含A蛋白金黄色葡萄球菌菌株比较和培养基的选择

自发现金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)借Fc段与I_gG结合的功能以来,除用协同凝集和吸收试验作受检细菌或病毒分型、检出I_gM、I_gA抗体以外,还结合A蛋白同位素或荧光素标记、A蛋白标记红细胞或标记塑料平皿等技术,广泛用于微生物学、免疫学以及细胞表面抗原分析等方面的实验研究。这些研究均需SPA菌液或纯品A蛋白。近年来,我们在自制SPA菌液过程中,就不同菌株和培养基作了一些比较试验。现将比较结果报道如下。     

葡萄球菌A蛋白

金黄色葡萄球菌的细胞壁含有三种主要成份:核糖醇磷壁酸、粘肽及A蛋白(SPA)。因A蛋白具有能与免疫球蛋白的Fc段相结合的特性,已广泛应用于细菌、病毒等病原诊断、分型(如肺炎双球菌和链球菌的分型)、免疫球蛋白提取和测定、细胞的分离、分析淋巴细胞表面结构及免疫理论研究等方面,并具有广泛的应用前途。     

葡萄球菌A蛋白基因的克隆及其IgG受体区新型表达载体的构建

旨在克隆SPA基因并将该基因的IgG结合区亚克隆至毕赤酵母表达载体中。以金黄色葡萄球菌CowanI菌株基因组为模板,对葡萄球菌A蛋白(SPA)基因全长序列进行PCR扩增,再将PCR产物克隆入pMD18-T质粒,将DNA测序所得的结果用Blastn软件进行在线同源比对,经鉴定为SPA基因序列后,在线对其进行功能区域(IgG-Fc受体区)的预测,将该区域亚克隆入表达载体pPICZaA。结果显示,从CowanI菌株中成功地扩增到SPA基因,与NCBI中公布的序列同源性高达97%,同时构建了IgG-Fc受体区新型的表达载体     

葡萄球菌蛋白A活性机制与现代应用

葡萄球菌蛋白A(staphylococcus protein A,SPA)是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)细胞壁上的一种黏连蛋白.经过几十年的研究,由于其对免疫球蛋白IgG的亲和特性,SPA已作为一种工具在抗体的检测、纯化以及疾病诊断中得到了广泛应用.SPA衍生物的构建适应了现代生产的需要,改造后的SPA可以与多种报告分子相偶联,使得免疫诊断更加快速准确.本文综述了SPA基于其免疫学特性,在抗体纯化和现代免疫分析应用中的发展状况及前景.     

金黄色葡萄球菌表面蛋白研究进展

金黄色葡萄球菌是一种常见的人兽共患病的病原菌。通过其表面蛋白(黏附素)与宿主的细胞外基质结合感染宿主,这些蛋白的结构已从分子水平上得到揭示。本综述了金葡菌产生的表面蛋白及其主要蛋白的分子结构。     

金黄色葡萄球菌蛋白A串联Z结构域的表达、纯化及其亲和填料制备

目的构建金黄色葡萄球菌蛋白A(Staphylococcal Protein A,简称SPA或蛋白A),串联Z结构域的重组表达克隆,并实现在大肠杆菌中诱导表达,随后纯化获得重组蛋白,制备亲和填料.方法对目的基因进行元和表达的密码子优化,利用PCR扩增方法获得SPA的3个串联Z结构域,并在蛋白的N端加入组氨酸标签.将优化后的基因序列克隆到p ET43.1a(+)表达载体上,获得p ET43.1a(+)-SPA-3Z重组质粒;测序正确的重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3),IPTG诱导表达,通过亲和层析方法纯化表达的重组蛋白,并使用SDS-PAGE鉴定表达蛋白.将纯化获得的SPA纯品偶联到经环氧氯丙烷活化的Sepharose 6B Fast Flow凝胶上.使用兔多抗和腹水单抗对填料进行验证.结果成功构建p ET43.1a(+)-SPA-3Z克隆,纯化的SPA蛋白纯度高.成功将重组SPA偶联到经环氧氯丙烷活化的Sepharose 6B Fast Flow凝胶上.制备的填料在0.1mol/L的Na OH溶液里浸泡30小时,填料亲和性能未见明显变化,这为填料的长期使用提供了可能.将该填料用于抗体纯化,湿胶的多抗结合量可达22.7mg/ml,纯化的腹水单抗纯度在98%以上.结论本研究为SPA的大规模制备提供了基础.     

葡萄球菌A蛋白基因

<正>金黄色葡萄球菌A蛋白是一种细胞膜成分,据报道分子量约为42000。此蛋白有伸展的形态,而且顺序分析已揭示出在其分子中有两个功能独特区。N-端分子量为27000,由四种连续的高度同源的IgG结合单位组成,每一单位分子量大约7000。C-端分子量为15000,是一个能共价结合多糖肽而无结     

葡萄球菌蛋白A免疫粘附法检测单纯疤疹病毒抗原

本文用葡萄球菌蛋白A(Staphylococcal Protein A,简称SPA)免疫粘附法快速检出单纯疱疹病毒抗原。试验观察了正常人角膜上皮细胞、兔角膜上皮细胞及来感染的传代细胞(Vero细胞等)对SPA的反应。同时,对单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)实验感染性角膜炎的家兔,用SPA免疫粘附法与病毒分离培养法做了对照观察,并对临床诊断为单纯疱疹病毒性角膜炎的患者做了初步观察。结果表明,SPA免疫粘附法特异、简便,适合基层实验室应用。     

金黄色葡萄球菌超抗原肠毒素临床应用研究进展

金黄色葡萄球菌肠毒素(staphylococcal enterotoxins,SEs)是由金黄色萄萄球菌产生的一类典型超抗原(Superantigen,SAg)。与传统抗原不同,超抗原无须经抗原提呈细胞(Antigen presenting cell,APC)加工处理,可直接与主要组织相容性复合体II类分子(Major histocompatibility complex class II molecules,MHC II)及T细胞受体Vβ区(Variable pacts of the T cells receptor,TCR Vβ)特异性结合,极低浓度即可刺激大量T细胞增殖,产生大量有生物学活性的细胞因子(如TNF-α、TNF-β、IFN-γ、IL-2等)和抗肿瘤效应。本文综述了近年来超抗原金葡球菌肠毒素在恶性肿瘤的临床应用、存在问题和解决策略等的进展,针对Trousseau综合征利用超抗原开发新药进行了展望,并介绍了SEC2在临床用于骨病治疗的情况。     

含A蛋白葡萄球菌的变异及分泌型A蛋白

金黄色葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal Protein A或SpA)由于能与大多数哺乳动物血清IgG发生假免疫反应(Pseudoimmune reaction),产生非特异性结合而受注目。自1958年Jensen的工作开始,SpA的研究已有近三十年的历史。作为一种免疫化学试剂SpA已广泛应用于各种免疫学检测技术,IgG及其亚类纯化技术及组织化学研究等方面;在临床方面,SpA在肿瘤治疗上的初步结果令人鼓舞。近年来,一些研究者致力于SpA的变异研究,开拓了SpA研究的新领域,为     

重症监护病房金黄色葡萄球菌耐药性与流行病学分析

为了解重症监护病房感染金黄色葡萄球菌的耐药性及流行状况,收集重症监护病房2007年9～12月临床分离的金黄色萄萄球菌42株,纸片扩散法检测其对10种抗生素的耐药率,随机引物扩增PCR(Ran- dom amplified polymorphic DNA,RAPD)检测其流行状况。42株金黄色葡萄球菌对氨苄西林的耐药率最高,没有检测到对万古霉素耐药的金黄色葡萄球菌。35株金黄色葡萄球菌为耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MR- SA),7株为甲氧西林敏感的葡萄球菌(MSSA),除万古霉素外,MRSA对其他9种抗生素的耐药率比MSSA高,42株金黄色葡萄球菌经RAPD分型分为5个基因型,其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型分别占31.0%、38.1%、14.3%、9.5%、7.1%。重症监护病房临床金黄色葡萄球菌分离株对多种抗生素具有高耐药性,其感染基因型以Ⅰ、Ⅱ型为主。     

快速检测金黄色葡萄球菌肠毒素A基因方法的建立与应用

目的建立一种快速准确定量检测金黄色葡萄球菌肠毒素A的方法。方法以femB、SEA基因分别作为金黄色葡萄球菌菌株、肠毒素A的靶序列,设计合成引物和TaqM an探针;收集腹泻患者大便标本分离的金黄色葡萄球菌68株,并定量检测其肠毒素A。结果TaqM an探针荧光聚合酶链反应检测金黄色葡萄球和肠毒素A的灵敏度均为1.0×102拷贝。68株金黄色葡萄球菌中检出产肠毒素A菌株11例(16.2%,11/68),CT值为13.5~20.6。结论TaqM an探针荧光聚合酶链反应能够准确快速检测金黄色葡萄球菌肠毒素A。     

抗金黄色葡萄球菌单链抗体(scFv)的原核表达及蛋白纯化

旨在将来源于鸡的金黄色葡萄球菌单链抗体(scFv)进行原核诱导表达,获得有抗体活性的目的蛋白。构建含有目的抗体基因的重组质粒,将此质粒进行原核诱导表达并鉴定所获得蛋白的生物活性。结果显示,(1)成功构建了含有金黄色葡萄球菌单链抗体(scFv)的重组质粒p Cold I-scFv,质粒成功转化到大肠杆菌表达菌株中;(2)经过诱导表达后,目的蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀中;(3)使用4 mol/L尿素成功地将包涵体变性溶出;(4)通过柱层析法及透析法获得了纯化及复性效果较好的目的蛋白;(5)间接ELISA鉴定证实所获蛋白具有金黄色葡糖球菌抗体活性。通过质粒构建及原核诱导表达、包涵体溶出和复性等步骤,最终获得了有金黄色葡萄球菌抗体活性的目的蛋白。     

金黄色葡萄球菌RNaseH Ⅰ、RNaseH Ⅱ和RNaseH Ⅲ突变菌株的构建及功能研究

目的:在金黄色葡萄球菌中分别构建RNaseHⅠ、RNaseHⅡ和RNaseHⅢ的突变菌株,并研究它们在金黄色葡萄球菌中的生物学功能。方法:利用同源重组的方法在金黄色葡萄球菌中分别构建RNaseHⅠ、RNaseHⅡ和RNaseHⅢ的插入突变菌株,检测突变株生长速度、溶血活性及外分泌蛋白表达水平与野生型的差异,进一步通过流式细胞术检测突变株外分泌蛋白细胞毒性的改变,同时在体外检测突变株在全血中的存活能力。结果:构建了金黄色葡萄球菌RNaseHⅠ、RNaseHⅡ和RNaseHⅢ的插入突变菌株;表型检测结果显示,与野生型菌株相比,3种突变株的生长速度减慢,溶血素和外分泌蛋白明显减少;流式细胞术检测结果显示3种突变株毒性比野生型菌株减弱;全血杀伤实验结果显示3种突变株在全血中的存活率低于野生型菌株。结论:RNaseHⅠ、RNaseHⅡ和RNaseHⅢ在金黄色葡萄球菌生长繁殖、毒素产生和侵袭机体的过程中有重要作用,它们可能与金黄色葡萄球菌的致病性相关。     

SPF大鼠感染金黄色葡萄球菌原因的调查分析

目的连续监测某实验动物饲养场SPF大鼠携带的金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus(SA)情况,结合该饲养场环境、人员等检测结果,查找污染源,为保障和提高实验动物质量提供依据。方法2011—2017年依据《实验动物金黄色葡萄球菌检测方法(GB/T 14926.14-2001)》对SPF大鼠进行SA监测,并采集饲养环境和饲养人员的样本进行检测。对所有分离的SA菌株应用金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)基因分型和脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型,分析污染源。结果35份SPF大鼠检出16株SA,检出率45.71%;18份饲养环境和饲养人员样本检出2株SA,检出率11.11%。SPA分型可分成5个型别,T2360为优势型别,主要由2013年和2017年SPF大鼠中的菌株组成。PFGE有5种带型,SA4为主要带型。饲养环境中SA的PFGE带型与2017年SPF大鼠中的完全一致。结论饲养环境中存在的SA与SPF大鼠感染的SA具有紧密联系。     

金黄色葡萄球菌滤液制剂中肠毒素的检测研究

使用反向被动血凝试验(RPHA),对金黄色葡萄球菌滤液制剂中的肠毒素(SET)进行了检测研究.证明已生产和临床应用近10 a的金黄色葡萄球菌滤液制剂中检测到SET存在.其型别系属SET中的C型.按原生产工艺所生产的金黄色葡萄球菌滤液制剂原液中SET的含量在12.5～50 mg/L.生产时欲提高SET含量的条件试验中证实,使用葡萄球菌产毒的胰酪胨综合培养基,以摇瓶方式培养24～36 h,可使SET含量比用生产培养基培养提高16倍.金黄色萄萄球菌滤液制剂中SET的成分是极其稳定的,室温存放2 a未见该成分降低.其半衰期可达4 a.在采用RPHA和RPLA检测SET比较试验中证明:RPLA试剂的敏感性高于RPHA的4倍.但对于检测金黄色葡萄球菌滤液制剂中SET的实际含量几乎是相等的.     

冬凌草甲素对金黄色葡萄球菌生物膜的抑制机制

【背景】金黄色葡萄球菌是一种常见的食源性致病菌,易在食品及加工器具表面形成生物膜,引起食品腐败和疾病的传播,威胁食品安全。【目的】研究冬凌草甲素抑制金黄色葡萄球菌生物膜形成的作用机制。【方法】使用结晶紫染色法和扫描电镜观察冬凌草甲素对金黄色葡萄球菌生物膜形成的抑制作用,刚果红平板法定性检测冬凌草甲素对细胞间多糖黏附素(polysaccharideintercellular adhesion,PIA)合成的影响,分光光度法测定冬凌草甲素对供试菌株胞外DNA (eDNA)释放量的影响,RT-PCR技术检测冬凌草甲素对供试菌株ica A、cid A、agr A和sar A基因表达量的影响。【结果】冬凌草甲素对金黄色葡萄球菌生物膜形成有较强的抑制作用;冬凌草甲素能显著抑制PIA的合成,且呈浓度剂量依赖;冬凌草甲素能抑制供试菌株e DNA的释放量,其中1/4最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)的冬凌草甲素作用金黄色葡萄球菌16 h后,与对照组相比,e DNA的释放量降低了48.62%;冬凌草甲素可显著抑制金黄色葡萄球菌生物膜形成相关基因的表达,其中1/2MIC的冬凌草甲素作用金黄色葡萄球菌16 h后,ica A、cid A、agr A和sar A基因的表达量分别比对照降低了91.6%、94.7%、77.6%和70.4%。【结论】冬凌草甲素通过抑制ica A和cid A基因的表达,影响PIA的合成和eDNA的释放,进而干预生物膜的形成。     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的分子流行病学研究

了解我院患者耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的分子流行病学特点,为临床抗感染治疗提供依据。收集2007年1月~2008年9月我院分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌共54株,采用PCR进行SCCmec基因分型、葡萄球菌A蛋白（SPA）分型,并检测杀白细胞毒素（PVL）基因,同时应用脉冲场凝胶电泳（PFGE）进行同源性分析。54株MRSA菌株SCCmec基因分型为SCCmecⅡ型17株,SCCmecⅢ型33株,SCCmecⅣ型2株,SCCmecⅤ型2株;SPA基因分型将28株归属为t030,9株为t002,8株为t037,5株为t570,2株为t437,t163和t796各1株;PVL毒素检测只有2株SCCmecⅣ型菌株阳性;PFGE证实院内MRSA感染主要为2种克隆株传播,同时还有其他型别出现。本院MRSA流行传播的SCCmec基因型主要以Ⅲ型占优势,同时发现有携带PVL毒素的CA-MRSA分离株流行,应引起密切关注。     

用基因克隆技术制造A蛋白

A蛋白(Protein A)原来是从致命性金黄色葡萄球菌的细胞外壳提取的。由于细菌的致病性,A蛋白的生产过程很不安全。最近,Repligen公司成功地用大肠杆菌表达了A蛋白的基因,并在该基因上接加了一个启动子,使产量提高。     

SPA-IgG直接免疫荧光菌团法应用于志贺氏菌的检定

本文利用金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)所具有的与人和多种哺乳动物IgG的Fc段非特异结合的特性,和免疫荧光技术相结合,对SPA结合志贺氏菌抗血清的IgG,以及异硫氰酸荧