具有重要应用价值的真核表达系统

基于Ｔ７ＲＮＡ聚合酶与Ｔ７强启动子（Φ１０）间的特异认识而建立起来的偶联表达系统在大肠杆菌中已取得了令人满意的结果。最后，该系统在酵母、昆虫、浦乳动物细胞和植物细胞中陆续实现了高效表达。Ｔ７ＮＲＡ聚合酶－Φ１０启动子偶联表达系统的相对独立性和高效性，不仅预示着该系统可以在真核基因工程中发挥重要作用，而且其独特的作用机制为人们探索新的特异高效真核表达系统提供了一个可供借鉴的模式。     

在哺乳类动物细胞中呈现不同表达水平的T7启动子表达系统构建

将携带有Ｔ７噬菌体ＲＮＡ聚合酶基因的质粒和ｎｅｏ抗性基因质粒共转化ＣＨＯ细胞,经狭缝ＲＮＡ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ杂交实验证实获得表达Ｔ７噬菌体ＲＮＡ聚合酶基因的细胞株。ｐＴ７ＣＡＴ质粒转染未表达和表达的细胞株,实验显示两者都能表达报道基因,但效率不同。实验构建了不同表达水平的Ｔ７启动子表达系统。     

原核表达系统的真核化

Ｔ7噬菌体ＲＮＡ聚合酶显著的特点是只识别其自身ＤＮＡ序列中特定的启动子[1] ;而Ｔ7噬菌体启动子属于组成型的启动子 ,又只能被相应的Ｔ7噬菌体的ＲＮＡ聚合酶 (约 10 0ｋＤ的单链蛋白质 )所识别 ,并且被Ｔ7ＲＮＡ聚合酶所启始的转录非常活跃[2 ,3] ,宿主细胞的ＲＮＡ聚合酶所进行的转录根本无法同其竞争 ,这样宿主细胞中几乎所有的转录都被Ｔ7ＲＮＡ聚合酶所操纵。另外 ,Ｔ7ＲＮＡ聚合酶几乎能完整地转录在Ｔ7启动子下游的所有ＤＮＡ序列。基于这些优点 ,1986年Ｓｔｕｄｉｅｒ和Ｍｏｆｆａｔ建立了一套新的原核表达系统———Ｔ7ＲＮＡ聚…     

T7启动子具有真核生物聚合酶Ⅱ顺式作用因子的功能

根据ａ－鹅膏蕈碱（ａ－ａｍａｎｉｔｉｎ）对真核生物ＲＮＡ聚合酶的选择性抑制,以氯霉素乙酰转 移酶基因（ＣＡＴ）作为报道基因进行体内表达实验,证明Ｔ７噬菌体启动子可为真核生物ＲＮＡ 聚合酶Ⅱ所启动。应用建立的竞争性ＤＮＡ－蛋白质凝胶泳动技术,分别以ＴＡＴＡ框、ＣＡＡＴ 框、ＧＣ框和八核苷酸序列（ｏｃｔａｍｅｒ）为竞争性寡核苷酸分子,发现人工合成的Ｔ７启动子可能 与 ＴＦⅡＤ起始转录因子结合,形成 ＤＮＡ－核蛋白质结合物。将 ＴＡＴＡ框和八核苷酸序列分别 接入Ｔ７启动子上游,ＣＡＴ实验显示八核苷酸序列可以增强ＲＮＡ聚合酶Ⅱ对Ｔ７启动子的转录 起始作用。实验结果表明Ｔ７启动子可作为ＲＮＡ聚合酶Ⅱ的顺式作用因子。     

T7启动子在哺乳类动物细胞中启劝外源基因表达的研究

人低密度脂蛋白（ＬＤＬ）受体基因ｃＤＮＡ和氯霉素乙酰转移酶基因（ＣＡＴ）及ｐｏｌｙＡ信号序列被克隆进行ＰＧＥＭ４载体的Ｔ７噬菌避动子下游,构建成质粒ＰＴ７ＬＤＬＲ和ＰＴ７ＣＡＴ,两个重组质粒转化ＣＨＯ细胞,ＰＣＲ和ＣＡＴ酶实验显示：两个基因被Ｔ７噬菌体启动子所启动,结果证实真核生物ＲＮＡ聚合酶能够识别Ｔ７启动子,转录外源基因,常用的含有Ｔ７启动子的质粒可同时的核生物和真核生物的表达载体。     

7启动子具有真核生物聚合酶Ⅱ顺式作用因子的功能

根据α－鹅膏蕈碱（α－ａｍａｉｎｔｉｎ）对真核生物ＲＮＡ聚合酶的选择性抑制,以氯霉素乙酰转移酶基因（ＣＡＴ）作为报道进行体内表达实验,证明Ｔ７噬菌体启动子可为真核生物ＲＮＡ聚合酶Ⅱ所启动。应用建立的竞争性ＤＮＡ－蛋白质凝胶泳动技术,分别以ＴＡＴＡ框、ＣＡＡＴ框、ＧＣ框和八核苷权序列（ｏｃｔａｍｅｒ）为竞争性寡核苷酸分子,发现人工合成的Ｔ７启动子可能与ＴＦⅡＤ起始转录因子结合,形成ＤＮＡ－核蛋白质结     

原核表达系统T7RNA聚合酶/启动子在真核细胞中表达目的基因的实验研究

将目前高表达水平强大的原核表达系统之一T7RNA聚合酶 启动子表达系统通过一系列改进引入真核细胞。通过转染真核细胞实验表明 ,采用真核启动子CMV调控T7RNA聚合酶的表达和在T7启动子下游插入EMCVIRES序列两种解决方案能使该原核表达系统在真核细胞高效表达目的基因 ,且能适应不同的真核细胞环境 ,是一良好的细胞类型非依赖的表达体系。     

原核表达系统T7RNA聚合酶/启动子在真核细胞中表达目的基因的实验研究

将目前高表达水平强大的原核表达系统之一T7 RNA聚合酶/启动子表达系统通过一系列改进引入真核细胞.通过转染真核细胞实验表明,采用真核启动子CMV调控T7 RNA聚合酶的表达和在T7启动子下游插入EMCV IRES序列两种解决方案能使该原核表达系统在真核细胞高效表达目的基因,且能适应不同的真核细胞环境,是一良好的细胞类型非依赖的表达体系.     

T7启动子控制下的多功能大肠杆菌表达系统

构建了Ｔ７启动子控制下的多功能大肠杆菌表达载体系统,这些表达载含有强的Ｔ７启动子,翻译起始及终止元件,多克隆位点,线状噬菌体复制起始区等元件,使得该载体就仅可以有效地表达外源基因、还可能利用ｈｅｌｐｅｒ ｐｈａｇｅ诱导包装单链噬菌体,从而不需亚克隆就可以进行突变及ＤＮＡ序列测定。     

胰岛素受体的配体结合结构域的克隆与表达

用ＰＣＲ方法从人胎盘ｃＤＮＡ 中获得编码胰岛素受体α亚基中结合胰岛素的相对独立的结构域Ｌ１、Ｌ２以及人工设计的Ｌ１－（Ａｌａ）１０－Ｌ２的基因,克隆入含Ｔ７噬菌体ＲＮＡ聚合酶启动子的表达质粒ｐＥＴ－３ａ中,转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,用ＩＰＴＧ诱导表达成功。ＤＮＡ测序、氨基酸组成分析以及蛋白质Ｎ端测序证明所表达的蛋白质正确。经过包涵体的分离、洗涤、溶解和纯化,得到了纯的变性状态受体的胰岛素高亲