马立克氏病病毒的分子生物学研究进展

马立克氏病病毒的分子生物学研究进展罗满林,蔡宝祥,陈溥言（南京农业大学动物医学系,南京２１００９５）ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆＭａｒｅｋ＇ｓＤｉｓｅａｓｅＶｉｒｕｓ￥ＬｕｏＭａｎｌｉｎ;ＣａｉＢａｏｓｉａｎｇ;ＣｈｅｎＰ...     

接种不同毒力的马立克氏病病毒后鸡病毒血症的动态比较

1日龄非免疫鸡分别接 马立克氏病病毒（MDV）Ⅰ强毒GA株、Ⅰ型MDV疫苗毒CVI988株和Ⅲ型火鸡疱疹病毒（HVT）疫苗株后第4日起,定期采血并和抗MDV囊膜糖蛋白B(gB)单克隆抗体介导的间接免疫荧光试验检测MDV在外周因液单核细胞（PBMCs）中的感染状况。结果发现,自接种Ⅰ型强毒GA株后第4日至鸡发病死亡前,都能检出GA株引起的病毒血症,并于2周左右达到高峰;自接种CVI988株后第4日至第20日止,能检出病毒血症,并于第8天左右达到高峰;自接种HVT后第4日至第16日止,能检出病毒血症,并于第6天左右达到高峰。与此同时,将GA株病毒血症的IFA检测结果与细胞培养上病毒空班计数试验结果比较,发现IFA试验比空斑计数试验更为敏感。本试验既可用于判断对鸡作MDV疫苗免疫的接种效果,又可用于检测MDV野毒感染状态。     

鸡马立克氏病病毒糖蛋白gB基因的表达及基因免疫

将马立克氏病病毒(Marek's disease virus,MDV)gB基因插入真核表达载体pcDNA3中,经酶切和PCR鉴定为正向插入了gB基因的重组质粒,命名为pcDNA3-gB。体外转染COS-7细胞,经间接免疫荧光染色证实转染pcDNA3-gB后的COS-7细胞内有糖蛋白B的表达。用pcDNA3-gB对从肉用雏鸡腿部肌肉注射,进行一免。间隔2周后,用pcDNA3-gB再加强免疫一次。之后2周攻毒,观察免疫保护效果。结果表明,MDV gB基因DNA免疫可以诱导鸡体产生免疫保护,免疫保护指数为72．2％。     

马立克氏病病毒超强毒感染鸡羽髓蛋白质组分析

【目的】羽毛是细胞游离马立克氏病病毒(Marek’s disease virus,MDV)释放的部位,为了解感染MDV后鸡羽中宿主基因表达的变化及对病毒感染的应答,进行了MDV感染鸡的羽髓蛋白质组学分析。【方法】1日龄无特定病原体(specific pathogen free,SPF)鸡人工感染MDV超强毒RB1B株(1000PFU),感染后21d采集鸡羽毛,提取羽髓蛋白,以17cm,pH5-8的IPG胶条进行二维电泳,以未感染病毒的SPF鸡羽髓蛋白为对照,使用PDQuest软件对二维电泳图谱进行差异蛋白分析,并选取部分差异斑点进行质谱鉴定。【结果】PDQuest软件分析发现攻毒组和对照组表达差异大于两倍的蛋白点有41个,其中攻毒组表达上调的蛋白点25个,下调的蛋白点7个,新出现的蛋白点有9个。质谱分析共成功鉴定了21个斑点,对应于20个蛋白。如载脂蛋白AI(apolipoprotein AI)、14-3-3 sigma(两个斑点均为该蛋白)、癌蛋白18(stathmin)等。【结论】功能预测表明这些蛋白涉及到宿主的抗病毒应答、物质代谢、细胞骨架成分、细胞增殖相关等方面。     

阿尔茨海默病中Toll样受体与小胶质细胞的关系

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是老年人常见的一种神经退行性疾病。目前AD的发病机制还不是很清楚,但大多数学者认为淀粉样蛋白沉积激活神经胶质细胞所导致的炎症反应是其核心病理机制,其中小胶质细胞是主要的炎症细胞。近期研究表明Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)在小胶质细胞的激活过程中发挥着一定的作用。本文主要就近年来AD发病过程中TLR与小胶质细胞之间关系方面的研究进行综述。     

鸡马立克氏病病毒814株细菌人工染色体的构建

为构建全基因组鸡马立克氏病病毒814株感染性细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome, BAC), 首先通过构建表达Eco-gpt(xanthine-guanine phosphoribosyl transferase, XGPRT, gpt)的哺乳动物细胞基因转移遗传选择标记(1.3 kb)和带有细菌人工染色体的基本功能基因序列的鸡马立克氏病病毒重组病毒转移载体pUAB-gpt-BAC11, 将重组病毒转移载体与鸡马立克氏病病毒细胞总DNA共转染鸡胚成纤维细胞, 在选择培养基中经过8轮加压筛选, 获得并纯化重组病毒; 将重组病毒细胞总DNA电转化大肠杆菌, 筛选共获得38个BAC分子克隆化病毒, 提取BAC-DNA转染鸡胚成纤维细胞以拯救重组病毒。结果表明, MDV-BAC2 DNA再次启动病毒感染, 拯救了重组鸡马立克氏病病毒。成功构建了鸡马立克氏病病毒814株基因组全长感染性细菌人工染色体, 为方便利用现代RED/ET基因重组系统对病毒进行反向遗传操作提供了技术平台; 同时为研究鸡马立克氏病病毒的基因功能和开发新型马立克氏病疫苗奠定了基础。     

鸡马立克氏病病毒814株细菌人工染色体的构建

为构建全基因组鸡马立克氏病病毒814株感染性细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome, BAC), 首先通过构建表达Eco-gpt(xanthine-guanine phosphoribosyl transferase, XGPRT, gpt)的哺乳动物细胞基因转移遗传选择标记(1.3 kb)和带有细菌人工染色体的基本功能基因序列的鸡马立克氏病病毒重组病毒转移载体pUAB-gpt-BAC11, 将重组病毒转移载体与鸡马立克氏病病毒细胞总DNA共转染鸡胚成纤维细胞, 在选择培养基中经过8轮加压筛选, 获得并纯化重组病毒; 将重组病毒细胞总DNA电转化大肠杆菌, 筛选共获得38个BAC分子克隆化病毒, 提取BAC-DNA转染鸡胚成纤维细胞以拯救重组病毒。结果表明, MDV-BAC2 DNA再次启动病毒感染, 拯救了重组鸡马立克氏病病毒。成功构建了鸡马立克氏病病毒814株基因组全长感染性细菌人工染色体, 为方便利用现代RED/ET基因重组系统对病毒进行反向遗传操作提供了技术平台; 同时为研究鸡马立克氏病病毒的基因功能和开发新型马立克氏病疫苗奠定了基础。     

用PCR扩增和克隆马立克氏病病毒糖蛋白D基因

用ＰＣＲ技术,从ＧＡ株马立克氏病病毒（ＭＤＶ）感染的成纤维细胞（ＧＥＦ）基因组ＤＮＡ中扩增出ＭＤＶ糖蛋白Ｄ（ｇＤ）抗原基因片段的约１３００ｂｐ编码序列,将该ｐｃＲ扩增的产物于ＥｃｏＲＩ和Ｋｐｎｌ位点克隆到ｐＵＣ１８质粒载体中,在以ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ（ｄｉｇ）标记的ｇＤＰＣＲ产物作为探针,进行原位杂交初步筛选到阳性重组质粒克隆,再根据酶切分析筛选到含ＭＤＶｇＤ基因的重组质粒ｐ１８ＭｇＤ。将ｐ１８ＭｇＤ质粒ＤＮＡ用ｄｉｇ标记后,在Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ中,该探针能识别ＭＤＶ基因组ＤＮＡ的ＢａｍＨＩ－Ａ克隆中的Ａ片段ＤＮＡ。酶切位点分析表明,该ｇＤ克隆也和已发表的ＭＤＶ的ＲＢＩＢ株ｇＤ一样,不含有ＥｃｏＲⅠ、ＨｉｎｄⅢ、ＰｓｔⅠ、ＳｍａⅠ、ｐｖｕⅡ等酶切位点。证明该重组质粒是ＭＤＶｇＤ克隆。     

马立克氏病病毒Md11株pp24基因的原核表达

通过PCR方法扩增MDV Md11株pp24基因的完整ORF,按正确的阅读框架将其克隆入原核表达载体pGEX-6P-1中,重组质粒转化BL21宿主菌后,经IPTG诱导表达.诱导菌体裂解物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后,用山羊抗GST抗体进行Western-blotting试验,结果确证了GST-pp24融合蛋白的表达.将表达产物从凝胶中回收,免疫4周龄小白鼠,3次免疫后,采血分离血清.所得抗GST-pp24多克隆抗血清分别与GA株、Md11株和CVI988株MDV感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)进行间接免疫荧光试验(IFA),结果表明大肠杆菌表达的pp24融合蛋白至少保留了部分天然pp24蛋白的抗原性.     

马立克氏病病毒REispens株B抗原基因的克隆及其重组鸡痘病毒的构建

Purified DNAs from Chicken Embryo Fibroblast (CEF) cultures infected with MDV strain Rispens were used as templates. Specific fragment with the size of about 2.9 kb was successfully amplified through Polymerase Chain Reaction(PCR) and identified to be gB gene of MDV by dot blot hybridization with a digoxigenin-labelled MDV gB specific oligonucleotide probe. The gB gene from strain Rispens was cloned into pUC19 and FPV insertion vector pFG1175-1 to construct plasmid pMGB and pFGBR1775-1 respectively. DOSPER liposome-mediated transfection with insertion vector DNA pFGBR1175-1 was performed on CEF monolayers infected with FPV 3-4 h earlier. Recombinant FPV was clone purified. Immunofluorescence Assay(IFA) showed that MDV gB gene had been expressed in FPV.     

马立克氏病病毒gB部分基因的原核表达

利用PCR技术扩增获得马立克氏病病毒(MDV)囊膜糖蛋白B(gB)基因部分片段,将其克隆入pET-28a载体中,获得表达载体pET-gB,将该载体转化宿主菌BL21,经1.0mmol/LIPTG诱导,外源基因以包涵体的形式获得高效表达。将包涵体溶解于8mol/L的尿素中,利用His·Bind试剂盒获得纯化的蛋白,将纯化的蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,间接ELISA法测得抗体的效价为1×10-5。此外,通过Western blot实验表明,该抗体具有较高的特异性,为进一步探讨MDVgB所引起的特异的免疫反应奠定基础。     

鸡马立克氏病病毒糖蛋白gB基因的表达及基因免疫

将马立克氏病病毒(Marek's disease virus,MDV)gB基因插入真核表达载体pcDNA3中,经酶切和PCR鉴定为正向插入了gB基因的重组质粒,命名为pcDNA3-gB.体外转染COS-7细胞,经间接免疫荧光染色证实转染pcDNA3-gB后的COS-7细胞内有糖蛋白B的表达.用pcDNA3-gB对AA肉用雏鸡腿部肌肉注射,进行一免.间隔2周后,用pcDNA3-gB再加强免疫一次.之后2周攻毒,观察免疫保护效果.结果表明,MDV gB基因DNA免疫可以诱导鸡体产生免疫保护,免疫保护指数为72.2%.     

马立克氏病病毒pp38基因上游的一个双向启动子研究

马立克氏病病毒（MDV）pp38基因上游是病毒基因组DNA复制原点。在其两侧均含有启动子TATAbox、CAATbox等特征性的保守基元,推测是一个天然的双向启动子。为了在体外验证其双向启动活性,本研究以MDVpp38为报告基因,并将其ORF插入到pUC18中,构建了pUCpp38质粒。将包含该启动子完整区域的789bp序列分别以正反两个方向克隆进pUCpp38质粒中pp38报告基因的上游,获得的重组质粒pProfpp38和pProrpp38。将所获得的重组质粒分别转染鸡胚成纤维细胞（CEF）,通过间接免疫荧光试验检测pp38基因的表达以验证该启动子的双向启动活性。结果表明,马立克氏病病毒复制原点区的启动子无论以何种方向插入pUCpp38质粒中,在转染细胞24h内能检测到pp38基因的表达,48h后能获得高效和持续的表达。逐渐缩小该启动子的范围,最终在320bp时,仍能检测到两个方向较强的启动活性。     

接种不同毒力的马立克氏病病毒后鸡病毒血症的动态比较

1日龄非免疫鸡分别接种马立克氏病病毒（MDV）I型强毒GA株、I型MDV疫苗毒CVI988株和III型火鸡疱疹病毒（HVT）疫苗株后第4日起,定期采血并用抗MDV囊膜糖蛋白B（gB）单克隆抗体介导的间接免疫荧光试验检测MDV在外周血液单核细胞（PBMC     

马立克氏病病毒Md11株pp24基因的原核表达

通过PCR方法扩增MDVMd11株pp24基因的完整ORF,按正确的阅读框架将其克隆入原核表达载体pGEX-6P-1中,重组质粒转化BL21宿主菌后,经IPTG诱导表达。诱导菌体裂解物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后,用山羊抗GST抗体进行Western-blotting试验,结果确证了GST-pp24融合蛋白的表达。将表达产物从凝胶中回收,免疫4周龄小白鼠,3次免疫后,采血分离血清。所得抗GST-pp24多克隆抗血清分别与GA株、Md11株和CVI988株MDV感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)进行间接免疫荧光试验(IFAA),结果表明大肠杆菌表达的pp24融合蛋白至少保留了部分天然pp24蛋白的抗原性。     

马立克氏病病毒Rispens株B抗原基因的克隆及其重组鸡痘病毒的构建

马立克氏病病毒（Ｍａｒｅｋ’ｓＤｉｓｅａｓｅＶｉｒｕｓ,ＭＤＶ）是马立克氏病（ＭＤ）的病原,是第一个能用实验证明具有致肿瘤作用的疱疹病毒,也是研究病毒性肿瘤特别是疱疹病毒肿瘤的理想的实验模型。ＭＤ还是第一个广泛使用疫苗预防的肿瘤性病毒病。应用免疫扩散...     

马立克氏病病毒meq基因细胞转化机制的最新研究进展

马立克氏病病毒(Marek's disease virus,MDV)是禽类马立克氏病(MD)的病原体.MDV有三个血清型,其中MDV-1强毒株不仅可以导致宿主淋巴细胞溶细胞性病变,使淋巴组织萎缩,而且还有转化淋巴细胞能力,诱发淋巴瘤[1].meq是MDV-1的主要致瘤基因,近来研究发现,MEQ不仅具有转录活化作用,它还能与C-末端结合蛋白家族(Ct-BPs)转录辅助抑制因子结合成转录抑制复合物,抑制目的基因转录.     

表达禽流感病毒M2基因的重组马立克氏病病毒的构建

将禽流感病毒M2基因克隆于真核表达质粒pIRES-EGFP中,使其位于pCMV启动子的调控下,并与绿色荧光蛋白基因（EGFP）串联后,将上述串联基因插入到含MDV CVI988的非必需区US基因的重组质粒pUS2中,构建带标记的重组质粒,然后将此重组质粒转染感染了MDV CVI988的鸡胚成纤维细胞,利用同源重组的方法,筛选了表达禽流感病毒M2基因的重组病毒MDV1。经PCR、Dot-blotting,Western-blotting等实验的结果表明,禽流感病毒M2基因的确插入到MDV1（CVI988）基因组中并获得表达。重组MDV1免疫1日龄SPF鸡21天后,用ELISA可检测到M2蛋白的特异性抗体。接种了重组病毒rMDV的鸡体内针对H9N2疫苗血凝素的抗体滴度(p<0.05)明显提高,以禽流感病毒AIV A/Chicken/Guangdong/00（H9N2）攻毒后进行病毒重分离试验的结果发现,重组病毒能有效地降低病毒的排出量(p<0.01),说明该重组病毒可以用于防制禽流感的免疫。     

整合进禽反转录病毒基因组片段的鸡马立克氏病病毒重组野毒株的发现

用对禽网状内皮组织增生病病毒(REV)的单抗从广东和广西分离到的二株马立克氏病病毒(MDV)野毒株做间接荧光抗体试验, 用MDV感染细胞的基因组DNA做斑点分子杂交及PCR显示, 这二株MDV基因组中已整合进REV的LTR序列. 根据MDV基因组上易插入REV的LTR的高频位点的序列合成7条引物, 根据REV的LTR合成4条引物, 由此交叉组成28对引物, 分别从这二个MDV野毒株扩增和克隆已整合进MDV的REV-LTR序列及其相连的MDV序列. 测序证明, 二株中的REV-LTR插入序列及在MDV基因组中短独特序列(US)上的插入位点完全相同. 表明这二个毒株很可能是一次重组事件在鸡群中形成的流行毒株.