世界卫生组织推荐的蛋白印迹法用于HlV-1,HlV-2和HTLV-Ⅰ/HTLV-Ⅱ检测结果的判断标准说明

<正>蛋白印迹技术(WB)是最常用的鉴定HlV-1,HlV-2和HTLV-Ⅰ/HTLV-Ⅱ特异性抗体的验证技术,但是否作为常规诊断方法尚有争议。试剂的准备和应用缺乏标准化程序,而且就制定统一的WB     

应用RT-PCR技术检测动物组织中的口蹄疫病毒*

通过对影响RT-PER检出率的条件和试剂进行了筛选,确定了提取FMDV RNA的最佳方法和试剂,优选出RT-PCR反应的试剂和最佳反应条件,建立了检测口蹄疫病毒核酸的RT-PER方法。应用所建立的方法检测送检的鲜牛奶、淋巴结、脊髓、牛鼻咽拭子,结果阳性率分别为41.4％(24/58)、13.33％(2/15)、20％(1/5)、37.5％(12/32);检测4个屠宰场送检的组织样品40份,结果阳性率为.10％-70％;检测送检的奶粉(1份)、水泡皮(1份)、老鼠(2份)、患儿口腔棉拭子(4份),阳性率均为     

艾滋病血清学诊断新方法——免疫斑点法的建立

运用基因重组技术在大肠杆菌生产出有诊断意义的人免疫缺损病毒(HIV)蛋白,将其初步提纯,再用快速蛋白液相层析技术进一步纯化,即可直接点样至硝酸纤维膜,用来检测HIV抗体。实验显示,这种免疫斑点法(Immunodot assay,IDA)的敏感性与间接免疫荧光法(IIF)相同,而特异性比它高,与蛋白印迹法(WB)相近。由于IDA试剂成本比IIF低,可用于HIV抗体检测的初筛。与IIF相比,IDA法具有假阳性率低、试剂稳定性高、操作简便和不需要昂贵的荧光显微镜等优点。因而是一种适合在基层应用的方法。     

CK-MB特异性单抗的制备方法及其应用

本研究拟建立肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)特异性单克隆抗体(m Ab)的研制方法,对抗CK-MB单抗进行评价分类及性质鉴定,并初步建立CK-MB定量检测试剂。以CK-MB抗原免疫BALB/c小鼠,利用常规单抗制备技术,使用间接和捕获ELISA差异筛选法筛选单抗。利用肌酸激酶同工酶(CK-MM/BB/MB)抗原对所制备单抗的抗原识别表位进行鉴定,另通过免疫印迹法及合成CK-MM、CK-BB差异性的线性表位肽鉴定对所制备的单抗进行评价分类。使用双抗体夹心ELISA方法筛选检测CK-MB抗原的配对m Ab,并初步建立CK-MB定量检测试剂。使用74例临床标本初步评价该试剂与罗氏试剂的检测一致性。最终,我们成功筛选到22株稳定分泌抗CK-MB抗体的杂交瘤细胞株,这些单抗可以分为线性、偏构象的CK-MB和CK-MM或者CK-BB交叉的单抗以及与CK-MB特异反应的偏构象型单抗,并使用偏构象型单抗研制出CK-MB定量检测试剂,该试剂与罗氏试剂相关系数r达到0.930 9。综上所述,本研究建立了研制CK-MB偏构象型特异性单抗的筛选方法,通过对所筛选的单抗进行分析鉴定并建立了CK-MB定量检测试剂,与罗氏试剂检测结果符合率高。     

H7N9流感假病毒制备条件的优化及其在中和抗体检测中的初步应用

目的:优化A/Anhui/1/2013(H7N9)流感假病毒的制备条件。方法:采用基于慢病毒载体的假病毒包装系统,通过对质粒组合方式、骨架质粒与包膜质粒配比、质粒复合物与转染试剂配比、换液时间点、维持液血清浓度、假病毒收获时间点等条件的探索,优化H7N9假病毒的包装条件;通过对4种假病毒纯化方案的比较,确定纯化方法;对纯化的假病毒进行Western印迹鉴定和电镜形态观察,了解其生物学特征;通过中和试验了解其在中和抗体检测中的应用情况。结果:假病毒包装条件优化结果表明,以血凝素(HA)与神经氨酸酶(NA)作为膜质粒,采用骨架质粒与膜质粒质量比3:1、质粒复合物与转染试剂质量体积比1:2混合,转染293FT细胞后10 h换含2%胎牛血清的维持液,培养48 h后收获上清,可高效获得流感假病毒AHop-H7N9pp;不同纯化方式获得的假病毒对感染H7N9的雪貂血清的中和抗体检测结果表明,假病毒纯化方法对中和抗体检测灵敏度的影响没有显著性差异;生物学特征分析显示,纯化的假病毒在电镜下具有典型的流感病毒形态,Western印迹能检测到HA和P24蛋白;多种流感疫苗小鼠血清中和试验结果表明该假病毒具有高度特异性,可用于H7N9中和抗体检测。结论:获得了包装有A/Anhui/1/2013(H7N9)HA与NA的假病毒,并确定了高效制备H7N9假病毒的各条件参数,为基于H7N9流感假病毒的中和抗体检测平台的建立奠定了基础。     

人参根提取物增强巨噬细胞RAW264.7的自噬水平并提高其增殖和吞噬能力

研究人参根提取物对巨噬细胞RAW264.7的增殖能力、吞噬能力和自噬水平的影响以及其相关性.用细胞计数试剂(CCK-8)检测不同浓度的人参根以及加入对巨噬细胞RAW264.7增殖的影响;采用中性红吞噬实验检测人参根提取物对巨噬细胞吞噬活性的影响;采用吖啶橙染色法(AO染色法)检测自噬体的形成;采用免疫印迹法(Weste...     

口蹄疫病毒非结构蛋白3A、3B和2C基因的表达及产物纯化与活性检测

[目的]口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白(NSP)3A、3B和2C基因的表达及产物纯化与活性检测.[方法]利用原核表达系统表达了FMDV NSP 3A、3B和富含B细胞抗原位点序列的2C蛋白.利用高浓度尿素裂解包涵体,采用稀释法和氧化型、还原型谷胱甘肽系统相结合方法对2C蛋白进行复性.用金属鳌合亲合层析的方法对表达的FMDV NSP 3A、3B和2C进行纯化.采用ELISA方法对比检测了3种纯化蛋白在检测羊血清NSP抗体的效果.[结果]检测得知3A和3B为可溶性表达蛋白,2C以包涵体形式表达.通过Western-blot分析,表明纯化后蛋白能与FMDV感染动物血清发生特异性反应.纯化的3A、3B和复性后的2C融合蛋白与3ABC抗原的检测结果具有很高的符合性.[结论]该研究为建立鉴别FMDV自然感染动物和灭活疫苗免疫动物的酶联免疫电转移印迹技术(EITB)提供了所需的材料.     

Dianon开始淋病尿试剂的临床试验

两周前,八个州的数千名开业医师接到了参与淋病直接诊断剂的合作研究的邀请书。Dianon系统公司(DSI,一个癌症诊断实验室)在6月5日开展的“三种试剂计划”引入了一种以单克隆抗体为基础的方法,用印迹表示尿中淋病螺旋体——Borrelia burgdorferi的蛋白。8个州中的七个州(康涅狄格、纽约、新泽西、马萨诸塞、罗得岛、明尼苏达和威斯康星)已被美国疾病防治中心(CDC)定为淋病的流行病区。这场Dianou运动的第八个州是北卡罗来纳。     

免疫印迹检测人红细胞膜血型糖蛋白的方法学

用免疫印迹技术检测人红细胞膜血型糖蛋白(GP)比PAs试剂染色和BLOTTO法点样量少,区带清晰,异常GP的检出率较高,其放射自显影的影像反差好。本文还就该方法的可靠性,最适点样量的选择,血样的有效保存时间以及 ¹²⁵Ⅰ-蛋白A的效价等方面进行了讨论。     

鲎试验测定内毒素的一步显色法

<正>本文介绍了使用单一混合试剂的终点法和LAL显色动力学法。该试剂可用缓冲液、鲎试剂和底物(显色鲎试剂)混合冻干或用市售的LAL凝胶试剂、底物和缓冲液(显色法、凝胶法通用)混合后立即使用。这种单一试剂既可用于显色动力学方法,也可用于一步终点法(规定孵育时间)。由于去除了许多步骤和技术误差,因此可极大地减少显色法的差异。本文对动力学法和终点法进行了详细地比较,单一试剂法也与传统的多试剂法进行了对比。     

三种试剂转染293T细胞的效率及毒性比较

该文旨在比较不同的转染试剂介导两种荧光素酶报告基因转染人胚肾细胞293T的效果。采用脂质体转染试剂Lipofectamine~? 2000、非脂质体成分X-tremeGENE HP DNA和FuGENE~? HD转染试剂,选取不同配比的质粒DNA和转染试剂分别将含有绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(RFP)的质粒转入293T细胞中,应用倒置荧光显微镜和流式细胞仪分析转染效率,锥虫蓝染色法检测细胞存活率。X-tremeGENE HP DNA转染试剂转染293T细胞的效率最高,不管目的基因、质粒DNA和转染试剂的配比如何,其转染效率均显著高于脂质体转染试剂(P均0.05);在相同的质粒DNA和转染试剂比例下,FuGENE~? HD试剂介导GFP转染的效率显著高于脂质体试剂Lipofectamine~? 2000(P均0.05),但二者介导RFP转染的效率无显著性差异(P均0.05);在质粒DNA和转染试剂比为1?2时,X-tremeGENE HP DNA试剂转染GFP和RFP的效率均显著高于FuGENE~? HD试剂(P均0.05),当比例递变为1?4时,二者的转染效率无显著性差异(P均0.05)。随着转染试剂使用量的增多,Lipofectamine~? 2000和FuGENE~? HD试剂的转染效率明显升高,而X-tremeGENE HP DNA试剂的转染效率则下降。与转染GFP基因相比,三种试剂的转染效率均随着目的基因RFP片段的增大而显著降低(P均0.05)。在质粒DNA和转染试剂的比例相同的情况下,三种试剂转染后的存活率无显著性差异(P均0.05),但随着转染试剂用量的增加,三种试剂转染后的细胞存活率均显著降低(P均0.05)。目的基因大小与转染效率成反比,综合考虑转染试剂用量、转染效率和细胞活性,该研究认为X-tremeGENE HP DNA转染试剂效果最好。     

细胞外基质金属蛋白酶诱导分子(CD147)在胰腺癌细胞及胰腺星状细胞中的表达(英文)

目的:探讨细胞外基质金属蛋白酶诱导分子(CD147)在胰腺癌细胞(Panc-1)及胰腺星状细胞(PSCs)的表达。方法:应用QRT-PCR,免疫细胞化学和免疫印迹分析方法检测Panc-1和PSCs细胞中EMMRPIN的表达,应用脱糖基化试剂N-glycosidase F及Endoglycosidase H鉴定CD147糖基化形式。结果:CD147在Panc-1和PSCs细胞质膜及细胞质中高表达,通过脱糖基化法首次鉴定出胰腺癌细胞及胰腺星状细胞中CD147不同的糖基化修饰。结论:CD147的糖基化修饰具有细胞特异性,可能与细胞恶性程度相关。     

“斐林试剂和双缩脲试剂”使用的再研究

通过实验证实:斐林试剂和双缩脲试剂使用的实验鉴定结果与被鉴定溶液(如豆浆)原有的颜色、鉴定试剂的用量(如滴加的滴数)、被鉴定物质的浓度(如葡萄糖的浓度)有关,与添加顺序无关。     

p53-p21通路抑制组蛋白甲基转移酶NSD2的表达

NSD2(nuclear receptor-binding SET domain 2)是一种在黑色素瘤等多种肿瘤细胞中高表达的组蛋白甲基转移酶,其在Wolf-Hirschhorn综合症(wolf-Hirschhorn syndrome,WHS)和多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)疾病中表达异常的原因已经得到了较好的阐明。而NSD2在其它肿瘤中的表达为何失调还未阐明。本研究选用p53野生型的恶性黑色素瘤细胞系92-1作为细胞模型,采用DNA损伤试剂依托泊苷处理和RNA干扰技术,通过定量PCR和蛋白质免疫印迹的方法首次证实了p53-p21通路对NSD2具有抑制作用。     

四种丙型肝炎病毒抗体试剂检测方法的性能评估

对血液筛查的四种丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)抗体试剂检测方法的性能进行评估。方法采用协作标定方式,应用四种检测方法(间接ELISA法、双抗原夹心ELISA法、间接CLIA法、双抗原夹心CLIA法)16种HCV抗体试剂,对经确证筛选出的70份(HCV抗体阳性35份、阴性35份)血浆样本进行检测,通过分析阳性、阴性符合率,评估四种方法 HCV抗体试剂的性能。结果间接ELISA法试剂检测阳性符合率为88.6%(31/35)~94.3%(33/35),双抗原夹心ELISA法、间接CLIA法、双抗原夹心CLIA法试剂检测阳性符合率为91.4%(32/35)~94.3%(33/35),四种检测方法 HCV抗体试剂阳性符合率之间的差异无统计学意义(P0.05);间接ELISA法和间接CLIA法试剂弱阳性样本检出率为11.4%(4/35)~31.4%(11/35),双抗原夹心ELISA法和双抗原夹心CLIA法试剂弱阳性样本检出率为5.7%(2/35)~11.4%(4/35),四种检测方法 HCV抗体试剂对弱阳性样本的检出率之间的差异有统计学意义(P0.05);间接ELISA法试剂检测阴性符合率分别为94.3%(33/35)~100%(35/35),间接CLIA法试剂阴性符合率分别为94.3%(33/35)~97.1%(34/35),双抗原夹心ELISA法和双抗原夹心CLIA法试剂阴性符合率均为97.1%(34/35),四种检测方法 HCV抗体试剂阴性符合率之间的差异无统计学意义(P0.05)。结论四种检测方法 HCV抗体试剂的性能基本一致,不同方法各有优缺点,建议应用多种检测方法对弱阳性样本进行确认检测。     

鸡原始生殖细胞转染条件优化

为获得鸡原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)的最佳转染效率,本研究比较不同质粒用量和不同细胞数在3种转染试剂(Lipofectamine 2000、3000和LTX&Plus Reagent)中PGCs的转染效率,利用荧光激活细胞分选技术(fluorescence activated cell sorting technology,FACS)辅助优化Lipofectamine 3000转染试剂,经FACS进一步分选获得带绿色荧光蛋白(GFP)的PGCs,继续培养3周后,移植回注到受体鸡胚中,移植3.5 d后分离性腺拍照观察。结果显示,转染试剂Lipofectamine 3000的转染效率最高,质粒、Lipofectamine 3000转染试剂和PGCs细胞数的配比为3μg:4μL:0.5×10⁴个,转染5h转染效率最高,达到23.4%,与现有的研究结果相比提高了2倍以上。移植回注PGCs到受体鸡胚中,荧光显微镜观察到鸡胚性腺中有GFP阳性细胞。本研究综合考虑转染试剂、质粒用量和细胞数量的影响因素以优化PGCs的转染条件,为高...     

鼠疫菌F1抗体/抗原酶联免疫诊断试剂盒的应用评价

目的对兰州生物制品研究所有限责任公司研制的鼠疫菌F1抗体酶联免疫诊断试剂盒和鼠疫菌F1抗原酶联免疫诊断试剂盒进行临床应用评价。方法采用双抗原/抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接血球凝集试验(IHA)、胶体金免疫层析试验(GICA)3种方法的诊断试剂对比检测云南省地方病防治所中心实验室保藏的和现场采集的血清样品和脏器样品,对血清样品做鼠疫菌F1抗体检测,对脏器样品做鼠疫菌F1抗原检测。结果在358份血清样品中,ELISA试剂检出F1抗体阳性52份(14.52%),IHA试剂检出阳性37份(10.34%),GICA试剂检出阳性45份(12.57%)。ELISA与IHA试剂的符合率为95.23%,与GICA试剂的符合率为96.92%。经统计学χ2检验,ELISA试剂检出F1抗体阳性率高于IHA试剂(χ2=11.53,P=0.000 7),与GICA试剂检出的差异无统计学意义(χ2=3.27,P=0.070 4)。进一步分析滴度差值频数,ELISA试剂检测人血清的敏感性高于IHA试剂的样品占87.5%。在117份脏器样品中,3种试剂均检出F1抗原阳性15份(12.82%),符合率100%。滴度差值频数比较,ELISA试剂检测敏感性高于反向间接血球凝集试验(RIHA)试剂的样品为78.57%。结论兰州生物制品研究所有限责任公司研制的鼠疫菌F1抗体酶联免疫诊断试剂盒和鼠疫菌F1抗原酶联免疫诊断试剂盒性质特异,其敏感性优于IHA试剂盒和GICA试剂条,值得在鼠疫的监测和快速诊断中推广应用。     

酸性蛋白酶的测定方法及缓冲液和底物的选择

酸性蛋白酶的测定方法 福林—酚试剂显色反应法的原理是:福林试剂(磷钨酸和磷钼酸的混合物),在碱性条件下极不稳定,可被酚类化合物还原,因而呈蓝色反应(钨蓝和钼蓝的混合物)。由于蛋白质分子中含有带酚基的氨基酸,利用蛋白酶分解蛋白质(底物),生成含酚基的氨基酸,与福林试剂作用,因而也呈蓝色反应。显色程度与底物在酶作用下产生的水解产物数量成正比,因此可推算出     

宫颈细胞系化学转染与电穿孔转染效率的比较与优化

目的 定量比较4种化学转染试剂在五株常用的宫颈(癌)细胞系中的DNA转染效率,以助于针对不同细胞系选择合适的转染试剂;同时探索电穿孔转染法在难转细胞系Ect1/E6E7、CaSki中的应用,选择最佳转染条件。方法 以pcDNA3.1-EGFP为报告载体,采用FuGENE HD、jetPRIME、Lipofectamine 2000和Lipofectamine 3000四种转染试剂分别转染常用宫颈(癌)细胞系HeLa、SiHa、CaSki、C33A和Ect1/E6E7,转染24h后用倒置荧光显微镜观察记录,并采用Cellometer K2对转染效率进行定量分析。针对化学转染法难转细胞系Ect1/E6E7、CaSki,采用电穿孔转染法进行转染,优化转染条件,并对转染效率进行定量比较。结果 jetPRIME和Lipofectamine 3000转染试剂在HeLa细胞中的转染效果很好,而对SiHa、C33A细胞转染效率相对较低,在CaSki、E6E7细胞中的转染效果很差。FuGENE HD转染试剂除了对HeLa、SiHa细胞转染效果较好之外,在其他3株细胞中的转染效果均不理想。Lipofectamine 2000在5株细胞中的转染效果也不理想。在穿孔电压170V、脉冲波长7ms、脉冲间隙10ms和驱动电压20V的条件下电穿孔转染法在Ect1/E6E7、CaSki细胞中的转染效率最佳且均高于化学转染法。结论 针对不同的宫颈(癌)细胞系选择合适的转染方式和转染试剂可达到更高的转染效率。相对电转染,化学转染细胞存活率高,电转染更适用于难转细胞的稳定转染。     

268份人类免疫缺陷病毒抗体待确定样本的检测结果分析

为了提高实验室人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)抗体检测能力及对免疫蛋白印迹(Western blot,WB)实验结果的判断能力,对送检至北京市东城区艾滋病确证实验室的268份HIV抗体待确定样本进行确证实验及结果分析。按照试剂说明书和实验室标准作业程序(Standard Operation Procedure,SOP)操作对送检的全部样本进行WB确证实验;了解HIV筛查实验结果与确证实验结果的相关性,并分析不同送检机构、送检人群样本的检测结果差异以及不同试剂、不同检测方法的结果差异。结果显示在筛查出抗体待确定的268份样本中,确证阳性170份,阳性率63.43%;确证阴性51份,阴性率19.03%;不确定结果47份,占筛查有反应的17.54%。确证阳性病例来自监管场所、自愿咨询检测门诊(Voluntary Counseling and Test,VCT)和医疗机构,不同送检单位及不同人群的阳性样本率有显著统计学意义(P<0.01)。WB确证阳性样本带型以全条带和次全条带为主,且所有确证阳性标本均来自双试剂阳性样本。不同检测方法阳性样本率的差异有显著统计学意义(P<0.01),其中化学发光法的样本阳性率占46.27%,酶联免疫吸附实验(ELISA)占88.29%,胶体硒法占43.48%。本研究结果提示,对潜在HIV感染者,应扩大检测面,加强医疗机构检测,并提供一种以上方法的多次检测,以减少漏检的风险。