EB病毒融合蛋白Zta-P54在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定

为获得能用于检测试剂盒的高纯度具有活性的EB病毒融合蛋白,以pGEX5T-BZLF1-BMRF1质粒为模板进行PCR扩增得到BZLF1-BMRF1融合基因,将其插入pET32a中,构建表达质粒pET32a/BZLF1-BMRF1。将该质粒转入大肠杆菌培养,经IPTG诱导获得Zta-P54融合蛋白。用DEAE-Sepharose CL-6B和Ni-NTA亲和层析纯化,并通过SDS-PAGE和Western blot对Zta-P54融合蛋白进行鉴定。双酶切鉴定和测序结果显示成功构建pET32a/BZLF1-BMRF1质粒,SDS-PAGE显示该蛋白相对分子量约为60kD,与预期结果一致。纯化后获得纯度为96.5%的Zta-P54融合蛋白。Western blot检测该蛋白有良好的生物活性和反应特异性。因此,成功构建pET32a/BZLF1-BMRF1质粒,在大肠杆菌中可溶性表达。最终获得纯度高、生物活性好的融合蛋白。     

EB病毒核抗原1羧基端的原核表达、纯化及其免疫学特性

为进一步研究EB病毒核抗原 1(EBNA1)的功能及提高EB病毒 (EBV)相关疾病辅助诊断的特异性 ,对EBNA1基因 3′端的部分片段进行了原核表达、纯化并初步研究其免疫学特性 .采用PCR法扩增了EBNA1基因编码区 ,经酶切鉴定、序列分析后 ,将其 3′端 5 73bp片段克隆至原核表达载体pET30a中 ,得到重组质粒pET30a SS5 80 .该重组质粒转化大肠杆菌BL2 1(DE3)感受态细胞并经异丙基 β D 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达出分子量约 2 5kD的融合蛋白 (2 5 kDEBNA1) .该蛋白以包涵体和可溶形式存在 ,均可用Ni2 + 离子亲和柱纯化 .Western印迹结果显示 ,该蛋白能与鼻咽癌 (NPC)病人血清发生特异性反应 .纯化的 2 5kDEBNA1蛋白免疫BALB c小鼠后 ,经ELISA检测获得了高效价的多克隆抗体 .免疫印迹和间接免疫荧光结果显示制备的免疫小鼠血清能够与HeLa细胞中瞬时表达的EBNA1蛋白发生特异性反应 ,且特异性优于鼻咽癌病人血清 .以上结果表明成功构建了EBNA1羧基端的原核表达质粒 ,并在大肠杆菌中高效表达了 2 5kDEBNA1蛋白 ,该蛋白具有良好的抗原性和免疫原性     

羊口疮病毒蛋白ORFV035的表达、纯化和多克隆抗体的制备

克隆表达羊口疮病毒蛋白ORFV035,并制备其多克隆抗体,为后续对病毒复制、装配、形态发生和成熟过程的研究奠定基础。PCR扩增羊口疮病毒ORFV035基因,将其与质粒pET-30a(+)经Bam HⅠ和HindⅢ双酶切后连接,构建重组质粒pET30a-035。重组质粒经双酶切和测序鉴定,转化感受态大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定蛋白表达情况。表达产物进行超声破碎和Ni柱纯化,纯化后目的蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体并对其进行鉴定。成功构建了重组质粒pET30a-035,在大肠杆菌BL21中以包涵体形式高效表达。包涵体洗涤、溶解后进行Ni柱纯化,得到纯度较高的ORFV035-his融合蛋白。以纯化蛋白免疫小鼠获得多克隆抗体。Western blot检测显示该多抗可以识别天然ORFV035蛋白。成功诱导表达、纯化ORFV035蛋白并制备ORFV035多克隆抗体。     

人巨细胞病毒编码蛋白pUL23在E.coli BL21(DE3)中的表达和纯化

大肠杆菌中高效表达携带组氨酸标签的人巨细胞病毒皮层蛋白pUL23,并进行纯化以及鉴定.提取感染HCMV Towne病毒株的HFF细胞的总RNA,逆转录为cDNA作为模板,经PCR获得UL23的基因片段,将此片段插入表达载体pET-28a(+),构建pET28a(+)-UL23重组质粒.将pET28a(+)-UL23转化至大肠杆菌BL21( DE3),进行IPTG诱导表达.表达产物经Western blotting分析后进行发酵,再用Ni sepharose亲和层析纯化,纯化产物进行SDS-PAGE和Western blotting检测.结果表明,成功构建pET28a(+)-UL23原核表达载体,表达及纯化了His-pUL23融合蛋白.为进一步研究pUL23奠定基础.     

人纤溶酶原饼环区5(hPK5)基因的分泌型表达

构建人纤溶酶原饼环区5(hPK5)基因的原核可溶性表达载体并进行表达和纯化,获取大量高纯度、具有生物活性的hPK5蛋白。以纤溶酶原cDNA为模板,PCR扩增了hPK5基因,经过适当酶切后构建表达载体pET22b(+)hPK5,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行表达并经组氨酸亲和层析获得纯化。带有重组质粒pET22b(+)hPK5的大肠杆菌经IPTG诱导后以可溶性形式表达16kDa的蛋白,其表达量占菌体总蛋白的30%以上,纯化后目的蛋白纯度达95%以上,Western印迹表明重组蛋白具有Histag抗原活性。构建了pET22b(+)hPK5重组质粒并成功地在大肠杆菌中获得可溶性表达,为获得大量hPK5基因工程产品奠定了实验基础。     

片球菌素pedA基因的原核表达、纯化及生物信息学分析

旨在构建片球菌素PA-1结构基因pedA的原核表达载体,在大肠杆菌体系中实现PA-1的外源表达,运用生物信息学手段分析重组蛋白的理化性质及分子结构。以戊糖片球菌C-2-1的DNA为模板,扩增pedA基因,扩增产物克隆入pET28a(+)原核表达载体,构建pET28a-ped A重组质粒,转入大肠杆菌BL21(DE3)中;30℃,以1 mmol/L IPTG诱导表达5 h;采用Ni-NTA树脂亲和层析纯化重组蛋白,检测纯化后重组蛋白的抑菌活性;利用生物信息学手段探究重组蛋白的理化性质及分子结构信息。结果显示,pET28a-ped A重组质粒构建成功,带有His标签的PA-1重组片球菌素在大肠杆菌中实现了可溶性表达,利用Ni-NTA亲和层析获得纯化的重组蛋白,Tricine-SDS-PAGE电泳分析表明纯化后的重组蛋白分子量约为7.8 k D,与理论值相符。琼脂扩散法抑菌活性实验抑菌圈效果明显,表明纯化的重组片球菌素具有抑菌活性。生物信息学方法对比分析其蛋白结构发现,获得的重组蛋白含有信号肽,α螺旋占23.53%,疏水性提高,可能促进了重组蛋白的可溶性表达。该实验成功构建了片球菌素PA-1的原核表达载体,实现了在大肠杆菌中的可溶性表达,该表达可能与其含有信号肽及信号肽疏水性有关,纯化后的重组蛋白抑菌活性明显。     

HPV16 L2肽段偶联AP205 VLP的原核表达及免疫原性分析

目的:将编码HPV16衣壳蛋白L2的65～71、112～120免疫优势表位连接到RNA噬菌体衣壳蛋白AP205氮端,组装形成病毒样颗粒,通过在大肠杆菌中实现表达及纯化,对其免疫原性进行研究。方法:合成编码AP205衣壳蛋白基因和HPV16 L2的65～71、112～120位氨基酸表位的基因序列,PCR连接并克隆至pET30a(+)原核表达载体,构建重组表达质粒pET30-AP205-HPV16ΔL2,转化大肠杆菌BL21(DH3)感受态细胞,IPTG诱导表达。表达蛋白经凝胶层析纯化及SDS-PAGE、Western blot等理化性质检测,免疫接种ICR小鼠,通过间接ELISA法检测其免疫原性。结果:成功构建重组表达质粒,重组蛋白在大肠杆菌中以可溶性表达,透射电镜观察可见典型病毒样颗粒,该VLP在动物实验中表现出较好的免疫原性。结论:成功将HPV16 L2表位偶联AP205以形成VLP,在大肠杆菌中实现可溶性表达。     

鸭坦布苏病毒E蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

目的用RT-PCR技术扩增鸭坦布苏病毒(DTMUV)AH-F10株E基因,并克隆至pET32a(+)载体,构建重组表达质粒pET32a-E,表达E蛋白。方法重组表达质粒转化感受态细胞BL21(DE3),经IPTG诱导后,获得含6个His标签的融合蛋白,大小约54kDa。表达的蛋白以包涵体形式存在。对目的蛋白进行纯化,用纯化的E蛋白免疫Balb/c小鼠,制备多克隆抗体血清。结果SDS-PAGE和Western blot试验结果表明E基因在大肠埃希菌中成功表达,并能与抗DTMUV多克隆抗体产生特异性反应,具有良好的反应原性。间接免疫荧光试验表明免疫小鼠后获得的多克隆抗体能与DTMUV反应。结论本研究为DTMUV新型疫苗和诊断试剂盒的进一步研究奠定了基础。     

重组酶Exo、Beta和Gam在大肠杆菌中的表达与纯化

目的:构建exo、beta和gam基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达、制备重组酶Exo、Beta和Gam。方法:将exo、beta和gam基因分别构建在原核表达载体pEGKG和pET28a上,分别转化大肠杆菌BL21(DE3)和DH5α,经IPTG诱导后,在大肠杆菌中获得可溶性表达蛋白,用柱层析方法纯化蛋白。结果:构建了原核表达质粒pET28a-exo、pET28a-beta、pET28a-gam和pEGKG-exo、pEGKG-beta、pEGKG-gam;SDS-PAGE结果表明重组酶融合蛋白His-Exo、GST-Exo、His-Beta、GST-Beta、His-Gam、GST-Gam得到可溶性表达;用His标签抗体和GST标签抗体通过Western印迹方法检测到纯化后的融合蛋白。结论:在大肠杆菌中诱导表达了λ噬菌体重组酶,并纯化获得了一定量的纯度较好的蛋白,为下一步制备检测用多克隆抗体奠定了基础。     

传染性法氏囊病病毒非结构蛋白VP5的原核表达及多克隆抗体的制备

利用PCR技术,从传染性法氏囊病病毒（IBDV）Gx,Gt毒株中分别扩增出VP5基因,将其克隆到表达载体pET30a、pET28a中。经PCR、酶切和序列分析鉴定获得重组质粒命名为pET28a-GtVP5、pET30a-GxVP5。将pET30a-GxVP5、pET28a-GtVP5分别转化宿主菌BL21(DE3),在IPTG诱导下均成功表达约24 kDa的Gx-VP5及23kDa的Gt-VP5融合蛋白,并都以包涵体形式存在。将Gx-VP5纯化后的蛋白免疫8周龄BALB/c雌鼠,ELISA分析表明制备的抗血清效价在1:25600以上,Western blot分析VP5表达产物能与抗6×His mAb及抗IBDV多克隆抗血清发生反应,具有良好的免疫反应特异性。     

人免疫缺陷病毒早期蛋白Nef的表达、纯化及免疫原性研究

目的：通过原核细胞表达人免疫缺陷病毒（HIV）Nef抗原,制备特异抗血清,为Nef抗原检测提供技术方法。方法：以HIVBotswana毒株基因组为模板,用PCR法获得Nef蛋白编码基因,将其克隆到pET30a载体中,在大肠杆菌中表达Nef融合蛋白;用纯化的融合蛋白免疫BALB／c小鼠获得抗血清,用真核表达的Nef抗原对其特异性进行分析。结果：构建的Nef融合基因在大肠杆菌中获得表达,相对分子质量约为36x103,免疫BALB／c小鼠获得针对融合蛋白的高效价抗血清,ELISA抗体滴度为1：6400;免疫荧光和Westemblot检测表明,该抗血清能特异地与重组痘苗病毒表达的Nef抗原反应。结论：在大肠杆菌中表达了HIVNef融合蛋白,制备了Nef融合蛋白的高效价小鼠免疫血清,该血清能特异性识别HIVNef抗原,为HlVNef抗原检测提供了技术方法。     

鸡贫血病毒衣壳蛋白的表达纯化及多克隆抗体制备

利用PCR技术,以pPrpo-VP1为模板扩增得到鸡贫血病毒的衣壳蛋白基因(VP1),以T4多聚核苷酸激酶磷酸化处理、纯化后,克隆至表达载体pET-30a( )中,从而构建了原核表达质粒pET30-VP1。将pET30-VP1转化至感受态细胞E.coliBL21(DE3)中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析,可见约45kDa的目的蛋白获得表达。该蛋白经亲和层析纯化后,免疫6-8w的雌性Balb/c鼠,三次免疫后,采血分离血清,制得抗VP1的多克隆血清。以纯化的VP1为包被抗原,用ELISA方法检测,制备的血清效价达12800×以上。以Westernblot检测,该血清可与目的蛋白发生特异性反应,证明其具有良好的免疫原性。VP1蛋白的成功表达及其多克隆抗体的制备为进一步研究VP1蛋白的功能及开展CAV疫苗及诊断制剂的研制奠定了基础。     

白喉毒素无毒突变体CRM197基因的克隆与表达

目的构建白喉毒素(Diphtheria toxin)无毒突变体CRM197(Cross-reacting materials 197)的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达重组蛋白。方法以白喉杆菌(ATCC39255)基因组DNA为模版,采用聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)扩增CRM197基因,插入表达载体pET11b中,构建重组原核表达质粒pET11b-CRM197。经双酶切及测序鉴定正确后,重组质粒被转化入大肠杆菌Rosetta 2(DE3)pLysS,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果重组表达质粒经双酶切及测序鉴定,结果表明与预期一致;表达的重组蛋白相对分子质量约58 000,并可与鼠抗CRM197单克隆抗体特异性结合。结论已成功构建了重组原核表达载体pET11b-CRM197,重组的CRM197蛋白在大肠杆菌中得到了表达,为以该重组突变体作蛋白载体制备结合疫苗奠定了基础。     

北京地区人呼吸道合胞病毒核蛋白基因的序列分析及原核表达

为了解北京地区流行的人呼吸道合胞病毒(HRSV)N蛋白基因的特征,并用大肠杆菌表达获得N蛋白,从2006年1月至3月收集的首都儿科研究所附属儿童医院急性呼吸道感染患儿标本中分离到7株HRSV毒株(3株A亚型,4株B亚型),分别经RT-PCR扩增得到HRSV N蛋白全基因,克隆至pUCm-T载体中并进行测序和分析;从重组质粒pUCm-N9968中经PCR扩增获得N基因,亚克隆入原核表达载体pET30a( )中,得到重组表达质粒pET30a-N9968,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导培养;SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白的表达和抗原性。经扩增并测序,7株HRSV N蛋白基因全长均为1 176 bp,编码一个含391个氨基酸的蛋白;北京地区7株RSV分离株的N蛋白基因之间的核苷酸和推导的氨基酸同源性分别在85.4%~99.7%之间和95.4%~100%之间,进一步证明N蛋白基因的高度保守性。经诱导培养产生大量带6个组氨酸标记的重组N蛋白,主要以包涵体形式存在。N蛋白粗提物经Ni2 亲和层析获得较理想纯化。Western blot结果显示,所表达的蛋白能与特异性单克隆抗体和人血清反应。说明本研究构建的重组pET30a-N9968原核表达质粒使N蛋白获得了高效表达,并且具有特异的抗原活性,为今后进一步研究奠定了基础。     

人vasorin蛋白的基因克隆、表达及纯化简

目的：克隆、表达人vasorin（VASN）蛋白。方法：利用PCR方法从HepG2细胞的cDNA中扩增获得目的基因,并插入带有6xHis标签的原核高效可溶性表达载体pET28a中,构建重组表达质粒pET28a-VASN,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导后目的基因获得表达,对融合目的蛋白进行Ni^2＋金属螯合柱纯化。结果：内切酶鉴定及基因序列测定证实重组表达质粒构建成功;对目的蛋白进行了原核表达,SDS-PAGE显示相对分子质量为61x10^3的特异表达条带;Western印迹证实目的蛋白为VASN,且主要以包涵体形式存在;对经尿素变性的表达产物进行了亲和层析纯化,有利于以后的变性、复性过程。结论：获得了人VASN融合蛋白,为其进一步的生物学功能研究奠定了基础。     

人肿瘤坏死因子α抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白的原核表达及纯化

目的:表达和纯化人肿瘤坏死因子α抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白。方法:利用PCR搭接方法及基因合成方法获得目的基因,插入带有6×His标签的原核高效可溶性表达载体pET32a中,构建重组表达质粒pET32a-T9-ac-9,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导目的基因表达;对融合蛋白进行Ni2+金属螯合柱纯化。结果:构建的重组表达质粒经PCR、内切酶鉴定及基因序列测定证实;目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,SDS-PAGE显示相对分子质量为22.917×103;对表达产物进行了亲和层析纯化,从上清中获得了纯度较高的人肿瘤坏死因子α抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白。结论:获得了可溶性的人肿瘤坏死因子α抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白,为其生物学功能研究奠定了基础。     

人高迁移率族蛋白B1，高迁移率族蛋白B1Abox和Bbox的原核表达、纯化及高迁移率族蛋白B1多克隆抗血清的制备

目的：获取重组人高迁移率族蛋白B1（HMGB1）,HMGB1Abox和Bbox的纯化蛋白,制备HMGB1的多克隆抗血清。方法：采用PCR方法扩增人HMGB1,HMGB1的Abox和Bbox目的基因片段,构建原核表达载体,进行原核表达与蛋白纯化,然后用HMGB1免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗血清。采用ELISA检测抗血清效价,用免疫组化检测HMGB1在小鼠肝损伤组织中的表达。结果：成功构建了人HMGB1,HMGB1的Abox和Bbox原核表达载体pET28-HMGB1、pET28一Abox、pET28-Bbox,在E．co1iBL21中表达,镍亲和层析柱提纯,获取纯净目的蛋白。HMGB1免疫新西兰大白兔后,抗血清效价为1：2,000,000,具有高度特异性。免疫组化显示小鼠坏死肝组织HMGB1表达增加。结论：本研究获得了人HMGB1以及HMGB1的Abox和Bbox的纯化蛋白,制备了人HMGB1的多克隆抗血清,为HMGB1的结构、组织表达谱及其功能的研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的重组表达及膜定位研究

从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出ESAT-6基因,克隆入pET21a(+)载体.将成功构建的pET21a(+)-ESAT-6重组质粒转化入感受态BL21(DE3)中,经诱导表达后,使用SDS.PAGE和Western blot鉴定.超声破碎后发现目的蛋白以可溶性表达形式存在,经过Ni-NTA柱和DEAE-Seph...     

Prokaryotic expression and immunogenicity of 56-kDa protein of Orientia tsutsugamushi strain Karp

To express the 56-kDa protein of O. tsutsugamushi strain Karp, this protein gene was cloned into pET30a(+) before transforming into host bacteria, E. coli Rossetta. Specificity of the recombinant protein was assessed by ELISA using rabbit sera against common members of the order Rickettsiae and 10 other pathogenic bacteria. After IPTG induction, SDS-PAGE analysis of isolated protein demonstrated a band at approximately 46-kDa. Western blot and mass spectrometry analysis proved that the recombinant protein was expressed successfully. Specificity analysis demonstrated that all sera were negative, except sera against O. tsutsugamushi strains TA763, TH1817 and Kato, B. quintana, A. phagocytophilum, E. chaffeensis and B. bacilliformis. The purified protein was used to immunize BALB/c mice and polyclonal antisera were harvested. By examination of IFA and ELISA, the highest titer of the polyclonal antibodies reaches 1:1600. The recombinant 56-kDa protein in the study is valuable for developing a simple and rapid diagnostic test and vaccine for O. tsutsugamushi.