乳酸菌素Gassericin T基因的人工合成及其组成型表达载体的构建

目的:为了研究乳酸菌素Gassericin T的作用机制及应用价值,人工合成Gassericin T基因并构建能高效表达外源蛋白的毕赤酵母组成型表达载体。方法:应用PCR方法从毕赤酵母染色体中扩增GAP启动子,经测序正确后与已线性化的不含pAOX1启动子的毕赤酵母诱导型表达载体pPIC9K连接,转化大肠杆菌DH5α。根据Gassericin T的基因序列,把Gassericin T的结构基因gatA的密码子转换成毕赤酵母偏爱的形式,设计了6条59nt的寡聚核苷酸引物,通过3次连续PCR反应,人工合成gatA片段(简称gat基因),经测序正确后插入pGAP9K质粒的多克隆位点。结果:用GAP启动子(pGAP)取代了pPIC9K上的pAOX1,构建了毕赤酵母组成型表达载体pGAP9K;PCR拼接获得250bp的目的基因序列,将目的基因克隆于pGAP9K,获得组成型表达载体pGAP9K-gat。结论:为下一步在毕赤酵母中组成型表达外源蛋白,研究其作用机理和遗传机制奠定了基础。     

Gassericin T基因的合成及其组成型表达载体的构建

目的:构建Gassericin T基因毕赤酵母(Pichia pastoris)组成型表达载体。方法:根据乳酸菌素Gassericin T的基因序列,把Gassericin T的结构基因gatA编码的氨基酸的密码子转换成P.pastoris偏爱的形式,设计了6条59nt的寡聚核苷酸引物,通过3次连续PCR反应,获得了250bp左右的gat A片段(简称gat基因)。应用PCR方法从P.pastoris染色体中扩增了GAP启动子,大小为500bp左右,以其取代诱导型表达载体pPIC9K上的pAOX1,构建了组成型表达载体pGAP9K。将合成的gat基因克隆到pGAP9K质粒的多克隆位点中。结果:获得的gat及gap基因与预期结果一致,序列无碱基突变,构建的表达载体pGAP9K-gat经PCR、酶切鉴定完全正确。结论:成功构建了Gassericin T基因P.pastoris组成型表达载体,为下一步高效表达Gassericin T蛋白,进一步研究其作用机理及应用价值打下基础。     

家蚕抗菌肽-死亡素杂合肽基因在大肠杆菌中的克隆与表达

近年来的研究发现 ,抗菌蛋白在生物体非专一性防御系统有着重要的作用 ,已有数十种具有抗菌活性的多肽被分离 ,这些多肽可大致分为 3类 ,即含分子内二硫桥的抗菌肽 ;具有双亲α 螺旋结构的抗菌肽 ;以及富含某种氨基酸残基的抗菌肽[1 ] ,一般来说 ,这些抗菌肽具有分子量小 ,稳定性好 ,无细胞毒性 ,抗菌谱广等特点。多种抗菌肽的一级结构和二级结构已经确定[2 ] ,但作用机理仍不明了。一般认为可能存在两种作用模式 ,即 1)通过肽 脂膜相关作用杀菌 ;2 )通过受体介导的识别过程起作用[1 ] 。ＣｅｃｒｏｐｉｎＢ是一种较早从家蚕中分离得到 ,由 …     

LfcinB突变基因在大肠杆菌中的融合表达及其活性测定

测定LfcinB突变基因(mLfcinB)在大肠杆菌中的融合表达及其表达产物的抗菌活性。对LfcinB基因突变后进行克隆并测定序列,mLfcinB基因融合表达载体构建后并在大肠杆菌中的表达,分离提纯表达物并测定其活性。结果显示,Lf-cinB突变基因克隆后表达产物在经SDS-PAGE电泳,考马斯亮蓝G250染色可在29kD处看到预期的融合蛋白条带;对照组空质粒pGEX-4T-1经相同条件诱导后表达的蛋白为26kD。通过抑菌试验发现其对金黄色葡萄球菌ATCC25938具有较强抗菌活性。表明mLfcinB基因表达物具有较强的抗菌作用。     

蛙皮素-蜂毒素杂合肽基因在大肠杆菌中的克隆与诱导表达

抗菌肽 (Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌｐｅｐｔｉｄｅｓ)原指昆虫体内经诱导产生的一类分子量在 4ｋＤ左右 ,具有抗菌活性的碱性多肽物质[2 ] 。这类抗菌剂最初是从昆虫、哺乳动物、两栖动物等的防御系统中分离得到的。抗菌肽对革兰氏阳性及阴性细菌、病毒、原虫和发生病变的真核细胞等有杀伤作用 ,具有很强的广谱抑菌作用 ,但对正常哺乳动物细胞无杀伤作用[3 ] 。蛙皮素还具有抗肿瘤活性而没有溶血活性[4 ] ,虽然蜂毒素具有溶血活性 ,但其溶血功能区位于Ｃ端的亲水区域[5] ,两者的极性区域正好相反。据研究表明抗菌肽都会形成两亲螺旋结构的…     

家蚕抗菌肽-死亡素杂合肽基因在大肠杆菌中的克隆与表达

近年来的研究发现,抗菌蛋白在生物体非专一性防御系统有着重要的作用,已有数十种具有抗菌活性的多肽被分离,这些多肽可大致分为3类,即含分子内二硫桥的抗菌肽;具有双亲a-螺旋结构的抗菌肽;以及富含某种氨基酸残基的抗菌肽[1],一般来说,这些抗菌肽具有分子量小,稳定性好,无细胞毒性,抗菌谱广等特点.多种抗菌肽的一级结构和二级结构已经确定[2],但作用机理仍不明了.一般认为可能存在两种作用模式,即1)通过肽-脂膜相关作用杀菌;2)通过受体介导的识别过程起作用[1].     

猪肥胖基因在大肠杆菌中的高效融合表达

采用PCR方法扩增猪肥胖基因编码原成熟蛋白cDNA序列,并在5′端加上BamHⅠ位点,3′端加上EoRⅠ位点,将5′端密码子CCC转变为大肠杆菌常见密码子CCG,扩增得到459bp的片段,克隆于融合表达载体p GEX-2TBamHⅠ和EcoRⅠ位点,酶切、测序正确,经0．1mmol/LIPTG诱导表达出一条约42kD的融合蛋白,其中26kD为pGEX-2T中带有的谷胱苷肽转移酶,16kD是猪肥胖基因表达产物瘦蛋白。利用非融合表达产品制备抗血清,检测融合表达的重组蛋白,Western-blot为阳性。     

死亡素与泛素在大肠杆菌中的高效融合表达

死亡素是由21个氨基酸残基组成的广谱抗菌肽。为了高效表达可溶性的死亡素,本研究利用递归式PCR（recursive PCR, rPCR）扩增了死亡素基因thanatin,并将其和家蝇Musca domestica泛素基因ubiquitin构成嵌合基因,克隆到表达载体pET-32a,再与硫氧还蛋白融合后构建表达载体pET-TRX-UBI-THA。将酶切和测序鉴定正确的质粒转化表达宿主菌BL21,经0.6 mmol/L IPTG诱导,TRX-UBI-THA融合蛋白得到了高效可溶性表达。SDS-PAGE和Western blot检测结果表明融合蛋白的分子量为28.9 kD,与预期的结果一致,表达量占菌体总蛋白的46％。Western blot分析结果显示融合蛋白能与Ni-NTA鏊合物特异性的结合,表明在融合蛋白的N-端带有6×His标签。利用C-端带有6×His标签的泛素C-端水解酶对融合蛋白进行切割,切割产物经Ni²⁺-NTA亲和柱和HPLC纯化（纯化量为5.4 mg/L）,Tricince-SDS-PAGE电泳得到单一的泛素蛋白条带。电喷雾质谱(ESI-MS)分析表明,纯化的泛素分子量为2.57 kD,与通过氨基酸预测的分子量完全一致。利用琼脂孔穴扩散法对泛素活性进行检测,结果显示纯化的泛素对大肠杆菌K12D31和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus具有较强的活性抑制。本研究表明,利用泛素融合技术可以高效表达可溶性的死亡素。     

猪防御素基因PBD-I在大肠杆菌中的重组和融合表达

用RT-PCR方法获得PBD-I基因,将该基因插入原核表达载体PinPoint^TMXa-3中,重组质粒转化大肠杆菌JM109,经IPTG诱导后以融合蛋白形式表达。SDS-PAGE电泳显示PBD-I基因在目标位置17kDa处获得了表达。PBD-I基因的成功表达为进一步研究其抗菌活性、抗菌机理及应用研究形成基础。     

嗜水气单胞菌TPS-30株丝氨酸蛋白酶基因与溶血素基因在大肠杆菌中的融合表达

嗜水气单胞菌丝氨酸蛋白酶和溶血素是该菌重要的致病因子与保护性抗原。致病性嗜水气单胞菌TPS-30株为江浙一带鱼类暴发病病原主要血清型O:9的代表株。研究利用PCR方法扩增嗜水气单胞菌TPS-30株的丝氨酸蛋白酶基因(Spe)和溶血素基因(Hly),将基因Spe和Hly通过柔性片段进行融合,并将融合片段插入pET32a的多克隆位点,构建成重组融合表达载体pET32a-Spe-Hly。将重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经异丙醛-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,获得融合蛋白Spe-Hly。表达产物经SDS-PAGE检测,显示与预期大小约130kD相吻合的融合蛋白带。纯化融合蛋白并对鲫鱼进行免疫攻毒试验。结果表明,丝氨酸蛋白酶基因和溶血素基因融合表达载体构建成功,并成功获得了融合蛋白Spe-Hly,对鲫鱼的免疫保护率达81.4%。这为基因工程亚单位多价疫苗的开发提供基础。       

人工合成人溶菌酶基因在大肠杆菌中表达

利用DNA重组技术生产自然界不能或难以得到的多肽产品用于医药、农业、食品工业等领域,目前在生物领域已有了很大的进展。近年来,科学工作者经体外合成人溶菌酶基因,经克隆、转化,在真核、原核细胞中获得表达^[1-3]。溶菌酶能水解革兰氏阳性菌细胞壁上的β-1,4糖苷键,在内部渗透压的作用下,细胞胀裂开[4,5]。它对有些革兰氏阴性菌,如埃希氏大肠杆菌、伤寒沙门氏菌,也有同样作用。因此此酶在食品,特别是在医药上具有重要意义。在这篇文章中,我们报道人工合成人溶酶的克隆和在 温控启动子P_RP_L调控下在大肠杆菌中的表达。     

解毒酶基因的克隆及在大肠杆菌中的融合表达

用RT－PCR克隆了酯酶B1 5′端B1（a）,并对其者了序列测定,将其与3′端B1（b）一起连接到pET-28a中,构了完整融合表达载体pET-ESTB1。转化大肠杆菌BL21,在IPTG诱导下,经过12小时,酯酶B1在大肠杆菌内的融合表达达到27％。通过纯化获得1条带的重组蛋白,用粗酶对马拉硫磷的降解显示,该解毒酶在15分钟即降解22.1％,具有较高降解有机磷酸酯类农药的能力,为利用真核生物的自然资源进行农药污染的生物治理等提供了新途径。     

霍乱毒素B亚单位与胰岛素原融合基因的克隆、表达及重组蛋白特性分析

构建了霍乱毒素B亚单位 (CholeratoxinBsubunit,CTB)与胰岛素原 (Proinsulin)的融合基因CTB -PROIN ,将该融合基因克隆到大肠杆菌表达载体pET 30a(+)中 ,获得重组质粒pETCPI,并将该质粒转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)中 ;重组菌株经IPTG诱导后 ,其表达产物经过 15 %SDS PAGE分析表明该菌株可以表达融合蛋白 ,其分子量约为 21.6kD ,且主要以包涵体形式存在 ,约占全菌蛋白的 25%。含CTB-PROIN重组蛋白的包涵体经过变性和复性后 ,CTB-PROIN可以在体外自组装成五聚体结构。Westernblotting分析结果表明重组CTB PROIN蛋白可分别被霍乱毒素的抗体和胰岛素的抗体识别 ,说明该蛋白具有霍乱毒素和胰岛素的双重抗原性。同时在体外 ,CTB PROIN蛋白可与神经节苷脂GM1(monosialoganglioside)特异性结合 ,表明了该融合蛋白在体外具有生物活性。这些研究结果为利用原核生物表达系统研制廉价、高效的I型糖尿病口服疫苗奠定了基础。     

人工会成柞蚕杀菌肽D基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

以质粒pWR450为载体,克隆了人工合成的柞蚕杀菌肽D基因(122bp),构建的重组子pWR450-Cec转化大肠杆菌JM103、用限制性内切酶酶切鉴定。产物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,结果显示可表达杀菌肽-β-gal融合蛋白。     

抗菌肽Diptericin cDNA的克隆及在E.coli中的融合表达

 从果蝇成虫中抽提总 RNA,RT- PCR扩增编码伏蝇素 diptericin的 c DNA,克隆并测定了全序列 .将该 c DNA亚克隆到融合表达载体 p MAL- CR1上 ,转化大肠杆菌 BL2 1菌株 ,进行了高效的可溶性融合表达 .通过离子交换层析纯化融合蛋白 ,经 Xa因子酶切后得到的重组 diptericin具有抗菌活性 .     

人自身抗原SmB'的基因克隆和原核表达

目的:为建立新的自身抗体检测方法,自行克隆、表达和鉴定人自身抗原SmB'。方法:应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,从白血病淋巴细胞HL-60细胞株中克隆人自身抗原SmB'全长基因;将PCR产物直接进行TA克隆、鉴定及测序,再定向克隆至pGEX-5T载体中,转入大肠杆菌BL-21;阳性克隆经鉴定后在IPTG诱导下表达,产物行SDS-PAGE和Western印迹。结果:PCR产物长约700bp,与预期的657bp接近,测序结果与GenBank核酸数据库报道完全一致。pGEX-5T-SmB'重组阳性克隆酶切鉴定正确,SDS-PAGE和Western印迹结果显示融合蛋白相对分子质量为51000,具有天然人自身抗原SmB'的免疫原性。结论:克隆表达了人自身抗原SmB',为建立相应的自身抗体检测方法奠定了基础。