夜香树均一化全长cDNA文库的构建及EST分析

为构建高质量的夜香树(Cestrum nocturnum)均一化全长c DNA文库,以其花朵为材料,采用DSN均一化技术与改进的SMART技术相结合,将连接产物进行脱盐浓缩后电转化进行构建。结果表明,未脱盐连接产物的转化效率为1μL连接产物有7000个菌落,理论重组率为96%;脱盐后,提升为4.1×106个菌落,理论重组率为98%;蓝斑也有插入片段,实际重组率应为100%;插入片段大小平均为1.6 kb。随机挑取500个单克隆(含50个蓝斑)测序,共获得464条EST,单一序列(unigene)为426条,占91.8%,其中片段重叠群26个,单基因400个,冗余率仅为8.1%,表明构建文库的均一化效果较好,可满足后续功能基因的筛选和基因信息的研究。     

烤烟品种南江3号均一化全长cDNA文库构建

目的:为了获得功能基因的信息,构建烤烟品种南江3号的均一化cDNA文库.方法:用RNeasy Plant Mini Kit提取烤烟南江3号叶片和花的RNA,用反转录酶逆转录合成第一链eDNA.以LD-PCR扩增获得的双链cDNA为模板,采用基于双链特异性核酸酶(Duplex-Specific Nuclease,DSN)的均一化cDNA文库技术,构建南江3号盛花期的均一化cDNA文库.结果:构建了南江3号盛花期的均一化cDNA文库,文库重组率大为97.47%,库容量约为1.26×10<'6>,插入片段平均长度大于1.2kb.从文库中随机48个克隆进行PCR检测,挑取20个克隆进行测序,序列通过BLAST比对结果显示文库可能包含大量基因和ESTs序列.结论:该文库为研究南江3号的基因功能和资源提供材料来源.     

刺参管足SMART cDNA文库构建及EST分析

以大连广鹿岛野生刺参的管足mRNA为材料,利用SMART cDNA Construction Kit构建了表达型cDNA文库.初始文库的滴度为1.3 × 106PFU/mL,蓝白斑估测量组率合格.扩增后获得96 mL文库,滴度为1.8 × 1010PFU/mL,从扩增文库中随机挑取200个噬菌斑进行PCR检测,电泳检测结果表明重组率大于90％,片段大小在0.25 -2.0 kb之间的插入片段占80.4％,文库构建成功.随机选择122个噬菌斑转化为质拉pTriplEx2并测序,测序成功率83.6％,软件处理后100 bp以上的clean ESTs有72条,测通的为65条,占成功测序样品的63.7％.72条序列经SeqMan软件拼接,获得48条conting/singletons,在线Blast比对发现其中26条具有同源序列并获得注释,另外20条可能为新基因,其功能和结构有待进一步利用生物信息学的方法进行分析和研究.     

穴蚁蛉幼虫全长均一化cDNA文库的构建

通过构建穴蚁蛉幼虫(俗称蚁狮)全长均一化cDNA文库,以期了解蚁狮的抗菌肽、毒素蛋白以及其它药用蛋白种类,为日后筛选、克隆表达和分离纯化这些药用蛋白奠定基础.用针刺诱导蚁狮产生抗茵物质后,分离纯化总RNA,结合SMART全长文库与DSN(duplex-specific nuclease)均一化技术,构建全长均一化cDNA文库,并通过平板计数和菌落PCR方法鉴定文库.随机挑选192个单克隆进行5′端测序,并与NCBI数据库进行比对分析.结果显示,构建出的文库平均插入片段长度为1 200bp,原始文库的滴度达到7.5×105 CFU/mL,而扩增文库则为1.95×1011CFU/mL.在所挑选的单克隆中,共获得190条有效序列,平均读长1 340 bp,文库重组率达到98.96%.与NCBI数据库比对后发现,这些序列可能是一些编码蚁狮免疫、消化及毒性蛋白的基因.     

青杄PsbO基因cDNA序列克隆及生物信息学分析

利用RACE技术从已有的青杄均一化cDNA文库中克隆得到青杄(Picea wilsonii)PsbO基因cDNA的全长,并用生物信息学的方法对该cDNA的核苷酸序列、氨基酸序列的相似性,及编码蛋白PwPsbO的理化性质、亲水性/疏水性、二级和三级结构,PwPsbO基因进化树等进行了预测和分析.采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术,测定了青杄不同组织中的PsbO基因的相对表达水平.结果发现:青杄PsbO基因编码346个氨基酸,预测相对分子质量为36.6 kD,理论pI值为5.29,属于可溶性蛋白.二级和三级结构预测表明其含有较多的α螺旋、β折叠和随机卷曲结构.RT-qPCR发现该基因在青杄针叶和茎中表达量最高.这些结果为青杄中PsbO基因的初步功能研究奠定了基础.     

cDNA(EST)文库的高通量生物信息学分析体系的构建与应用

应用生物信息学方法,构建了一套针对cDNA或EST文库的高通量、自动化分析体系,CLASP(cDNA Library Analysis SystemPrimary)。CLASP基于Linux操作系统,主要由Perl程序构成。它以cDNA文库(ESTs)序列为分析对象,具有自动查找序列同源基因并进行染色体定位(包括细胞遗传学定位和SIS定位)、EST自动延伸等功能;并对不同来源序列进行聚类分析。应用该体系对3对肺癌相关抑制性消减杂交(SSH)cDNA文库进行了分析。结果在所有3对文库的2083条EST中有1492条找到了同源基因,其中1365条得到染色体定位。对所余591条未知基因的EST进行了电子延伸,其中有214条EST得到不同程度的延伸。对上述cDNA文库中已知基因的EST以及电子延伸后的EST再分别进行聚类分析,而后综合两个聚类分析的结果,由此可发现不同文库间的共同与差异表达基因,可用于特定性状相关的基因功能预测。     

破色期番茄果实均一化cDNA沉默文库的构建和功能基因筛选模型的初步建立

番茄果实的成熟是由多基因精细调控的一个过程．利用破色期番茄果实,根据复性动力学原理在mRNA水平进行均一化操作使高丰度和低丰度的mRNA丰度接近．然后把均一化之后mRNA反转录得到cDNA,再与基因沉默载体pTRV重组,最后把构建好的载体通过电转化的方法转入到GV3101农杆菌中,从而建立起破色期番茄果实均一化cDNA沉默文库．通过番茄果实中病毒诱导基因沉默技术,对cDNA沉默文库进行初步筛选,从而确定功能基因筛选模型．在模型建立阶段,以番茄红素合成途径相关的PDS基因作为内标基因,在100个混合农杆菌样中,成功筛选到了PDS基因．     

表达序列标签及其应用

表达序列标签（EST）在基因组作图,克隆基因,新基因的识别,蛋白质组研究等许多方面具有重要的用途。本介绍了EST的制备方法,以及构建均一化cDNA库的方法,并介绍了EST在以上各方面的应用。     

木榄幼苗叶片cDNA文库的构建及其表达序列标签分析

应用SMART技术构建了25‰盐度下生长4个月的木榄叶片的cDNA文库,文库滴度为10~6 cfu mL~(-1),重组率为94.4%,插入片断长度为1～2 kb.从cDNA文库中随机挑选了96个重组克隆进行序列分析,共获得94个表达序列标签(ESTs),经质量控制和聚类拼接后得到81个unigenes,包括5个片断聚合群和76个单一序列.Blastx分析结果表明这些unigencs与GenBank的Nr数据库中已报道的基因具有较高的同源性(E<10~(-5)),它们参与呼吸代谢、光合作用、糖代谢、氨基酸代谢、脂肪酸代谢以及不饱和脂肪酸生物合成等重要的生理过程,并与机体的损伤修复、胞吞作用以及PPAR信号途径等相关.     

鸡下丘脑cDNA文库的构建及部分克隆ESTs序列初步分析

以鸡下丘脑为实验材料,以λgt10为载体,构建了鸡下丘脑cDNA文库。结果表明,文库的滴度为3.8×10     

三丁基锡暴露条件下杂色鲍肝胰腺均一化cDNA文库的构建

用RDP试剂提取三丁基锡暴露诱导的杂色鲍肝胰腺总RNA,经Oligotex纯化得到 mRNA;应用SMART技术合成双链cDNA,双链特异核酸酶(DSN)进行双链cDNA的均一化,构建了杂色鲍三丁基锡暴露诱导下的均一化cDNA文库.原始文库的库容为4.3× 106 CFU/ml,重组率为 97.9%.从文库中随机挑选了3 288个克隆进行测序,得到3 048个高质量EST序列,其中有 370条 Contigs,2 103条 Singlets,Unigenes共 2 473条,冗余率为18.86%.以上结果说明该文库质量较好,为进一步筛选相关功能基因打下基础;较低的冗余率说明该文库值得继续使用大规模ESTs测序的方法寻找相关功能基因,并为进一步使用基因芯片技术研究相关功能基因的表达谱提供便利.     

青杆PwUSP1基因的克隆及表达模式分析

广泛逆境胁迫蛋白（universalstressprotein,USP）在非生物胁迫响应中起重要作用,但在植物中其功能还大部分未知。本研究通过BLAST分析青杆EST文库,得到职zP基因的EST序列,通过RACEPCR方法获取USP基因的末端序列,经过与EST序列拼接得到USP基因的cDNA全长序列,命名为PwUSP1。分析发现PwUSP1全长cDNA为1167bp,编码区为519bp,编码172个氨基酸残基。生物信息学分析显示,PwUSP1编码的蛋白相对分子质量为19．07kDa,理论等电点为6．38,为非跨膜的亲水性蛋白。PwUSP1具有USP家族典型的UspA结构域和ATP结合位点G-（2x）-G-（9x）-G（S／T）。半定量RT-PCR与RT-qPCR分析表明,PwUSP1在青杆的根、茎、针叶、花粉、种子中均有表达,在根和花粉中表达量较高。同时,PwUSP1受干旱和盐胁迫的诱导表达上调,均在处理6h后表达量较高,推测该基因可能在青杆逆境胁迫响应中发挥作用。     

利用表达序列标签电子克隆cDNA全序列的策略

基因组计划的进展及表达序列标签数据的迅速扩增使得电子克隆方法孕育而生,为进行基因克隆开辟了一条新的路径。介绍了表达序列标签和电子克隆的原理及过程,重点分析电子克隆过程中遇到的问题及解决方法,展望其在新基因功能研究中的作用。     

新疆荒漠昆虫光滑鳖甲cDNA文库的构建及功能基因筛选

以过冬后早春的新疆荒漠拟步甲属昆虫光滑鳖甲(Anatolica Polita borealis)成虫为研究材料,应用SMARTTM cDNA Library Construction技术,通过总RNA提取,反转录合成cDNA,定向构建至噬菌体载体λTripEx2,经体外包装构建了光滑鳖甲的cDNA表达文库。测试结果表明库容量为2.2×106,重组率为84.8%。通过对cDNA文库克隆的序列测定和初步生物信息学分析,获得28个光滑鳖甲表达序列标签(ESTs),包括17个EST(60.7%)与NCBI中已注册的已知功能基因相似性较高,另外的11个EST(39.3%)则没有发现与之相似的序列,推测可能是功能未知的新基因。同时,利用PCR扩增文库技术从cDNA文库中克隆获得了光滑鳖甲的抗冻蛋白基因,初步表明光滑鳖甲cDNA表达文库构建的成功,为深入研究新疆荒漠昆虫的抗冻机理及发现新的昆虫功能基因奠定了基础。     

青杄PSAK的克隆及生物信息学分析

目的:获取青杄的PSAK全长cDNA序列,对其进行生物信息学分析,并鉴定其在青杄各组织中相对表达量。方法:以多年生青杄(Picea wilsonii)的cDNA文库为模板,通过RACE PCR的方法获取PSAK的末端序列,经过与EST序列拼接得到PSAK基因的cDNA全长序列。通过特异引物将其克隆在pEASY-T1载体上,基于其氨基酸序列,利用DNAMAN、ExPASy、SWISS-MODEL等工具对其进行生物信息学分析,进行了半定量RT-PCR与RT-qPCR实验来检测其在mRNA水平的组织表达情况。结果:青杄PSAK基因编码140个氨基酸,蛋白分子量为14.23kDa,理论等电点为10.29。蛋白的C端有较为保守的结构域,与拟南芥、烟草等物种具有较高的相似性。PwPSAK主要在青杄的针叶与茎中进行表达。结论:成功获取了PwPSAK的单克隆并进行了生物信息学分析,为青杄中PSAK后续的功能研究提供理论依据。