解淀粉芽胞杆菌启动基因的克隆及其对地衣杆菌α-淀粉酶基因的调控

用大肠杆菌启动基因探针质粒pHE5克隆了解淀粉芽胞杆菌的启动基因。供体菌DNA的HindⅢ片段与pHE5重组后转化大肠杆菌,获得一批带启动基因的抗四环素转化子,其中四株的抗性达到200μg/mL,从这四株高抗性转化子中提取质粒,并对其中的一个重组质粒pAE23的插入片段进行限制性图谱分析和缺失研究,获得了一个缺失了部份片段,四环素抗性仍达到200μg/mL的衍生质粒pAED23,经酶切分析证明其上的启动基因位于0.8kb的EcoR Ⅰ—HindⅢ片段上。点杂交分析证实该片段来自解淀粉芽胞杆菌的DNA。将地衣杆菌的α-淀粉酶基因亚克隆至pAED23启动基因下游的HindⅢ位点上能增强该基因在大肠杆菌中的表达。     

大豆启动功能片段的克隆及在转化甘草中启动β-葡糖苷酸酶基因的表达

将大豆DNA的HindⅢ和BamHⅠ酶切片段连接到pBⅠ101载体缺启动子的GUS基因上游,构建了含有不同DNA片段的重组质粒,转化大肠杆菌C600,获得了具Km抗性的转化子。通过三亲交配将上述重组质粒转移至发根农杆菌R1000(PRiA4b)中,用注射法,将各含重组质粒的发根农杆菌菌液感染甘草外植体,在含cb的无激素MS培养基上诱发毛状根并再生成植株。转化甘草具Km抗性,有甘露碱和农杆碱存在。经组织化学法检测,在转化株C2和C13的毛根、茎、叶中有靛蓝色沉淀物产生。证明大豆启动功能片段在转化甘草中启动了GUS基因表达。重组质粒的酶切分析证明C2和C13大豆DNA插入片段均约为0.8kb。DNA分子杂交也证明C2、C13 DNA与大豆DNA和转化株DNA有同源性。     

酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)启动子片段的亚克隆

含有3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的酿酒酵母染色体3.1kb HindⅢ片段,已被克隆到大肠杆菌-酵母菌穿梭载体pCN60上。Kpn Ⅰ核酸内切酶在pCN60上没有酶切位点,而在pCN60(PGK1)上仅有一酶切位点。用此酶将pCN60(PGK1)质粒完全酶切,再用Bal31从两端逐步消解碱基对,使反应终止于每端消解500bp左右,加上EcoR Ⅰlinker。用EcoRⅠ、BamH Ⅰ酶切,分离1. 9kb的DNA片段,插入用同样双酶切的酵母启动子探针载体pVC727上,转化E.coli C600,再从转化子中提取重组质粒转化酵母受体菌NA87-11A。用菌落染色法筛选出PHO5基因高效表达转化子,这个转化子质粒含有1.9kb的BamH Ⅰ、EcoRⅠ酶切片段,它具有强启动子功能,并测定其3'末端序列。     

酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)启动子片段的亚克隆

含有3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的酿酒酵母染色体3.1kb HindⅢ片段,已被克隆到大肠杆菌-酵母菌穿梭载体pCN60上。Kpn Ⅰ核酸内切酶在pCN60上没有酶切位点,而在pCN60(PGK1)上仅有一酶切位点。用此酶将pCN60(PGK1)质粒完全酶切,再用Bal31从两端逐步消解碱基对,使反应终止于每端消解500bp左右,加上EcoR Ⅰlinker。用EcoRⅠ、BamH Ⅰ酶切,分离1. 9kb的DNA片段,插入用同样双酶切的酵母启动子探针载体pVC727上,转化E.coli C600,再从转化子中提取重组质粒转化酵母受体菌NA87-11A。用菌落染色法筛选出PHO5基因高效表达转化子,这个转化子质粒含有1.9kb的BamH Ⅰ、EcoRⅠ酶切片段,它具有强启动子功能,并测定其3'末端序列。     

番茄1-氨基环丙烷羧酸(ACC)合成酶基因的反义RNA-核酶嵌合DNA序列的构建

根据番茄ACC合成酶基因（LE—ACC2）DNA序列,以番茄(LycopersiconesculentumMill)果实的总DNA为模板,利用PCR技术扩增得到预期大小的该基因编码区内部分DNA序列,插入到质粒载体pGEM—3zf(＋)的BamHⅠ和HindⅢ位点之间后转化E．coliDH—5α,可选出重组子pRE,经酶切,PCR及DNA序列分析证明克隆成功;将pRE上的目的DNA序列以反义方式构建到我室已合成并克隆的含核酶DNA序列的重组质粒pRⅠ的BamHⅠ和HindⅢ之间,构成含有反义RNA-核酶嵌合DNA序列的重组质粒pREⅠ,经酶切及序列分析,结果与预期一致.     

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白 CryⅣD基因在无晶体突变株中的克隆和表达

本文用HindⅢ/BamHⅠ对含Cry Ⅳ D基因的pGEMl质粒进行双酶切,获得了含CryⅣ和20-kDa蛋白质基因的5.4kb片段,将其与穿梭质粒pⅪ61连接,转化到感受态大肠杆菌TG1细胞,对克隆的重组质粒经质粒抽提,进行斑点杂交,Southern分析加以证实后,电转化到苏云金芽胞杆菌无晶体突变株Bti.IPS. 78/11细胞中,可形成不规则的六边形晶体。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳表明,工程菌表达72-kDa杀虫晶体蛋白和20-kDa的蛋白质,对致倦库蚊有很高的毒力,其LC_(50)值为0.53ug/ml。     

萘降解质粒ND1.860和NAH7的DNA同源性研究

通过DNA:DNA杂交技术,用NAH7质粒的全部EcoR Ⅰ片段或ECOR Ⅰ A片段作为~(32)P标记的DNA探针,研究了萘降解质粒ND1.860和NAH7之间的DNA同源性。在ND1.860的9个HindⅢ片段中,5个与NAH7有同源性,其中3个与NAH7的编码萘降解途径的EcoR Ⅰ A片段有同源性。     

北京鸭肝线粒体DNA的克隆

 本文采用限制内切酶HindⅢ切割经Sepharose 4 B柱纯化的北京鸭肝线粒体DNA,得到五个片段,其大小分别为:A——6.56kb,B——3.12kb,C——3.12kb,D——2.40kb,E——1.40kb。以质粒pWR33为载体,在HindⅢ切点处插入线粒体DNA的HindⅢ酶切片段,将体外重组质粒转化到大肠杆菌HB101内,经筛选、分析:如菌落原位杂交,限制性内切分析和Southern吸印法分析,首次得到了线粒体DNA的HindⅢB、C、D、E四个片段的克隆子。另外还得到了一个与片段A同源的1.60kb大小的片段。     

红霉素链霉菌聚酮合成酶基因eryA Ⅲ的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:在大肠杆菌中异源表达红霉素链霉菌聚酮合成酶eryA Ⅲ基因.方法:构建表达载体pET-m28a,PCR扩增高GC含量长片段基因eryA Ⅲ及分子伴侣GroELS的基因,并插入该载体,每个基因都能够独立启动和终止表达;将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达.结果:NdeⅠ、Hind Ⅲ分别酶切质粒pET-m28a/eryA Ⅲ-GroELS,琼脂糖凝胶电泳显示获得与预期大小相同的DNA片段;SDS-PAGE结果表明,重组大肠杆菌表达了由eryA Ⅲ编码的相对分子质量为348×103的蛋白;与GroELS共表达后,目的蛋白在上清中的表达量明显增加.结论:GroELS提高了eryA Ⅲ编码蛋白的可溶性,为红霉素合成通路在大肠杆菌中的重建奠定了基础.     

分子无性繁殖载体的组建——Ⅰ.乳糖操纵子的重组和表达

用包含乳糖操纵子的λplac 5 EcoR1 DNA片段与质粒pBR 322重组,获得一个重组质粒pMG4。几种限制性内切酶的分析结果表明,pMG4上乳糖操纵子(lac)和抗氨基苄青霉素基因的转录方向一致;Iac插入片段λ区的Hind Ⅲ切点和pBR 322抗四环素基因上的Hind Ⅲ切点相邻近。用pMG4 Hind Ⅲ片段转化大肠杆菌C_(600),筛选Ap~rTc~s lac~ 转化体,得到另一个lac重组质粒pMG401,在β-半乳糖苷酶结构基因近羧基端有一个EcoR1切点,插入外源基因可以置于lac控制下而实现表达。同时,我们还测定了包含pMG4、pMG401或λplac 5不同细胞的β-半乳糖苷酶活力,对lac的表达作了分析。     

MORPHOLOGY OF MARSILEA VESTITA. III. MORPHOGENESIS OF THE LEAVES OF ETIOLATED PLANTS

The laminae of etiolated Marsilea vestita leaves develop by means of marginal meristems. Unlike light-grown plants, the form of the etiolated plant is not affected by growth on a solid medium. All of the young leaves isolated from light-grown submerged plants will elongate in darkness. The smallest, etiolated, uncoiled leaves develop into land leaves when they are placed in light, and this development occurs regardless of whether the leaves remain on the plant or are isolated on nutrient agar. Only these smallest leaves (2.3 mm average length) are actually capable of being converted from a submerged leaf form to a land leaf form by darkness.     

滇丹参注射液对兔血小板功能的影响

观察云南产滇丹参对血小板聚集功能的影响.方法采用Bom氏比浊法,测定滇丹参体内、体外对抗ADP、PAF、AA诱导的兔血小板聚集的作用.体外每种药物浓度分别为40 g/L、20 g/L、10 g/L、5 g/L、2.5 g/L,体内实验分为7组,即生理盐水组、两种丹参低中高剂量组分别为5 g/kg、10 g/kg、20 g/kg,每组6只.结果与对照组相比,滇丹参体外显著抑制ADP、AA诱导的血小板聚集,抑制效应呈浓度-效应关系(P＜0.05,0.01),IC50为33.7 g/L(ADP)、18.1 g/L(AA).滇丹参也显著抑制PAF诱导的血小板聚集,其最大抑制率为36.8%;体内实验结果显示,滇丹参在高剂量时可显著抑制ADP、PAF和AA诱导的血小板聚集(P＜0.05,0.01),且均具有剂量依赖性.滇丹参在药后20 min开始显效,40 min达到最大抑制作用,抑制率分别为95.6%(ADP)、91.5%(PAF)和88.5%(AA).结论以上结果表明,滇丹参体外、体内显著抑制血小板聚集,且其抗血小板聚集作用优于丹参,为进一步开发和利用滇丹参提供了依据.