转基因苜蓿口服疫苗的研究和应用

随着植物转基因技术的成熟,利用转基因牧草生产人或动物可食性疫苗更成为当今研究的热点.苜蓿以其营养价值高,粗蛋白、维生素和矿物质含量丰富,氨基酸平衡、适口性好等优点,成为研制植物口服疫苗最为理想的生物反应器.该文分别从植物口服疫苗的优点、苜蓿的遗传转化技术、外源基因在转基因苜蓿中的表达水平及免疫效果等,介绍国内外以苜蓿作为受体生产植物可食疫苗的研究进展,指出研究中存在的问题,并展望其广阔的应用前景.     

布鲁氏菌rOmp31_(48-74)-BLS重组载体的构建与苜蓿的转化

将布鲁氏菌rOmp3148-74-BLS基因转入紫花苜蓿中苜一号,最终获得转基因苜蓿。本试验利用不依赖于连接反应的克隆(Ligation-Independent Cloning,LIC)方法将布鲁氏菌rOmp3148-74-BLS基因克隆到植物表达载体pJG045上,并利用三亲本杂交的方法转化农杆菌AGL0。最后通过农杆菌介导法将该基因转化紫花苜蓿中苜一号。经PCR鉴定,筛选出转基因苜蓿植株。本试验为今后布鲁氏菌转基因植物疫苗的研发奠定了理论和实验基础。     

转基因苜蓿的研究进展

苜蓿素有"牧草之王"的美称,其作为饲草已有2 000多年历史。近几年,随着转基因技术的发展与应用,苜蓿还被用作生物反应器等。国内外科学家对苜蓿的研究领域越来越广泛,转基因技术在苜蓿中的研究报道也越来越多。综述转基因技术在苜蓿品种改良中的应用,介绍遗传转化方法和苜蓿转基因育种的研究方向,并概述苜蓿转基因育种的优点及其应用前景。     

碱性成纤维细胞生长因子在苜蓿中的表达

为了降低bFGF(basic fibroblast growth factor)的生产成本,结合植物生物反应器的优点,就bFGF在转基因苜蓿中的表达进行了探索.将bFGF插入植物表达载体pBⅡ21中,获得了含有bFGF基因的植物表达pBIcbFGF,再将pBIcbFGF利用冻融法转到农杆菌中.利用农杆菌介导法将基因转化保定苜蓿,转基因苜蓿在TM-1培养基+20 mg/L卡那霉素(Kan)+200 mg/L特美汀(Tim)中诱导分化,在生根培养基中生根,获得再生植株.再生植株通过PCR检测、RT-PCR及Western blot证实外源基因已经在苜蓿中成功表达.获得含有目的蛋白的阳性植株.为苜蓿作为植物生物反应器生产bFGF奠定了理论及技术基础.     

紫花苜蓿UFO基因克隆及转化

紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是多年生豆科牧草。为研究UFO(Unusual Floral Organs)基因相关功能,以紫花苜蓿中苜1号为试验材料,利用PCR技术在紫花苜蓿中克隆出UFO基因。通过DNA重组技术成功构建3302-3flag-UFO植物表达载体,利用农杆菌介导法对紫花苜蓿进行转基因操作,最终获得转基因紫花苜蓿。试验中激素浓度配比与植物表达载体的改良,提高了紫花苜蓿转基因过程中的转化率,而激素种类与配比则影响抗性愈伤的形成与愈伤组织的玻璃化程度。本试验共获得67个抗性愈伤,最终有56个分化成幼嫩紫花苜蓿转基因植株,炼苗入土获得17株转基因植株。遗传转化过程中获得的转基因植株为进一步研究UFO基因功能提供材料。     

沙冬青脱水素基因提高转基因紫花苜蓿的耐旱性

为鉴定转基因紫花苜蓿的耐旱能力,本研究以转基因紫花苜蓿T0代植株为材料,通过干旱胁迫,从转基因植株的表型、生理指标和分子水平等层面检测转基因植株的抗旱特性,试验表明,干旱胁迫后转基因苜蓿和对照的茎、叶片全部干枯,而复水后转基因苜蓿大部分恢复生长,对照几乎全部死亡。干旱胁迫后苜蓿叶片的Pro和MDA含量均随处理时间延长而逐渐增加,转基因植株叶片的Pro含量高于对照,而其MDA含量低于对照植株,且二者均达到了显著差异;转基因苜蓿的离体叶片失水率也明显低于对照。在20%PEG胁迫下,植株体内ProDH和P5CS基因的相对表达量都是先升后降,转基因植株和对照中ProDH和P5CS基因的表达量显著增加,且二者在转基因植株与对照间存在显著差异。这表明,在干旱胁迫条件下,由于AmDHN基因在紫花苜蓿中的过量表达,可能引起植株体内脯氨酸的大量积累,并进一步诱导脯氨酸合成相关基因的表达,最终引起植株抗旱性的提高,因此,推测转基因苜蓿的耐旱性比对照强。     

沙冬青脱水素基因转化紫花苜蓿的耐寒性研究

以紫花苜蓿品种‘中苜2号’为野生型材料,采用农杆菌介导法将沙冬青脱水素基因(dehydrin,AmDHN)导入紫花苜蓿基因组中并获得转基因植株,通过PCR和Southern blot杂交鉴定转基因植株,利用RT-PCR和qRT-PCR检测转基因植株中AmDHN基因及低温胁迫相关基因的表达量,并测定低温胁迫下苜蓿叶片的脯氨酸(Pro)和丙二醛(MDA)含量,从分子水平和生理指标两个层面研究转基因植株的抗寒特性,为进一步获得抗寒性较强的转基因苜蓿新材料提供依据。结果显示:(1)AmDHN基因已整合在转基因苜蓿植株基因组中,而且在不同的转基因株系中AmDHN的表达量也各不相同。(2)低温(4℃)处理后转基因植株中冷胁迫相关基因CBF2、CBF3、ProDH和CAS17的表达量明显高于同期野生对照;CBF2、CBF3和CAS17表达量在冷处理5h后都显著增加并达到最大值,而ProDH表达量在冷处理7d时最高,它们的最高值分别是对照的2.5、4、1.6和3倍左右。(3)苜蓿叶片的Pro和MDA含量均随低温处理时间延长而逐渐增加,转AmDHN基因苜蓿叶片的Pro含量始终高于同期野生型植株,而其MDA含量却始终低于同期野生型植株,且两类植株间差异均在胁迫14d时达到显著水平。因此,推测转AmDHN基因苜蓿中积累的AmDHN蛋白可能对一些酶的活性及膜系统起冷冻保护作用,从而使得转AmDHN基因紫花苜蓿的植株抗寒性提高,同时AmDHN也可能通过调控与低温相关基因的表达间接调节植物的耐低温能力。     

转基因植物疫苗的研究进展

利用转基因植物作为生物反应器生产疫苗是一个新兴的技术领域,它具有生产简便、成本低廉,不需要冷藏和低温运输,安全性好,无外源性病原污染等优点。概述当前转基因植物疫苗的研究进展,并就转基因植物疫苗的作用机理及原理方法进行了介绍。     

AtNDPK2 基因转化敖汉苜蓿及其耐盐性分析

植物核苷二磷酸激酶(NDPKs),属于蛋白激酶家族,参与植物的多种生理生化过程,在植物响应非生物胁迫过程中发挥重要作用。NDPK2基因转化紫花苜蓿,对提高紫花苜蓿的耐逆性具有重要意义。试验以"敖汉"苜蓿下胚轴的再生系统为基础,通过农杆菌介导法将SWPA2驱动的AtNDPK2基因转入紫花苜蓿下胚轴,获得抗性植株。通过PCR初步检测证明该基因已经整合到"敖汉"苜蓿的基因组,阳性植株转化率为23.3%。不同浓度NaCl胁迫测定转基因植株的SOD、POD活性及质膜相对电导率、MDA含量,结果发现在0.4%~1.0%NaCl胁迫下转基因植株的SOD、POD酶活性显著高于对照,相对电导率、MDA含量显著的低于对照,进一步说明AtNDPK2基因的转入增强了"敖汉"苜蓿的耐盐性。     

紫花苜蓿抗旱机制研究进展

紫花苜蓿是我国种植面积最大的人工牧草,具有重要的经济价值和社会效益。干旱是影响紫花苜蓿分布及产量的主要环境因子之一。土壤水分不足可导致紫花苜蓿的形态结构发生一定改变,从而使植株能够更好地适应胁迫环境。同时,苜蓿植株体内可通过一系列生理生化反应来减缓或降低干旱胁迫造成的损伤。近年来,人们对于紫花苜蓿转基因植株的培育以及苜蓿自身胁迫相关基因的研究报道较多。主要对紫花苜蓿抗旱的形态、生理和分子机制等方面的研究结果进行综述和讨论,发现干旱胁迫导致紫花苜蓿植株体内激素含量的变化,影响相应转录因子的活性,从而激活相应的功能基因,引起体内生理生化的变化。建议今后的研究在于阐述紫花苜蓿抗逆应答网络,挖掘更多的基因资源,通过分子育种手段培养高抗性新品种。     

农杆菌介导的苜蓿次级体细胞胚的遗传转化

采用农杆菌菌株GV3101感染子叶期苜蓿体细胞胚来研究苜蓿次级体细胞胚的遗传转化方法。农杆菌菌株GV3101双相载体pCAMBIA2301,此双相载体具有gus报告基因和nptⅡ抗卡那霉素筛选基因。感染的子叶期苜蓿体细胞在75 mg/L卡那霉素筛选压下,经过一系列诱导培养,最终获得转基因植株。然后,通过GUS组织化学定位分析来检测转基因植株不同器官中的GUS表达,并进一步通过PCR和Southern杂交确定转基因的稳定整合和转化率。结果表明转基因植株不同器官均有GUS表达,整合的nptⅡ基因的拷贝数是1~4,获得的转基因植株的转化率是65.82%。     

Improvement of transgenic alfalfa by backcrossing

Summary Two regenerative alfalfa genotypes were transformed withAgrobacterium tumefaciens with binary vectors containing the coding sequences for ?-glucuronidase (GUS) and npt II (kanamycin resistance). The regenerative genotypes and their transgenic populations were agronomically inferior, and one was a somaclonal variant for flower color. GUS was used as a dominant genetic marker in a model system for studying backcrossing to improve transgenic alfalfa. Agronomic yield deficiencies and somaclonal changes were corrected by one to three backcrosses to cultivar genotypes, depending on the vigor of the original transformant. Three backcrosses were considered optimal because progeny contain 94% cultivar germplasm and could be used as parents of a new cultivar. Use of different cultivar genotypes each generation of backcrossing minimized inbreeding and maximized the heterotic potential of backcross derivatives. The improvement of transgenic alfalfa by backcrossing using a dominant marker required only as much time as the original transformation experiment.     

Minimizing the time and cost of production of transgenic alfalfa libraries using the highly efficient completely sequenced vector pPZP200BAR

Alfalfa is the most important forage legume worldwide. However, similar to other minor forage crops, it is usually harvested along with weeds, which decrease its nutrient quality and thus reduce its high value in the market. In addition, weeds reduce alfalfa yield by about 50 %. Although weeds are the limiting factor for alfalfa production, little progress has been made in the incorporation of herbicide-tolerant traits into commercial alfalfa. This is partially due to the high times and costs needed for the production of vast numbers of transgenic alfalfa events as an empirical approach to bypass the random transgenic silencing and for the identification of an event with optimal transgene expression. In this focus article, we report the complete sequence of pPZP200BAR and the extremely high efficiency of this binary vector in alfalfa transformation, opening the way for rapid and inexpensive production of transgenic events for alfalfa improvement public programs.     

Biotechnological advancements in alfalfa improvement

Review of biotechnology research in alfalfa shows that molecular techniques are extensively being used for basic and applied research toward alfalfa improvement. Biotechnological approaches have been used in two major areas, genomics and transgenics. In genomics, molecular markers, structural and functional genomics allowed identification of genes of interest and their regulatory components. Alfalfa being obstinate to genetic and genomic analysis, comparative genomics is used for molecular and genetic dissection of various plant processes in alfalfa. Alternatively, transgenic approach involves incorporation of specific and useful genes into alfalfa to improve the traits of interest. Input traits to improve agronomic performance and output traits to improve forage quality, or to produce novel industrial/pharmaceutical proteins, are the focus of current transgenic research in alfalfa. However, transgenic approach is controversial requiring cautious experimental design to combat bioisafety concerns. Ideally, forage alfalfa needs to possess more fermentable carbohydrates, proteins with balanced amino acid profile that degrade slower in rumen, improved winter hardiness, better water use efficiency, pest resistance and no anti-quality factors. Concerted efforts are required to bring together maximum of these characteristic features into the alfalfa plant.     

根癌农杆菌介导的黄瓜转基因研究进展

黄瓜Cucumis sativus是世界性的重要蔬菜作物。农杆菌介导的转基因技术是研究植物基因功能及品种改良的重要手段。为进一步加快黄瓜的转基因研究和育种进程,文中针对农杆菌介导的黄瓜遗传转化方法,从黄瓜再生能力的影响因素、遗传转化条件和过程中各类添加物质等方面,阐述了根癌农杆菌介导的黄瓜转基因研究进展及存在的问题,并对提高黄瓜遗传转化效率和安全筛选标记的应用等前景进行了展望,以期为黄瓜抗逆育种和果实品质改良等研究提供参考。     

根癌农杆菌介导的苜蓿悬浮胚性愈伤遗传转化体系的建立与优化

苜蓿基因型是限制遗传转化的关键因素之一。本实验通过对7种苜蓿胚性愈伤组织诱导,筛选出一份具有高频再生潜力的基因型公农-1号,并以该基因型为转化平台探索和建立了一套高效的苜蓿遗传转化系统。分析了影响农杆菌共培养转化苜蓿悬浮胚性愈伤的因素,优化了悬浮培养条件,建立的超声波辅助农杆菌介导苜蓿胚性愈伤的遗传转化系统为：以下胚轴诱导的愈伤组织经悬浮培养得到的胚性愈伤为转化材料,乙酰丁香酮为100 μmol·L^-1、超声波处理时间8 s、卡那霉素筛选浓度30 mg·L^-1、共培养4 d,接种于选择培养基上进行筛选和再生。最终,获得了大量的转基因植株,分子检测证实目的基因-角碱蓬液泡膜型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因已经整合到苜蓿基因组中。     

转基因作物将为我国农业发展注入新动力

随着基因组学研究和生物技术的不断突破,应用生物技术改良农作物品种正成为引发新的农业技术革命的关键。由于转基因品种在生产上表现出的巨大效益,其研发和产业化在全球迅猛发展,并逐渐成为世界各国抢占的生物技术制高点。本文从转基因技术的内涵、国际转基因作物的研发态势、我国转基因作物的研发和产业化现状等方面进行阐述,探讨了大力发展转基因作物对于解决我国目前农业生产上面临的挑战、保障我国粮食安全和农业可持续发展的重要意义。