组胺对肺动脉内皮细胞一氧化氮合酶基因表达的影响

本实验研究了组胺对原代培养的肺动脉内皮细胞一氧化氮合酶(nitric oxidCsynthase,NOS)基因表达的影响及分子机制。采用RT-PCR和免疫印迹技术分别检测mRNA和蛋白质的表达水平,用荧光素酶报告基因实验检测eNOS基因转录起始点上游长1.6-kb的启动子活性,用硝酸还原酶法检测NO的产量。结果发现,组胺增强eNOS表达,呈浓度和时间依赖性,10μmol/L组胺处理肺动脉内皮细胞24h可使eNOS mRNA和蛋白质的表达达到高峰,eNOS mRNA水平为正常对照组的160.8±12.2%(P<0.05),蛋白质水平为正常对照组的136.2±11.2%(P<0.05)。特异性CaMK Ⅱ抑制剂KN-93可抑制组胺的这一效应,表明组胺可通过激活CaMK Ⅱ增强肺动脉内皮细胞eNOS基因的表达。报告基因实验表明,10μmol/L组胺处理24h后肺动脉内皮细胞eNOS基因启动子的活性增强,为正常对照组的148.2±33.7%(P<0.05)。组胺可使肺动脉内皮细胞产生NO增加。这些结果表明组胺在转录水平增强肺动脉内皮细胞eNOS基因的表达,并使细胞产生NO增加,这可能是组胺调节肺血管张力的机制之一。CaMK Ⅱ可能是组胺增强肺动脉内皮细胞eNOS基因表达的途径之一。     

缺氧时肺动脉内皮细胞与肺动脉平滑肌细胞增殖的相互影响

血管内皮细胞和血管平滑细胞在结构和功能上关系密切,两者的相互在与血管舒缩笔血和壁结构。本文观察了培养的小牛肺动脉内皮细胞（ＰＡＥＣｓ）和肺动平滑肌细胞（ＰＡＳＭＣＳ）缺氧时在细胞增殖方面的相互影响。ＰＡＳＭＣＳ常氧条件培养基（ＣＭ）可使ＰＡＥＣＳ的＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入降低约５８％,缺氧ＣＭ对ＰＡＥＣＳ的＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入无明显的抑制作用;ＰＡＥＣＳ的常氧ＣＭ使ＰＡＳＭＳ的＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入升高约６０     

家兔侧脑室注射组胺对肺动脉血压的影响

本工作将组胺(HA)注入麻醉家兔侧脑室,观察其对肺动脉血压的影响。结果观察到(1)侧脑室注射HA(50μg)后,肺动脉压和心输出量出现升高、降低和先降后升三种变化,但以升高反应较为多见。发生上述反应时,颈动脉压升高,心率减慢。(2)切断两侧颈部迷走神经或用心脏人工起搏固定心率后,肺动脉压和心输出量均不再下降而出现恒定的升高反应。静脉注射酚妥拉明可部分阻断HA引起的肺动脉和颈动脉升压反应,但不能阻断心输出量的升高。静脉注射心得安能完全阻断HA引起的心输出量升高,但对肺动脉和颈动脉的升压反应无影响。静脉注射六甲双铵或联合应用酚妥拉明和心得安可完全消除HA引起的肺动脉压、颈动脉压和心输出量的升高反应。(3)HA的心血管效应可被H_1受体阻断剂扑尔敏阻断,但不能被H_2受体阻断剂甲氰咪胍阻断。 实验结果表明:家兔侧脑室注射HA后,在中枢H_1受体的介导下,可通过交感神经使心输出量增加,肺血管和外周血管收缩,因而肺动脉压和颈动脉压上升;也可通过迷走神经使心率减慢。而HA引起的肺动脉压下降则是继发性的,是由于心率减慢,心输出量减少所致。     

缺氧对肺动脉内皮细胞MMP-2、MMP-9表达的影响

目的观察缺氧对培养的猪肺动脉内皮细胞基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达的影响.方法采用RT-PCR、Western blot、底物胶电泳(酶谱图)、免疫细胞化学等方法.结果肺动脉内皮细胞缺氧24h可使MMP-2的mRNA表达和蛋白分泌减少,酶活性减弱,与常氧组比较有显著性差异, MMP-9无明显变化.结论缺氧时MMP-2降低,溶解细胞外基质的能力降低,可能是缺氧性肺血管构型重组的机制之一.     

慢性缺氧的猪肺动脉内皮细胞在急性缺氧时PDGF-B链mRNA的表达

采用原位杂交技术结合图象分析检测常氧(PO2±21.3kPa)及慢性缺氧(P025.3±0.7kPa)培养的猪肺动脉内皮细胞PDGF-BmRNA的表达及其对急性缺氧刺激的反应.结果常氧及慢性缺氧培养的肺动脉内皮细胞(PAEC)在急性缺氧后PDGF-BmRNA表达均增加(P＜0.05),以第4、6代慢性缺氧组升高的幅度更大.结果表明慢性缺氧可增强PAEC在急性缺氧时PDGF-BmRNA的表达,可能促进肺血管改建和肺动脉高压的发展.     

缺氧对肺动脉内皮细胞环氧合酶,血栓素合成酶基因表达的影响

应用分子杂交技术和放射免疫检测方法研究了缺氧对猪肺动脉内皮细胞的环氧合酶（ＣＯＸ）和血栓素合成酶（ＴＸＳ）基因表达及其条件培养基中６ｋｅｔｏＰＧＦ１α和ＴＸＢ２含量的动态变化。发现：６,１２,２４和４８ｈ缺氧组分别与常氧组比,ＣＯＸ１和ＣＯＸ２基因表达增加,并且ＣＯＸ２ｍＲＮＡ在缺氧６和１２ｈ就明显表达增加。在前述的不同缺氧时间组内皮细胞条件培养基中６ｋｅｔｏＰＧＦ１α含量也均显著高于相应常氧对照组（Ｐ＜０．０５）;但ＴＸＳ的ｍＲＮＡ水平及ＴＸＢ２含量在缺氧４８ｈ才有明显增加（Ｐ＜０．０５）。结果表明：（１）缺氧可诱导肺动脉内皮ＣＯＸ基因表达和ＰＧＩ２生成增加,在早期以ＣＯＸ２基因表达增加更为明显,提示可能在肺血管缺氧反应中起调节作用。（２）４８ｈ的缺氧可使内皮细胞ＴＸＳ基因表达及ＴＸＡ２生成增加,它可能在慢性缺氧肺血管反应中起介导作用。     

5—羟色胺对肺动脉平滑肌细胞在缺氧条件下增殖的作用

本研究应用细胞培养、＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入,核酸分子杂交、免疫组织化学染色技术,探讨无氧（０％Ｏ２＋９５％Ｎ２＋５％ＣＯ２）和／或低氧（２．５￣３％Ｏ２＋９２％Ｎ２＋５％ＣＯ２）对新生小牛肺动脉平滑肌细胞增殖和５－羟色胺转载体基因表达的影响。结果表明：无氧２４ｈ可刺激ＰＡＳＭ的ＤＮＡ合成,＾３Ｈ－ＴｄＲ的掺入增加（Ｐ〈０．０５）,加入５－羟色胺能非常显著地促进无氧ＰＡＳＭ增殖（Ｐ〈０．００１）,而对常     

内皮素－1对缺氧肺动脉平滑肌细胞的增殖作用

内皮素（ＥＴ）是至今所发现的最强的内源性血管收缩肽,近年来发现ＥＴ－１能促进血管平滑肌细胞增殖。本研究表明ＥＴ－１对缺氧培养的肺动脉平滑肌细胞（ＰＡＳＭＣ）有剂量依赖的增殖作用,缺氧可促进ＰＡＳＭＣ的ＤＮＡ合成且增加ＥＴ－１的丝裂原作用。ＥＴ－１的丝裂原作用主要由其Ａ型受体（ＥＴＲ＿Ａ）所介导,ＥＴＲ＿Ａ的特异拮抗剂ＢＱ１２３可显著抑制缺氧以及缺氧与ＥＴ－１协同所产生的增殖作用,而且发现ＥＴＲ＿Ａ在缺氧培养的ＰＡＳＭＣ中的表达显著高于常氧对照组ＰＡＳＭＣ。本研究表明ＥＴ－１参与了缺氧性肺动脉结构重组,而缺氧可增强ＰＡＳＭＣ对ＥＴ－１的增殖反应性。     

慢性缺氧大鼠肺动脉内皮依赖性舒张反应与内皮结构的动态…

本实验对慢性减压缺氧（５０００ｍ）过程中肺动脉ＡＣｈ内皮依赖性舒张反应作了动态观察,并结合分析了其与内皮超微结构和肺动脉压演变的关系。结果表明,缺氧３－２１ｄ,平均肺动脉压（ｍＰＡＰ）显著递增（Ｐ＜０．０５－０．００１）,而缺氧４０ｄ组基本与缺氧２１ｄ组持平,未再进一步升高。缺氧１ｄ组,各ＡＣｈ浓度（１０＾－１０,１０＾－９,１０＾－７,１０＾－６,１０＾－５ｍｏｌ／Ｌ）引起的内皮依赖性舒张反应明     

急性缺氧所致大鼠肺动脉内皮依赖性收缩反应

本实验初步证实,急性缺氧可使大鼠肺动脉产生内皮衍生收缩因子,并对其性质作了初步探讨。急性缺氧可使离体大鼠肺内和肺外动脉产生收缩反应,当灌流液氧分压从约17.3kPa降低到4kPa时(pH7.40～7.48),肺内和肺外动脉的基础张力分别比原来静息张力增加了37.5±5.1mg(n=4)和33.2±1.9mg(n=6);当氧分压恢复到约17.3kPa时,肺动脉基础张力也降到缺氧前的静息张力水平,即肺内动脉约300mg,肺外动脉约400mg。去掉内皮细胞后,急性缺氧引起的肺动脉收缩反应消失。消炎痛、去甲二氢愈创木脂酸、阿托品和酚妥拉明均不能阻断急性缺氧所致大鼠肺动脉内皮依赖性收缩反应。急性缺氧可诱发大鼠肺动脉内皮细胞产生释放非花生四烯酸环氧酶和脂氧酶代谢产物的内皮衍生收缩因子。     

应用激光共聚焦扫描显微镜技术检测缺氧人肺微血管内皮细胞内钙离子浓度动态变化

目的：探讨应用激光共聚焦扫描显微镜（LSCM）技术检测缺氧状态的人肺微血管内皮细胞（HPMVEC）内钙离子（Ca2＋）浓度动态变化的价值。方法：HPMVEC常规培养,按观察时间点不同分为5个缺氧培养组（1h hyp组、2h hyp组、4h hyp组、6h hyp组和8h hyp组）以及1个对照组（0h con组）共6个组,每组设8个复孔,应用LSCM技术测定缺氧后HPMVEC内Ca2＋浓度水平及随时间推移的变化。结果：LSCM技术显示HPMVEC内Ca2＋的荧光强度1h hyp组与0h con组比较、2h hyp组与1h hyp组比较、4h hyp组与2h hyp组比较、6h hyp组与4h hyp组比较、8h hyp组与6h hyp组比较有显著差异（P〈0.05）。线性回归分析结果显示Ca2＋荧光强度与缺氧时间成正相关（r=0.969,P〈0.01）。结论：HPMVEC内Ca2＋浓度随缺氧时间增长而增高;LSCM在动态检测缺氧状态下HPMVEC内的Ca2＋浓度变化中具有明显优势。     

钙离子浓度动态变化

目的:探讨应用激光共聚焦扫描显微镜(LSCM)技术检测缺氧状态的人肺微血管内皮细胞(HPMVEC)内钙离子(Ca2+)浓度动态变化的价值。方法:HPMVEC常规培养,按观察时间点不同分为5个缺氧培养组(1h hyp组、2h hyp组、4h hyp组、6h hyp组和8h hyp组)以及1个对照组(0h con组)共6个组,每组设8个复孔,应用LSCM技术测定缺氧后HPMVEC内Ca2+浓度水平及随时间推移的变化。结果:LSCM技术显示HPMVEC内Ca2+的荧光强度1h hyp组与0h con组比较、2h hyp组与1h hyp组比较、4h hyp组与2h hyp组比较、6h hyp组与4h hyp组比较、8h hyp组与6h hyp组比较有显著差异(P<0.05)。线性回归分析结果显示Ca2+荧光强度与缺氧时间成正相关(r=0.969,P<0.01)。结论:HPMVEC内Ca2+浓度随缺氧时间增长而增高;LSCM在动态检测缺氧状态下HPMVEC内的Ca2+浓度变化中具有明显优势。     

低氧促进大鼠肺动脉平滑肌细胞Periostin表达及其信号转导机制

观察低氧对大鼠肺动脉平滑肌细胞（pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs）Periostin表达的影响及其相关信号转导机制。胶原酶I法原代培养PASMCs,经低氧（5％O2）分别处理PASMCs2,6,12,24h后,RT-PCR和Western blot法检测Periostin mRNA和蛋白表达。加入PI3K/Akt通路特异性抑制剂LY294002（10μmol／L）进行干预,Western blot分析比较不同条件下低氧处理24h后大鼠PASMCs中Periostin和Akt／P-Akt的蛋白表达。结果表日月,与常氧组比较,低氧处理6h组、12h组和24h纽Periostin mRNA和蛋白的表达均显著上升（P〈0．05,P〈0．01）,低氧处理后的PASMCs中Periostin mRNA和蛋白的表达逐渐升高：低氧处理2h组无显著差异（P〉0．05）。用LY294002对PASMCs处理,并低氧24h后,Periostin的表达被显著抑制（P〈0．01）,细胞P-Akt的表达下调（P〈0．05）,总Akt的蛋白表达没有明显差异（P〉0．05）。推测低氧可诱导大鼠PASMCs中Periostin mRNA和蛋白的表达上调。低氧可能通过激活P13K/Akt通路促进Akt的磷酸化,进而使Periostin在PASMCs中过表达,提示Periostin在低氧性PASMCs增殖过程中可能起着重要作用。     

钙对低氧胁迫下黄瓜幼苗体内多胺及多胺氧化酶的影响

以‘中农8号’黄瓜品种为实验材料,采用营养液栽培法研究了钙对根际低氧胁迫下黄瓜幼苗体内多胺(PAs)含量及多胺氧化酶(PAO)活性的影响。结果表明:(1)各处理黄瓜幼苗根系和叶片中的PAs含量以及3种形态的腐胺(Put)、亚精胺(Spd)、精胺(Spm)含量均表现为低氧高钙(8 mmol.L-1Ca2 )>低氧常钙(2 mmol.L-1Ca2 )>低氧缺钙(0 mmol.L-1Ca2 )>通气常钙(2 mmol.L-1Ca2 )处理,而PAO活性却表现出相反的趋势(通气常钙>低氧缺钙>低氧常钙>低氧高钙),且处理间大多存在显著差异(P<0.05);根系中的PAs含量明显高于叶片,而PAO活性明显低于叶片。(2)黄瓜幼苗体内3种形态的PAs以游离态含量最高,其次是结合态,最低为束缚态;游离态和结合态PAs在叶片中均以Spd为主,在根系中均以Put为主,束缚态PAs含量在根系和叶片中均为Spd>Put>Spm。研究表明,在低氧胁迫下,营养液加钙引起黄瓜幼苗体内多胺含量的上升和PAO活性下降,钙参与了黄瓜幼苗体内多胺的代谢过程,对缓解低氧胁迫有重要作用。     

Hypoxia induces nitric oxide synthase in rheumatoid synoviocytes: consequences on NADPH oxidase regulation

Abstract

We investigated the effects of hypoxia on inducible NO synthase (iNOS) activity and expression in rheumatoid arthritis (RA) synoviocytes. We further studied the relationship between nitrosative stress and NADPH oxidase (NOX) in such conditions. Human cultured synoviocytes were treated for 24 hours with IL-1β, TNF-α or neither, and submitted to hypoxia or normoxia for the last 6 hours. Nitrite production and iNOS expression were increased under hypoxia conditions in RA cells in comparison to normoxia. Hypoxia did not potentate the basal and cytokine-induced superoxide productions, while NOXs’ subunit expression and p47-phox phosphorylation were increased. Nitrosylation of NOXs and p47-phox was not raised under hypoxia conditions. Finally, peroxynitrite production was significantly increased under hypoxia conditions, in comparison to normoxia. Our results provide evidence for upregulation of iNOS and NOX activities in RA synoviocytes under hypoxia conditions, associated to an increased peroxynitrite production. Synovial cell metabolism under hypoxia conditions might be different from that in normoxia.     

Cytotoxicity-Associated Effects of Reactive Oxygen Species on Endothelin-1 Secretion by Pulmonary Endothelial Cells

In this study bovine pulmonary artery endothelial cells (BPAEC) were used as a model system to investigate the effects of the hypoxanthine–xanthine oxidase (HXXO) oxygen radical donor system on ET-1 secretion into pulmonary vasculature. Incubation of BPAEC with HXXO for 4 h caused a significant reduction in ET-1 secretion, which was significantly offset by allopurinol or catalase, but not by Cu/Zn superoxide dismutase (SOD). ET-1 secretion was also reduced by H₂O₂, and this effect was again significantly offset by catalase. XO alone also reduced ET-1 secretion, but to a significantly lesser degree than did HXXO, and this effect was not offset by allopurinol, catalase, or SOD. None of the oxidant treatments were associated with a loss of immunoreactive ET-1 from endothelial cell medium containing synthetic peptide. The HXXO- and H₂O₂-mediated reductions in ET-1 secretion were accompanied by evidence of reduced cell viability. This loss of viability was absent when cells were treated with HXXO + catalase, allopurinol, or mercaptopropionyl glycine, but not when SOD was present. We conclude that under conditions of oxidative stress, the pulmonary vascular endothelium responds by secreting less ET-1. This may be relevant to its vasodilator functions in the pulmonary vasculature, which would therefore be compromised when the endothelium is exposed to oxidant stress.     

Ca/CaM与缺氧肺动脉平滑肌细胞增殖的关系研究

目的:探讨缺氧时钙内流、钙调素、NF□κB与肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)增殖的关系。方法:组织块贴壁法培养成年大鼠PASMCs,细胞分组处理后,分别应用四甲基偶氮唑(MTT)检测细胞数量、流式细胞术检测细胞周期分布和增殖指数、免疫荧光检测增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)表达。结果:2%O_2条件下培养12h显著刺激PASMCs增殖,与常氧组相比,细胞活力增加40%,增殖指数(proliferation index,PI)是常氧组的1．46倍, PCNA表达增强。L-型钙通道阻滞剂硝苯吡啶(nifedipine,NFD,10μM)、钙调素拮抗剂三氟拉嗪(trifluoperazine,TFP,10μM)、核转录因子NF□κB抑制剂PDTC(20μM)均抑制了缺氧诱导的PASMCs的增殖,其抑制作用的强度依次为NFD＜PDTC＜TFP。结论:钙信号转导参与缺氧诱导的PASMCs增殖,涉及通过L-型钙通道的钙内流、钙调素以及转录因子NF-κB激活等环节。     

钙参与铜诱导的小麦根中NADPH氧化酶活性的升高

研究钙离子(Ca~(2 ))在重金属铜诱导的小麦根质膜NADPH氧化酶活性变化中作用的结果表明,Ca~(2 )以剂量依赖的方式提高NADPH氧化酶活性,且这种增加效应可完全为Ca~(2 )螯合剂乙二醇-双-(2-氨基乙基)四乙酸(EGTA)所抑制.用Ca~(2 )通道阻断剂氯化镧和异搏定以及EGTA预处理小麦根可抑制铜诱导的NADPH氧化酶活性升高,这类抑制效应也是剂量依赖的。这些结果说明Ca~(2 )参与铜诱导小麦根NADPH氧化酶活性和活性氧产生的调节过程.     

内皮细胞电压门控钙离子通道及其功能研究进展

内皮细胞（endothelial cell,EC）作为不可兴奋细胞,早前通常被认为缺乏功能性电压门控钙离子通道（voltagegated calcium channel,VGCC）,如人脐静脉内皮细胞、牛肺动脉内皮细胞、牛主动脉内皮细胞等。随着膜片钳技术、荧光显微技术、聚合酶链式反应（PCR）技术的发展,越来越多的VGCC在各种内皮细胞中被发现,如人主动脉内皮细胞、大鼠主动脉内皮细胞、大鼠肺微血管内皮细胞等。目前对于VGCC存在与否主要有3种检测方法:利用膜片钳技术对离子通道电流的检测、利用荧光显微技术对胞内钙离子浓度变化的检测、利用PCR技术对离子通道基因或蛋白质表达的检测。内皮细胞不单单是血液和其他相邻组织细胞及基质蛋白间的物理屏障,更重要的是通过细胞膜上VGCC的开放和关闭对细胞和血管组织的生理变化产生显著的影响。一方面,VGCC对胞内钙离子浓度变化的影响,控制着一氧化氮（NO）等血管舒张因子的释放,调节血管张力的平衡。另一方面,作为钙离子内流重要途经的VGCC,经过Ras和MEK通路的诱导、磷酸化PI3K和Akt通路,影响内皮细胞迁移和增殖。此外,部分生理现象,如血管内压力产生...     

MicroRNA-18a通过HIF-1-alpha调控缺氧引起的人肺动脉平滑肌细胞增殖

目的：研究microRNA-18a (miR-18a) 对缺氧引起的人肺动脉平滑肌细胞(human pulmonary artery smooth muscle cells, hPASMCs)增殖的调控作用及其可能机制。方法：体外培养hPASMCs,分为未转染组、miR-18a 模拟物对照组、miR-18a 模拟物组、 miR-18a 抑制剂对照组、miR-18a 抑制剂组、siRNAcontrol组、siHIF-1-alpha组、miR-18a 抑制剂和siHIF-1-alpha共转染组。分别于常氧(21% O2)和低氧(3%O2)作用24小时。采用CCK-8 法检测细胞的增殖情况,萤光素酶报告基因系统验证缺氧诱导因子-1-alpha(HIF-1alpha)是 否为miR-18a 的靶基因,并通过western-blot 以及实时荧光定量PCR 技术检测相关蛋白和基因的表达。结果：缺氧可促进 hPASMCs 增殖,使miR-18a 表达减少;miR-18a 模拟物可抑制hPASMCs 增殖,而miR-18a 抑制剂可促进hPASMCs 增殖;抑制 miR-18a 可使HIF-1-alpha的表达上调。同时抑制miR-18a 和HIF-1-alpha,可使miR-18a 对hPASMCs 增殖调控的能力消失。结论：缺氧通 过抑制miR-18a,上调HIF-1-alpha的表达,促进hPASMCs增殖。