌中获得高效表达,重组蛋白在N-和C-端分别融合谷胱甘肽转移酶(GST)和His6标签,融合蛋白在上清液和包涵体中均有表达,可溶性部分经亲和层析纯化获得高纯度的重组蛋白,该蛋白可结合在表达合胞素的MCF-7细胞表面,具有结合合胞素的潜在活性,这些结果为进一步研究ASCT2与合胞素的相互作用奠定了基础.     

FOXO3a反馈上调人表皮生长因子受体3表达介导HER2+乳腺癌细胞酪氨酸激酶抑制剂治疗耐受

近年来,酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors,TKI）类药物治疗HER2+乳腺癌进展迅速,但出现治疗耐受仍是迫切需要解决的问题。本研究采用TKI（AEE788、Lapatinib）处理HER2+乳腺癌细胞BT474和SKBR3,发现HER3在mRNA和蛋白质水平上的表达均上调。MTS及克隆形成实验结果显示,siRNA干扰HER3的表达能够显著抑制BT474、SKBR3细胞的增殖,表明干扰HER3可增强细胞对TKI的敏感性。为进一步考察TKI促进HER3表达的可能机制,Western 印迹及免疫荧光检测发现,AEE788、Lapatinib能够上调FOXO3a的表达且促进其入核。干扰FOXO3a可逆转TKI对HER3的诱导作用,说明TKI通过激活FOXO3a上调HER3的表达。综上所述,FOXO3a反馈上调HER3表达介导HER2+乳腺癌细胞TKI治疗耐受。这一研究发现,为临床解决TKI治疗耐受提供一定的理论基础。     

人TRAP1基因的克隆、原核表达及表达条件优化

应用RT-PCR技术,从人白血病多药耐药细胞株K562/ADR中扩增出肿瘤坏死因子受体相关蛋白l(tumor necrosis factor receptor-associated protein1,TRAP1)基因的cDNA.选择Nde I和Xho I分别作为上下游引物的酶切位点,将TRAP1基因克隆到带有6×His标签的pET-28a(+)的载体上.重组质粒转化大肠杆菌DH5α中,涂布于含卡那霉素的LB琼脂培养基上,经双酶切鉴定后的阳性克隆送去测序.测序成功的重组质粒pET28a(+)-TRAP1转化大肠杆茵BL21 (DE3)中,在IPTG的诱导下,成功表达重组蛋白TRAP1.通过改变诱导温度、诱导时机、IPTG浓度及诱导时间,找出最佳表达条件,使重组蛋白TRAP1表达量最高.结果表明,在39℃条件下,0D600达到0.8时,经终浓度为0.1 mmol/L的IPTG诱导6h,目的蛋白的表达量最高.该研究为纯化出TRAP1蛋白,进一步研究该蛋白的结构和功能奠定了基础.     

人BMP4基因的克隆及其原核表达载体的构建

以成熟人胎盘组织为材料来源,克隆人BMP-4基因的全长cDNA,经过PCR扩增后与pMD18-T载体连接,构建pMD18-T-BMP4克隆质粒.酶切后回收小片段与表达载体pET-22b的多克隆酶切位点连接,构建原核表达载体pET22b-BMP4,酶切及测序鉴定重组子.重组质粒转化至感受态的Rosseta宿主菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测蛋白表达情况.结果显示,从胎盘组织中成功地克隆到人BMP4基因,与NCBI中公布的序列100％相符合,原核表达载体pET22b-BMP4转化至Rosseta构建表达菌体,经IPTG诱导后电泳分析可见重组蛋白表达的条带.     

人角质细胞生长因子2在不同原核表达系统中的表达差异

目的:比较重组人角质细胞生长因子2(rhKGF-2)在不同原核表达系统中的表达量和表达稳定性之间的差异。方法:利用PCR方法从人胚胎肺成纤维细胞cDNA扩增得到hKGF-2序列,双酶切后分别克隆到pBV220、pQE31和pET-24b载体中,分别转化大肠杆菌JM109、M15和BL21(DE3)进行诱导表达,SDS-PAGE分析rhKGF-2的表达量和表达稳定性,并纯化rhKGF-2。结果:pBV220-rhKGF-2与pET-24b-rhKGF-2在宿主菌内经诱导后均有目的蛋白表达,其中pBV220-rhKGF-2的表达量约占菌体总蛋白的10%,pET-24b-rhKGF-2的表达量约占菌体总蛋白的25%,且均为可溶性表达,但后者的表达稳定性明显优于前者,而pQE31-rhKGF-2在宿主菌内几乎没有表达。结论:hKGF-2在不同原核表达系统中的表达量和表达稳定性存在明显差异。     

西藏小型猪Leptin及其受体胞外区片段的克隆及原核表达

目的克隆及原核表达西藏小型猪瘦素（Leptin）成熟肽及瘦素受体胞外区片段。方法根据西藏小型猪瘦素序列（GenBank号：GQ240885.1）和猪瘦素受体基因胞外域序列（GenBank号：AF167719.1）分别设计并合成两对引物扩增瘦素、瘦素受体基因胞外域编码区1654-2319位片段,以西藏小型猪组织总RNA为模板,经反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法获得了特异性片段。再以该两个特异性片段为模板,另外设计两对带有BanHⅠ和HidⅢ酶切位点的套式引物分别扩增瘦素64-504位（成熟肽编码区）和瘦素受体基因胞外域编码区1655-2314位的cDNA片段,将该两片段克隆入pMD18-T载体并转化感受态细菌E.coli DH5α测序并永久保存。此两片段经酶切后克隆到表达载体pRSET A的BamHⅠ和HindⅢ两酶切位点之间,构建重组质粒pR-OB和pR-OBR-a并在大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中表达,SDS-PAGE电泳鉴定表达产物。结果在IPTG诱导下促使重组菌pR-OB表达了相对分子质量约18×103左右的融合蛋白;重组菌pR-OBR-a表达了相对分子质量约27×103左右的融合蛋白。结论说明重组质粒pR-OB、pR-OBR-a在大肠杆菌BL21（DE3）中分别可表达西藏小型猪瘦素成熟肽、瘦素受体片段蛋白,为进一步研究瘦素、瘦素受体功能和应用提供了基础。     

血管内皮细胞生长因子受体(KDR)的分子克隆与原核表达

血管内皮细胞生长因子（ＶＥＧＦ）是特异的血管内皮细胞促分裂素,它主要通过相应受体（ＫＤＲ）刺激血管内皮细胞增殖．ＶＥＧＦ及其受体在肿瘤血管形成中起重要作用．通过逆转录及多聚酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）成功地从人脐静脉内皮细胞扩增出编码ＫＤＲ胞外ＶＥＧＦ结合区的ＤＮＡ片段,将该片段克隆在谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ）融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ２Ｔ中,获得在大肠杆菌Ｊｍ１０９的稳定表达．表达的不溶性融合蛋白可经碱变性法大量提取,为后续的研究工作奠定了基础．     

HER-2/neu胞外配体结合区2在大肠杆菌中可溶性表达及纯化

用PCR技术扩增HER 2 neu胞外配体结合区 2 (RLD2 )cDNA ,并将扩增的基因片段克隆于硫氧还蛋白 (TrxA)原核表达载体中 ,获得TrxA RLD2融合蛋白的可溶性表达 .通过插入偶联翻译序列 ,实现TrxA与RLD2蛋白在大肠杆菌中的共表达 .表达产物经免疫印记检测可被抗HER 2 neu特异性抗体识别 .经离子交换层析和钴亲和层析纯化 ,RLD2蛋白的纯度达 90 % .用质谱法分析RLD2蛋白的分子量 ,与预期值相符 .结果表明 ,利用TrxA表达体系在大肠杆菌中获得了HER 2 neuRLD2蛋白高效可溶性表达     

大黄鱼MSTN成熟肽区基因的原核表达

根据本实验室克隆的大黄鱼肌肉生长抑制素(MSTN)基因编码序列设计引物,通过RT-PCR法扩增大黄鱼MSTN成熟肽区域的基因,将目的片段插入pMD18-T克隆质粒,并测序验证。验证后用BamHⅠ和HindⅢ限制性内切酶酶切含目的片段的pMD18-T克隆质粒和pET-28 a表达质粒,构建MSTN-pET-28 a重组表达质粒。将重组表达质粒转化至BL21菌中,经IPTG诱导后表达蛋白的大小约17 kD。     

血管生成抑制因子arresten基因的克隆表达

构建血管生成抑制因子arresten基因的原核表达重组体 ,并进行初步表达。从人胎盘组织中提取总RNA ,经反转录 聚合酶链式反应 (RT PCR)扩增出arresten基因 ;采用T A克隆法 ,将arresten基因克隆入pGEM T载体中 ,经DNA测序确认后 ,构建原核表达重组体pRSET Arr,转化大肠杆菌BL2 1 (DE3) ,用IPTG诱导表达。所获得的arresten基因经测序正确 ,并表达重组蛋白 ,经SDS PAGE分析 ,相对分子量为 2 6ku。构建的原核表达重组体pRSET Arr能高效表达重组arresten蛋白。     

ASCT2胞外域ECL2原核可溶性表达条件的优化及其纯化

目的构建重组人ASCT2胞外域ECL2融合蛋白的原核表达载体,优化其在大肠埃希菌中可溶性表达的条件,并获得纯化的ECL2蛋白。方法以PCR方法扩增编码ECL2的DNA片段,插入至pET-41b载体中,构建ECL2的原核表达载体,转化至大肠埃希菌,优化可溶性表达条件,GSH—Agarose亲和层析纯化并鉴定,与MCF-7细胞结合活性的测定。结果免疫印迹显示,ECL2融合蛋白既表达于包涵体中,也能以可溶性形式表达。随IPTG浓度的增高,可溶性表达水平提高;培养温度为28℃和33℃时可溶性产物高于37℃;而随诱导时间的延长至12h以上,可溶性表达量下降。可溶性表达优化条件为：温度33℃、IPTG浓度0．4mmol／L、诱导时间4h。经亲和层析获得高纯度ECL2蛋白并具有与MCF-7细胞结合活性。结论优化了ECL2融合蛋白的可溶性表达条件,通过亲和层析一步法可获得高纯度融合蛋白。     

人角质细胞生长因子2基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:构建人角质细胞生长因子2(hKGF2)基因的高效原核表达载体pET-30a( )-hKGF2,并在大肠杆菌BL21(DE3)中获得表达。方法:从培养的人胚胎肺成纤维细胞中提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增出去除了信号肽部分的hKGF2基因,克隆到pMD18-T载体,经DNA序列分析后与pET-30a( )表达载体连接,在大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达6×His-hKGF2,用SDS-PAGE及Western印迹鉴定表达蛋白。结果:构建了表达载体pET-30a( )-hKGF2,经IPTG诱导后,表达的重组蛋白理论相对分子质量约为23000,约占菌体总蛋白的20%。结论:6×His-hKGF2蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中为可溶性高效表达,为获得高纯度、高活性的产物,以及进一步的大规模生产和应用研究奠定了基础。