在中空纤维细胞培养系统内用无血清培养基生产单克隆抗体

用1640SFM无血清培养基在VF－2中空纤维细胞培养系统内培养7E8杂交瘤细胞,最大活细胞密度为2．34×10⁶／ml,该活细胞密度分别是转瓶培养和静态瓶培养结果的3．7倍和2．2倍。培养42天共收获7E8细胞培养液10000ml,其单克隆抗体(简称单抗)的ELIsA效价为1:20000左右,该效价是转瓶培养和静态瓶培养结果的25倍。ID。0mI培养液经50％饱和硫酸铵盐析和sephadex G-200柱层析提纯,获纯化单抗IgG 51．82mg。该系统平均每天生产单抗12．3mg。研究结果表明;在中空纤维培养系统内用无血清培养基培养杂交瘤细胞的方法可望用于体外大规模生产单抗。     

杂交瘤细胞培养的优化

根据杂交瘤细胞培养中单克隆抗体生产的动力学原理,采用灌注培养方式、添加醋酸钾和丰富营养物培养的途径,对反应器放大培养过程进行了优化。每天灌注l／2反应器工作体积,与分批培养相比,细胞密度由4 5×10⁵／ml提高到l1×10⁵／ml,单抗浓度由19mg／L提高到28mg/L;添加1g／L醋酸钾,细胞密度基本保持不变．但单抗浓度增加到38μg／ml;用丰富营养物培养后,细胞密度和单抗浓度分别进一步提高到42×10⁵／ml和94mg/L。抗B型红细胞单抗的血凝滴度,由分批培养的1：32．最终提高到l：256     

抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体的制备及特性

用杂交瘤技术制备了5株产生抗黄曲霉毒紊B₁单克隆抗体的杂交瘤细胞株。对其中之一AFB1－2H8进行了较系统的研究。AFB1一2H8属IgC3。纯化腹水抗体效价约5×10⁶。ELISA检测标准毒素的线性范围为0．5～50ng／ml。最低检出量为0．01ng／ml。该单抗与参试的其它黄曲霉代谢物的交叉反应系数为0～0．21,该抗体有较大的应用价值。     

微囊化杂交瘤细胞培养的基础应用研究

本文探讨了海藻酸钠的结构组分对微囊强度的重要作用。提出了微囊化批量生产中估算活细胞的方法以及影响满囊比的主要因素等a制备微囊的成功率达到95％以上,满载率可达95％。微囊化杂交瘤细胞在静态培养6—10天后,细胞浓度为8．8×10⁶～2．1×10⁷ceIl／ml微囊。单抗浓度为379μg／m1微囊。微囊化产物经SDS电泳呈现一条或两条蛋白带,表明单抗纯度较高。     

抗人PAI－1单克隆抗体制备、鉴定和应用

以重组PAI－（rPAI－1)为抗原,通过杂交瘤技术获得6株阳性杂交瘤细胞(Apl、AP2、AP3、AP4、AP5和AP6),并用SPA亲和层析纯化了抗Pal－1单克隆抗体(McAb)。所有McAb均能识别rPAI和天然PAI－1,腹水滴度均为10　6以上。6种McAb对PAI－1亲和常数在3．45×10⁷--1.05×10⁹mol／L之间。AP2、AP3McAb能完全抑制PAI－1活性,AP4、AP和AP6只能部分抑制PAI－1活性,Apl则不抑制PAI-1活性。6种McAb中只有Apl、AP4和AP5能识别Pal－1／t－PA复合物。利用Apl、AP3、和AP4 McAb制备免疫亲和柱一步纯化HepG2细胞分泌的PAI－1,纯度大于98％,回收率92％,纯化倍数51倍。利用抗PAI－1 McAb建立了夹心法ELISA,测定了人血浆PAI－1水平,正常人血浆PAI－1平均含量(X士D)为24．7±7．75ng／ml。     

葡萄糖的添加对昆虫细胞Sf21悬浮生长的影响

添加葡萄糖对昆虫细胞Sf21(Spodoptera frugiperda)悬浮生长的影响,发现补加糖量在lg／L时·能明显提高细胞生长的速度和最高密度,细胞最高密度由2．5×10⁴／ml增加到4.9×10⁶／ml; 朴加糖量在2g／L时,则有显著的抑制作用,即使增加接种密度．细胞生长的最高密度也只有2．1×10⁶／ml。当采取流加葡萄糖方法来培养细胞时,则其生长的最大密度可提高到5．2×10⁶／ml。     

人红细胞生成素单克隆抗体的制备、鉴定及应用研究

用rhEPo作为抗原,免疫BALB／c小鼠,取其脾细胞与x63Ag8．653小鼠骨髓瘤细胞融合,再碱性PAGE方法进一步分离并纯化的rhEpo,包被Pvc板,对杂交瘤用ELlSA方法进行筛选,获得两株稳定分泌抗hEPO单抗的杂交瘤细胞株。经鉴定分别属于IgG1、IgG2b,轻链均为k链,Kd分别为5．53×10^-10mol／L和1．34×1O^-10mol／L．用western blot方法证明两者对hEPO具有高度韵专一性．能特异地识别rhEPO和尿源hEPO。所制备单抗可作为亲和层析的配体,用于再生障碍性贫血病人尿中EPO及哺乳类工程细胞所表达的hEPO的分离、纯化,并可用于hEPO的定量检测．     

基因工程链激酶(r—SK)纯化及其单克隆抗体制备和鉴定

采用Rotofor等电聚焦和分子筛技术纯化大肠杆菌表达的重组链激酶(r—SK),其纯度为97%。比活性1×10⁶IU／mg,回收率41％。分析所纯化的r—SK　N端氨基酸顺序证实其1—15个氨基酸顺序与SK基因的核苷酸顺序所示3联密码子一致。以纯化r—SK为抗原,通过杂交瘤技术构建了分泌抗r—SK单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞(4D11),该McAb属IgG1亚型．特异地作用于r-SK和C组口溶血性链球菌分泌的SK。用底物显色法测定该McAb可抑制SK对纤溶酶原的激活。Western blot法证实该McAb能识别分子量为16 250Da的r—SK的CNBr裂解片段。推测SK蛋白中第71残基至第237残基间的氨基酸顺序参与SK与纤溶酶原的结合。     

真养产碱杆菌二级连续培养系统中稀释率对聚β－羟基丁酸合成的影响

在研究真养产碱杆菌WSH3一级连续培养动力学的基础上,采用二级连续培养系统对不同稀释率下聚β－羟基丁酸的生产进行了研究。结果表明：在一级连续培养系统中,当稀释率为0．2lh^-1时,细胞干重最大值达27．1g／L;二级培养系统中,稀释率为0．14h^-1时细胞干重最大值为47．6g／L;在稀释率为0．12h^-1时,PHB的生产强度达到最大值为2．50g／(L.h)．但胞内PHB含量仅为47．6％;在稀释率为O．075h^-1时,产物对基质的转化率达到最大值为0．38g／g'此时PHB的生产强度达2．14g,(L·h)和胞内PHB含量±72．1％;随着细胞比生长速率的增长,细胞中PHB含量和单位菌体合成PHB的量不断下降。     

抗人IL-6单克隆抗体的制备及鉴定

用基因重组人IL-6免疫Balb/c小鼠,采用小鼠杂交瘤技术,筛选克隆到分泌抗人重组IL-6单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并对其中2H₂、 1D₂ 和4B₄瘤细胞株进行了鉴定.其抗体类别均为IgG,亚类分别为IgG1和IgG2a.用多种细胞因子和无关蛋白的鉴别试验结果证实它们均特异地识别rhIL-6.免疫转染结果显示,该单抗识别分子质量为21 ku的IL-6单一条带.IL-6单克隆抗体的亲和常数K_aff= 1.62×10⁹ (mol/L)^-1.     

金针菇菌丝体深层培养工艺研究

在1．8L气升式发酵反应器中,研究了金针菇菌丝体深层培养工艺条件及其特性。结果表明：金针菇菌丝体深层培养可采用玉米、黄豆和糖蜜等廉价原料作主要碳氮源;最适需氧量为1．0—2．0×10^-7mol O₂／ml·min·atm,培养24—72h内,菌丝球生长遵循立方根规律·即x^1/3,=0．786+0．027t。在最佳发酵条件下,摇瓶培养4天,茵丝干重达24．4mg／ml在反应器培养4天,菌丝干重为25．7mg／ml。     

酵母完整细胞快速高效转化法

通过研究影响转化效率的诸因素,最终找到一种快速、高效酵母完整细胞转化法。整个转化步骤能在1．5h内完成。在实验中发现：小牛胸腺DNA的加入,在加入DNA后随即加入PEG4000;将42℃热冲击时间从5min延长到25min;热冲击后直接将转化混合物涂布到选择性平板上能得到高效转化效率。所用四种类型质粒的转化效率如下：Yrp;3．5—7．2×10⁴(线性pcN60／BamHⅠ：1·6×10⁵);Yep: l·7—2.6×10⁴(线性YEpl3／BarnHⅠ：8×10⁴),Ycp：3．7×10⁴;YIp5／stuI：7．6×10³。用快速法检测的7株受体菌的转化能力都达到10⁴个转化子/μg DNA。     

水稻白叶枯病菌单抗杂交瘤细胞株的建立及应用研究

经水稻白叶桔病原细菌(Xanthomonas campestris pv．oryzae)菌株Ks-6-6、Os-213、Yz－32,Yz－34,Yz－24’免疫的BALB／c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞sP2／0融台、筛选和克隆化,共获得12株稳定分泌该病原细菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。其抗体分属IgG3和IgG2b亚类。抗体与其它主要病原细菌的种或致病变种无交叉反应,能区分水稻自叶枯病原细菌3个不同血清型的菌株。腹水抗体效价在1：10　³--1：10⁶左右。初步用于抗原决定簇的识别,能区分出6个抗原决定簇,并能将获得的63个菌株分为9个菌株组。     

嗜热脂肪芽孢杆菌质粒DNA的高压电穿孔转化研究*

采用高压电穿孔法将穿梭质粒导入了嗜热脂肪芽胞杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｋ１０４１和Ｔ５２１菌株。以对数生长后期的菌体制备Ｋ１０４１转化细胞,以ＬＢ平板上于５０℃培养的过夜菌制备Ｔ５２１转化细胞,细胞密度为５～７×１０^９细胞／ｍＬ。电击条件如下：电容２５μＦ,电场强度１０．０ＫＶ／ｃｍ,脉冲控制器设定２００。 Ｋ１０４１和 Ｔ５２１最高转化效率分别达２．０１×１０⁴和１．１９ ×１０²转化子／     

抗组织型纤溶酶原激活剂(tPA)单克隆抗体的制备和鉴定

用从人黑色素瘤细胞培液中提纯的tPA为抗原,通过杂交瘤技术获得TA₁,TA₂、TA₃和TA₄ 4株阳性杂交瘤细胞。经葡萄球菌A蛋白(SPA)亲和层析纯化抗tPA单克隆抗体(tPA．McAb)。固相酶联免疫吸附测定(ELISA)诱生含McAb的小鼠腹水,其效价达I：1O⁵。这些tPA McAb均属IgG₁亚型,特异地作用于tPA(包括基因工程生产的rtPA),与尿激酶(uK)无反应。用底物显色法测定表明所有tPA McAb均可抑制tPA的活性。     

玉米赤霉烯酮单克隆抗体酶联免疫测定方法的建立及初步应用

用ZEN—BSA人工抗原免疫BALB／c鼠,经融合、筛选和克隆化得到可稳定分泌抗ZEN单克隆抗体的杂交瘤细胞株ZEN—lC6。zEN一lC6属IgG₁,纯化腹水抗体效价为10^-5,与5种衍生物的交叉反应系数为0.16～1.20％。用ZEN一1C6建立了检测食品(玉米、小麦、大米)中玉米赤霉烯酮的CIEIA法。该法检测纯毒素的线性范围为5～1000ng／ml,最低检出浓度为0．1ng／ml,平均回收率为84．0～105．5％。用该法测定了81份样品,均有ZEN毒素检出。     

人心肌肌钙蛋白T的纯化和单克隆抗体的制备

从人左室心肌中成功纯化心肌肌钙蛋白T(cTnT). 经匀浆, 70℃加热处理, 咪唑盐酸透析, DEAE-纤维素层析, 100g心肌获取cTnT 5mg, 纯度为97.6%. 同时采用脾内免疫法, 免疫Balb/C小鼠, 经细胞融合, 筛选, 克隆化得5株稳定分泌抗人cTnT单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞(G₃, G₈, G₁₀, A₅, A₇), 4株为IgM, 1株为IgG, 染色体数目92～110条. 腹水效价为3.2×10^-6～1. 6×10^-7.     

人参培养细胞的单细胞克隆

培养基组成成分能影响人参培养细胞单细胞克隆的植板率。Ms培养基中2,4－D和KT需要一个适合的浓度比才能有效地促进细胞克隆的形成,其最佳浓度组合是2,4－D1．5mg／L和KT O．5mg／L。适合人参细胞克隆形成的NH₄N0₃浓度是400mg／L,CaCl₂.2H₂O浓度是750mg／L。向培养基中补加适量的琥珀酸、精氨酸和维生素等都能明显提高植板率。通过优化培养基的组成成分,细胞克隆的植板率可增加到2.34倍。悬浮培养两周左右的细胞平板培养最有利克隆形成,当细胞植板密度低于4×10³个细胞／ml时,几乎没有克隆形成。     

人α型肿瘤坏死因子基因在昆虫细胞中的表达

将人肿瘤坏死因子α(Tumoor Necrosis Factor α,TNF-α)cDNA片段克隆到转移载体pat610上．然后与苜蓿尺蠖核型多角体病毒(Autogropha californica Nuclear PolyhedrinVirus,AcNPV)DNA共转染草地贪夜蛾细胞(Sptodoplet frugiperda)Sf21,获得含hTNF-a基因的重组病毒。以L929细胞毒方法测得重组病毒感染Sf21细胞72小时时的表达量最高,为1．0×10^-4u／lO 6细胞;同时,培养液中小牛血清浓度对hTNF－α表达量有较大影响,当浓度为6%时hTNF—α表达量最高．感染72小时表达量可达5．2×10⁴u／1O⁶细胞,ELISA实验结果证明其产物确为hTNF—α。     

葡萄糖氧化酶产生菌Z—l—C的分批发酵与恒化培养

本文对葡萄糖氧化酶产生菌z—I—c的分批发酵与恒化培养进行了研究。实验发现,在以葡萄糖为生长限制性基质的恒化培养中,该产生菌的维持系数为O．04 g葡萄糖／g菌体．H,生长得率系数Y^max_G=O．714 g菌体／g葡萄糖,最大比生长速率μmax=O．385h^-1,饱和常数Ks=4．76g/L,理论最适稀释度Dm=0．260h^-1,最大酶比活(E／x)max为2．16×10³μ／mg,其值较分批发酵的最大酶比活(1．5l×10³μ／mg)提高43％。当向恒化培养的补料培养基中添加0．02％的α-甲基-D-葡萄糖时,由于该葡萄糖结构类似物的诱导作用,可使(E／x)max达3．11×10³μ／mg,较分批发酵之值提高106％。