带芒草属低分子量谷蛋白基因的克隆及序列分析

在普通小麦中获得了大量的低分子量谷蛋白基因序列, 而在小麦近缘属物种中获得的同源基因则比较少, 导致对麦类低分子量谷蛋白基因家族成员间的关系还不清楚。因此, 进行近缘属物种低分子量谷蛋白基因的研究是非常必要的。此研究通过特殊设计的1对引物, 以小麦近缘属带芒草物种的基因组DNA为模板, 经过PCR和克隆, 从中得到了一条核苷酸序列长度为1 035 bp, 推测的氨基酸序列为343个氨基酸残基的低分子量谷蛋白基因, 该基因序列具有小麦低分子量谷蛋白基因的典型特征, 包括21个氨基酸残基的信号肽、13个氨基酸的N-端和由可重复的短肽单元组成的重复区以及1个C末端。序列比对结果揭示了来自带芒草的低分子量谷蛋白基因与小麦同源基因的差异及相互关系。此研究结果对从带芒草属以及其他小麦近缘属物种中分离未知低分子量谷蛋白基因有参考价值和借鉴意义。     

类大麦属高分子量谷蛋白基因Kx的序列测定及表达

利用SDS-PAGE检测了2份类大麦属(Crithopsis delileana)材料的高分子量谷蛋白亚基组成,并对其中1份材料的x型亚基进行了克隆和测序。结果表明,2份材料具有完全相同的蛋白电泳图谱。在小麦的高分子量区域仅检测到一条蛋白质带,与小麦y型亚基的迁移率接近,但克隆测序表明其为x型高分子量谷蛋白亚基,其编码基因命名为Kx。Kx基因编码区序列长度为2052bp．编码长度为661个氨基酸残基的蛋白质,其序列具有典型的x型高分子量谷蛋白亚基的特征。Kx基因能在原核表达系统内正确表达,其表达蛋白与来源于种子中的Kx亚基的迁移率完全一致。Kx亚基与小麦属A、B和D,山羊草属C和U以及黑麦属R染色体组编码的高分子量谷蛋白亚基氨基酸序列非常相似,但在N和C保守区的氨基酸组成以及重复区长度上与它们存在明显差异。聚类分析可将Kx与Ax1聚类为平行的分支。由此可见,来源于C．delileana的Kx基因为一新的x型高分子量谷蛋白亚基基因。     

小麦高分子量谷蛋白亚基Glu-B1位点沉默基因的克隆与序列分析

二粒小麦（Triticum turgidum L．var．dicoccoides）具有极其丰富的遗传多样性,是栽培小麦品种改良的巨大基因库。在高分子量谷蛋白基因的组成上,它具有许多栽培小麦不存在的变异类型,在Glu—B1位点上的变异更大。我们利用种子贮藏蛋白的SDS—PAGE方法从原产于伊朗的二粒小麦材料PI94640中观察到缺失Glu—B1区的高分子量谷蛋白亚基。利用Glu-1Bx基因保守序列设计PCR引物,对该材料的总DNA扩增,获得了X型亚基编码基因（Glu-1Bxm）的全序列,其全长为3442bp含1070bp的启动子区。序列比较发现,Glu-1Bxm在启动子区序列与Glu—1Bx7的最为相似。而在基因编码区,我们发现Glu—1Bxm仅编码212个氨基酸,由于开放阅读框中起始密码子后第637位核苷酸发生了点突变,即编码谷酰胺的CAA突变为终止密码TAA,可能直接导致了该高分子量谷蛋白亚基的失活,这是我们在小麦Glu—B1位点基因沉默分子证据的首次报道。将Glu—1Bxm全序列与Glu—B1位点其他等位基因进行了系统树分析,发现Glu—1Bxm是较为古老的类型。本文还对该特异高分子量谷蛋白亚基变异类型对品质遗传改良研究的意义进行了讨论。     

小麦新品种“川麦42”低分子量谷蛋白亚基新基因的分子克隆

采用PCR方法从小麦（Triticum aestivum L.）新品种“川麦42”中克隆得到一个低分子量谷蛋白亚基（LMW-GS）新基因,暂命名为LMWCM42-1。该基因编码区全长846 bp,编码281个氨基酸,具有LMW-GS基因的典型结构特征。推导氨基酸序列比较显示,尽管LMWCM42-1与已知LMW-GS高度相似,但在N-末端重复区部分重复单元和C-末端区中仍存在明显差异。聚类分析表明,LMWCM42-1可能是由Glu-D3位点编码的。     

类大麦属高分子量谷蛋白基因Kx的序列测定及表达

利用SDS_PAGE检测了2份类大麦属(Crithopsisdelileana)材料的高分子量谷蛋白亚基组成,并对其中1份材料的x型亚基进行了克隆和测序。结果表明,2份材料具有完全相同的蛋白电泳图谱。在小麦的高分子量区域仅检测到一条蛋白质带,与小麦y型亚基的迁移率接近,但克隆测序表明其为x型高分子量谷蛋白亚基,其编码基因命名为Kx。Kx基因编码区序列长度为2 0 5 2bp ,编码长度为6 6 1个氨基酸残基的蛋白质,其序列具有典型的x型高分子量谷蛋白亚基的特征。Kx基因能在原核表达系统内正确表达,其表达蛋白与来源于种子中的Kx亚基的迁移率完全一致。Kx亚基与小麦属A、B和D ,山羊草属C和U以及黑麦属R染色体组编码的高分子量谷蛋白亚基氨基酸序列非常相似,但在N和C保守区的氨基酸组成以及重复区长度上与它们存在明显差异。聚类分析可将Kx与Ax1聚类为平行的分支。由此可见,来源于C .delileana的Kx基因为一新的x型高分子量谷蛋白亚基基因。     

小麦高分子量麦谷蛋白亚基基因 Dx5 的克隆与生物信息学分析

小麦籽粒中高分子量麦谷蛋白的含量与小麦的品质密切相关。通过Blast检索和生物信息学分析设计小麦高分子量麦谷蛋白亚基基因Dx5的特异引物,以优质小麦济麦20基因组DNA为模板,通过PCR扩增后测序,获得长度为2 619 bp的序列。生物信息学分析表明其开放阅读框长度为2 520 bp,编码839个氨基酸残基,与GenBank数据库中的Dx5蛋白质一致性最高达到99%,且具有高分子量麦谷蛋白亚基结构域。该序列命名为JMDx5,提交GenBank数据库后被接收,登录号为KJ144185,为后续研究其表达机理及改良小麦品质奠定了基础。     

小麦HMW-GS 12基因克隆及植物表达载体构建

目的:为了利用基因遗传转化改良小麦品质,采用聚合酶链式反应(PCR)技术。方法:从小麦品种东农7742基因组DNA中扩增并克隆了小麦高分子量谷蛋白12亚基基因(HMW-GS 12)。结果:序列分析结果表明,该基因全长1 980bp,其核苷酸顺序和推导的氨基酸顺序与已发表的序列相比,同源性分别为99.5%和99.7%。经过基因拼接,分别构建了胚乳特异性表达和组成型表达的高分子量谷蛋白12亚基基因的两个植物表达载体pDNPPBIHG和pUbPBIHG。     

类大麦材料y型高分子量谷蛋白基因不表达的鉴定

利用SDS-PAGE检测了2份类大麦属植物的高分子量谷蛋白亚基组成,在小麦的高分子量区域仅检测到1条蛋白带,因此怀疑其y型亚基没有表达.根据其它高分子量谷蛋白提取方法的结果以及基因编码区部分序列测定,确认其y型高分子量谷蛋白基因是沉默的.     

血红密孔菌(Pycnoporussanguineus)漆酶基因的克隆与序列分析

为克隆血红密孔菌 (Pycnoporussanguineus)漆酶基因 ,根据真菌漆酶氨基酸序列保守区设计了 1对简并引物 .以血红密孔菌基因组DNA为模板 ,PCR扩增出长 12 2 7bp的漆酶基因片段 .以此序列为基础 ,通过 5′及 3′RACE技术克隆出漆酶全长cDNA序列 ,序列长为 190 2bp ,其 5′端和 3′端非编码区长分别为 5 1bp和 2 97bp ,开放阅读框长 15 5 4bp ,编码 5 18个氨基酸的蛋白 .该蛋白具有 4个铜离子结合区域 ,预测其相对分子量为 5 6 313 2 ,等电点为 5 5 9,其氨基酸序列与Pycnoporuscinnabarinus漆酶 (lcc3 2 )的同源性最高 ,为 96 % .以该cDNA编码区的两端序列为引物 ,PCR扩增得到漆酶的长度为 2 15 4bp的全长DNA序列 ,序列中包括 10个内含子序列 ,长为 5 2～ 70bp     

商陆高亲和性K＋转运体基因PaHAK1的克隆与表达分析

为了研究高钾植物商陆高亲和性K＋吸收机制,本试验选用野生商陆为材料,以拟南芥、冰叶日中花、小麦、大麦和水稻等多种植物的HAK家族基因的保守序列,设计简并引物,获得了981bp的PaHAK1的基因片段。然后应用RACE技术克隆到PaHAK1基因序列,其cDNA全长为2337bp,编码771个氨基酸。该编码蛋白质分子量为86．66kDa,等电点为7．54。蛋白质疏水性和拓扑结构分析显示该氨基酸序列共有12-13个跨膜区。该cDNA序列与冰叶日中花HAK1基因序列相似性高达88％。Real-TimePCR分析表明PaHAK1主要在商陆根中表达,低钾状态可以诱导PaHAK1的高表达。     

Development of primers specific for LMW-GS genes located on chromosome 1D and molecular characterization of a gene from Glu-D3 complex locus in bread wheat

Glutenins are multimeric aggregates of high molecular weight (HMW) and low molecular weight (LMW) subunits, which determine the quality in wheat. Development of locus-specific primers is an important step toward cloning specific LMW glutenin subunits (LMW-GS) by PCR method. Based on the publicly available, a pair of primer, namely primer 3 (5' TTGTAGAAACTGCCATCCTT 3') and primer 4 (5' GTCACCGCTGCAT CGACATA 3') was designed and verified to specific for LMW-GS genes located on chromosome 1D in this study. The LMW-GS gene located at the Glu-D3 locus in bread wheat cultivar Xiaoyan 6 was cloned using this pair of primer. The clone designated as XYGluD3-LMWGS1 (AY263369), contains the endosperm-specific-expression promoter and the entire coding region. Nucleotide sequence comparison of the XYGluD3-LMWGS1 with other reported LMW-GS genes located at different Glu-3 loci showed the degree of identity among them ranged from 59.57% to 99.78%. The LMW-GS genes at the same locus showed more similar to each other than to the gene at different locus. Comparison of the deduced amino acid sequence of the XYGluD3-LMWGS1 with the sequences of 12 group LMW-GSs of wheat cultivar Norin 61 showed that the deduced amino acid sequence was nearly the same to LMW-GS group 10 (identity 99.67%). The deduced LMW-GS contains nine cystine residues, which contained one more cystine residue in the C-terminal conserved domain than previous reported. This was the first LMW-GS gene encoding for a LMW-GS with 9 cystine residues that has been discovered so far.     

Characterization of low-molecular-weight glutenin subunit genes from Hordeum brevisubulatum ssp. turkestanicum

Three novel low-molecular-weight glutenin subunit (LMW-GS) genes (designated as Ht1, Ht2, and Ht3) were isolated from the genomic DNA of Hordeum brevisubulatum ssp. turkestanicum by PCR amplification (accession no. Y0695). The coding regions of Ht1, Ht2, and Ht3 were 924, 924, and 903 bp, respectively. The deduced amino acid sequences were 306, 306, and 299 amino acid residues each with a signal peptide, a central repetitive region rich in proline and glutamine, and N-and C-terminal non-repetitive domains. A comparison was carried out of these genes with other known B hordein genes from cultivated barley and LMW glutenin genes from wheat. The results indicated that Ht1, Ht2, and Ht3 had a more similar structure and a higher level of homology with the LMW-GS genes than the B hordein genes. In order to investigate the evolutionary relationship of the novel genes with the prolamin genes from barley and wheat, the phylogenetic tree was constructed and the subfamilies of these prolamin genes were identified. The results suggested that the three novel genes were glutenin-like proteins designated as LMW-m type genes. The text was submitted by the authors in English.     

苎麻细胞质雄性不育"三系"ISSR特异片段克隆和序列分析

利用ISSR分子标记技术对苎麻细胞质雄性不育"三系"mtDNA进行多态性分析;在选用的38个IS-SR引物中,有6个引物的扩增产物在不育系、保持系和恢复系之间存在差异。对这些特异性片段进行克隆和序列测定,结果表明:片段21-MS全长956bp,包含一个525bp的完整编码区,共编码174个氨基酸。片段31-M/R全长778bp,包含一个404bp的不完整编码区,共编码134个氨基酸;其核苷酸和氨基酸序列与已报道的多种植物中的番茄红素β-环化酶基因分别存在71～76和73～77的同源性。     

苎麻细胞质雄性不育“三系”ISSR 特异片段克隆和序列分析

利用ISSR 分子标记技术对苎麻细胞质雄性不育“三系”mtDNA 进行多态性分析; 在选用的38 个ISSR引物中, 有6 个引物的扩增产物在不育系、保持系和恢复系之间存在差异。对这些特异性片段进行克隆和序列测定, 结果表明: 片段21-MS 全长956 bp , 包含一个525 bp 的完整编码区, 共编码174 个氨基酸。片段31-M􊄯R 全长778 bp , 包含一个404 bp 的不完整编码区, 共编码134 个氨基酸; 其核苷酸和氨基酸序列与已报道的多种植物中的番茄红素β-环化酶基因分别存在71%～76%和73%～77%的同源性。     

Characterization of a Low-Molecular-Weight Glutenin Subunit Gene from Bread Wheat and the Corresponding Protein That Represents a Major Subunit of the Glutenin Polymer

Both high- and low-molecular-weight glutenin subunits (LMW-GS) play the major role in determining the viscoelastic properties of wheat (Triticum aestivum L.) flour. To date there has been no clear correspondence between the amino acid sequences of LMW-GS derived from DNA sequencing and those of actual LMW-GS present in the endosperm. We have characterized a particular LMW-GS from hexaploid bread wheat, a major component of the glutenin polymer, which we call the 42K LMW-GS, and have isolated and sequenced the putative corresponding gene. Extensive amino acid sequences obtained directly for this 42K LMW-GS indicate correspondence between this protein and the putative corresponding gene. This subunit did not show a cysteine (Cys) at position 5, in contrast to what has frequently been reported for nucleotide-based sequences of LMW-GS. This Cys has been replaced by one occurring in the repeated-sequence domain, leaving the total number of Cys residues in the molecule the same as in various other LMW-GS. On the basis of the deduced amino acid sequence and literature-based assignment of disulfide linkages, a computer-generated molecular model of the 42K subunit was constructed.     

版纳微型猪近交系AQP3克隆、序列分析及组织表达

目的 克隆版纳微型猪近交系aquaporin 3(AQP3)基因,并利用生物信息学方法分析其序列特征,研究其在猪各组织中的表达情况.方法 从版纳微型猪近交系脾脏中提取总RNA,利用RT-PCR方法扩增猪AQP3编码区序列,将纯化的片段与pMD18-T载体连接,转化宿主菌DH 5α,筛选阳性克隆进行测序.并采用半定量RT...