毛白杨PtSEP3-1基因启动子的克隆分析及其表达载体构建

SEP(SEPALLATA)类基因属于花器官发育ABCDE模型中的E类基因,拟南芥中的研究表明该类基因可能具有控制花器官形态发育以及激活其它类型基因的功能,是一类花发育过程中的关键基因。因此,研究杨树SEP类基因启动子表达特性对于杨树的开花调控研究具有重要意义。本文根据毛白杨SEP3基因和毛果杨基因组序列设计引物,通过PCR获得了PtSEP3-1基因上游2000bp的序列。序列分析结果表明该序列具有启动子的基本元件TATA-box和CAAT-box,还包含大量光响应元件ACE、Box I和Box4等,此外还有脱落酸响应元件ABRE,赤霉素响应元件GARE-motif以及胁迫响应元件HSE、TC-richrepeats等。进一步构建了一个以PtSEP3-1启动子驱动GUS基因的植物表达载体pPtSEP3-1protest,为该启动子的功能鉴定奠定了基础。     

马铃薯淀粉合成酶融合基因植物表达载体构建

通过反义抑制马铃薯(Solanum tuberosum L.)块茎淀粉合成酶GBSS、SSⅡ和SSⅢ基因的表达,可降低淀粉中直链淀粉含量和改变分支链的长度,从而降低马铃薯淀粉糊化温度、改善其抗凝沉性。依据GBSS、SSⅡ和SSⅢ基因的cDNA序列分析,从各基因中筛选和克隆了一段同源性极低、约500~600bp的片段;通过PCR技术实现了3个片段的融合,得到了1671bp的融合基因GS2S3;将GS2S3反向连接在GBSS5′侧翼序列之后,构建了由GBSS5′侧翼序列驱动的GS2S3反义基因的植物表达载体pBI-GS2S3,并进行了初步转化。     

玉米蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因的克隆及表达载体的构建

利用RT-PCR方法从玉米幼苗叶片总RNA中克隆出玉米的蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因的全长cDNA片段。该片段与文献报道的序列具有99%的同源性。并分别构建了以双CaMV35S为启动子,以Tnos为终止子的植物双元表达载体PBISPS和以Pcab为启动子,以T35S为终止子的植物表达载体PBSPS,其中PBISPS含有NPTⅡ选择标记基因,PBSPS不含选择标记基因。     

毛白杨纤维素合成酶基因（PtoCesA1）克隆及正义植物表达载体的构建

以毛白杨形成层为材料克隆了毛白杨纤维素合成酶基因（PtoCesA1）,序列分析表明该基因序列为3215bp, 与欧洲颤杨的PtCesA1基因同源性为97% 具有开放的阅读框,编码区在52~2985碱基之间,编码区为2925bp。通过同义突变引入BamHI酶切位点,将全长基因克隆到植物表达载体pBI121中,经酶切和PCR鉴定确认载体构建正确,为下一步ptoCesA1转基因功能研究打下了基础。     

植物纤维素合成酶基因和纤维素的生物合成

纤维素地球上最丰富的生物大分子和最重要的可再生资源,1996年克隆了第一个植物纤维素合成酶基因,植物纤维素的生物合成需要多个纤维素合成酶与其他相关酶如Korrigan纤维素酶,蔗糖合成酶等来共同完成。本文介绍了植物纤维素合成酶基因和纤维素的生物合成途径及其相关基因如蔗糖合成酶基因、KORRIG-AN基因等研究进展。     

拟南芥psy基因cDNA的克隆及其植物表达载体的构建

为了获得胚乳组织特异性表达八氢番茄红素的转基因小麦,以拟南芥幼叶RNA为模板,由特异型引物通过RT-PCR一步法得到大小约为1.3kb的基因片段,将此片段连接在克隆载体pMD18-T进行测序,结果表明,该基因片段为八氢番茄红素合成酶基因(psy)cDNA片段。将psy基因片段正向插入植物表达载体pLRPT中高分子量麦谷蛋白亚基基因1Dx5启动子与nos终止子之间,pLRPT载体无1Dx5基因开放阅读框,运用菌落PCR对重组子进行筛选与鉴定,说明拟南芥psy基因已正确插入pL-RPT,成功构建了植物表达载体pLRPTPSY。     

毛白杨COMT基因cDNA的克隆、序列与特异性表达分析

Ｌｉｇｎｉｎｉｓａｎａｂｕｎｄａｎｔｎａｔｕｒａｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｎｌｙｓｅｃｏｎｄｔｏｔｈｅｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ,ａｓａｃｅｌｌｗａｌｌｃｏｍｐｏｎｅｎｔｏｆａｌｌｖａｓｃｕｌａｒｐｌａｎｔｓｉｎｂｉｏｓｐｈｅｒｅ .Ｄｅｓｐｉｔｅｉｔｓｉｍｐｏｒｔａｎｔｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓｉｇ ｎｉｆｉｃａｎｃｅｉｎｐｌａｎｔｓ ,ｌｉｇｎｉｎｉｓａｎｕｎｄｅｓｉｒａｂｌｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔｉｎｔｈｅｃｈｅｍｉｃａｌｐｒｏｃｅｓｓｏｆｐａｐｅｒｐｕｌｐｉｎｇ ,ａｎｄｉｔｈａｓｎｅｇａｔｉｖｅｉｍｐａｃｔｏ…     

云南红豆杉紫杉烯合成酶基因克隆、序列分析与植物表达载体的构建

利用分段RT—PCR法成功地从云南红豆杉叶片总RNA中分离出两条长约1．4kb和1．5kb的cDNA片段,克隆到pUCm—T载体中,序列拼接分析表明,该cDNA片段与Wildung MR等发表的紫杉二烯合成酶基因编码区2586bp有41个核苷酸不同,同源性为98．42％,具有编码862个氨基酸蛋白质的能力．为了检测所克隆的基因编码产物是否具有活性,并进一步制备抗体以便于将来转基因植物的检测,构建了一个酵母表达载体GAPA-T14;为了转化植物构建了两个具有不同启动子的植物表达载体,pBI121-T14(含35S启动子)和pBIH-T14(在pBI121的基础上以胶乳特异启动子取代35S启动子)．     

AtAAPT1基因RNAi的植物表达载体的构建

以拟南芥中氨基乙醇磷酸转移酶基因AAPT1作为RNA i的靶向序列,采用RT-PCR的方法获得目的DNA片段。然后以pBS-T-AAPT1载体为基础,构建了由35 s启动子调控的AAPT1基因RNA i的植物表达载体pART27-AAPT1(1,2),并通过电击法将重组质粒导入根癌农杆菌C58中。AtAAPT1基因RNA i的植物表达载体的构建对于研究AAPT1基因的功能和应用具有重要的理论价值。     

麦冬OjRCA基因植物表达载体的构建

Rubisco活化酶(RCA)对光合关键酶Rubisco具有重要的调节作用.以植物表达裁体pBI121为基础,设计分别带有酶切位点Sma Ⅰ和Sac Ⅰ的一对特异引物,以麦冬叶片总RNA反转录得到的第一条cDNA链为模板,扩增得到目的基因OjRCA.用Sma Ⅰ和Sac Ⅰ双酶切目的基因及表达载体pBI121,回收后利用T4DNA连接酶连接,获得植物表达载体pBI121-OjRCA.通过冻融法将所获得的植物表达裁体导入根癌农杆茵EHA105菌株中,为该基因的功能鉴定及通过农杆菌介导法将OjRCA基因导入植物提高相关抗性提供参考.     

海藻糖合酶基因的克隆及其植物表达载体的构建

以担子菌灰树花的菌丝体中提取总ＲＮＡ,并纯化出ｍＲＮＡ,ｍＲＮＡ经反转录合成ｃＤＮＡ第一链,以ｃＤＮＡ第一链为模板经ＰＣＲ扩增海藻糖合酶（Ｔｓａｓｅ）基因,获得一长约２．２ｋｂ的片段,把该片段连接一ｐＧＥＭ－Ｔ－ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ上进行测序,其全长共２１９９ｂｐ。随后将此片段以正向插入植物表达载体ｐＢＩ１２１的ＨｉｎｄⅢ＋Ｘｂａｌ位点构建ｐＵＢ,再把海藻糖合酶基因以正向插入载体ｐＵＢ的ＢａｍＨ     

番木瓜环斑病毒复制酶(亚基)基因的克隆、序列分析及其植物表达载体的构建

近二年报道,在TMV^⑴、PVX^⑵、PEBV^⑶和CMV^⑷等病毒中,利用病毒编码的复制酶(亚基)基因或相关cDNA片段转化烟草,工程植株获得绝对或极高的病毒抗性。大量研究认为：马铃薯Y病毒组的核内含体大分子量蛋白(Nib)是依赖于RNA的RNA复制酶(或核心亚基),Nlb与上述病毒的复制酶有广泛的同源保守区^⑸。因此,Nib基因的克隆,不但在植物抗病基因工程方面,而且在马铃薯Y病毒组基因组的复制研究方面．均有重要的意义。本文以马铃薯Y病毒组的重要成员番木瓜环斑病毒的华南强株系(PRSV—sM)为材料,克隆了PRSV的Nib基因,并完成其全序列测定和植物表达载体的构建,为探索马铃薯Y病毒组复制酶可能介导的抗病性打下了基础。     

花生白藜芦醇合酶基因cDNA的克隆及植物表达载体的构建

为得到含有白藜芦醇合酶cDNA(RS cDNA)并能表达白藜芦醇(Res)的转基因植物,以花生为材料,从其根部提取基因组DNA,并以其为模板,利用引物悬挂延伸PCR法扩增得到大小约1200bp的片段,将这个片段连接到克隆载体PBS-T上进行测序,测序结果证明,此片段就是花生的RS cDNA。将此片段再正向插入到植物表达载体PBI121的CaMV35s启动子和NOS终止子之间,对重组子进行筛选与鉴定,证明花生的RS cDNA已经正确插入PBI121中,成功的构建了植物表达载体PBI121L。     

蝴蝶兰LFY基因克隆及高效植物表达载体的构建

根据NCBI中蝴蝶兰LFY花序分生组织基因序列设计2对引物,用RT-PCR法从蝴蝶兰花芽中扩增出LFY基因,对扩增产物进行克隆和测序.结果表明,获得的蝴蝶兰LFY基因约为1500 bp,与报道序列同源性达98.71％.将LFY基因插入pRI101-ON载体中,经PCR、双酶切及测序鉴定,证实重组表达质粒中含有目的片段,表明成功构建了高效植物表达载体pRI1O1-LFY.     

10kD玉米醇溶蛋白基因的克隆与植物表达载体构建

由于紫花苜蓿中的含硫氨基酸水平很低,采用基因工程手段将富硫蛋白基因-10kD玉米醇溶蛋白(zein)基因转入苜蓿中以提高其水平。根据该基因的保守序列设计引物,并在下游引物终止密码子前引入内质网驻留蛋白信号序列(KDEL),通过PCR技术从玉米(Zea mays L.)黄化幼苗基因组中扩增目的基因的开放阅读框(ORF)。序列测序得到全长为465bp的目的片断,该片段编码154个氨基酸,其中甲硫氨酸(M)31个占20.13%,半胱氨酸(C)6个占3.90%,含硫氨基酸共占24.03%。该基因与报道的10kD玉米醇溶蛋基因具有很高的同源性。将该基因构建到植物表达载体pCAMBIA13011上,以转化紫花苜蓿提高其含硫氨基酸的水平。     

大白菜orf224基因植物表达载体的构建及遗传转化

为了创制新的大白菜雄性不育材料,双酶切重组质粒pMD18-T-CMS7311-orf224和表达载体pWR306后,将CMS7311-orf224基因与线性表达载体pWR306进行定向连接,构建了细胞质雄性不育线粒体基因CMS7311-orf224的植物表达载体pWR-CMS7311-orf224,通过酶切和PCR验证pWR-CMS7311-orf224载体构建正确.采用快速冻融法,将表达载体导入农杆菌EHA105,转化大白菜材料06J28,对转化植株的GUS、PCR和RT-PCR检测表明,获得了2个大白菜转基因植株.     

二氢黄酮还原酶基因的克隆与转基因烟草的获得

以蒺藜苜蓿(Medicagotrunctulacv.5160)幼果总RNA为模板,采用RT-PCR技术克隆到二氢黄酮还原酶(DFR)基因的cDNA序列,所获得的cDNA序列全长1018 bp,具有完整的ORF,编码337个氨基酸。Blast分析表明,该片段与GenBank中注册的DFR基因同源性为99.80%。以植物表达载体pBI121为基础,构建了Ca MV35S启动子驱动的DFR基因植物表达载体pBIDFR;采用直接转化法将pBIDFR导入根癌农杆菌EHA105,用该菌株对普通烟草进行遗传转化获得6株转基因植株。