辐射诱导基因LRIGx的细胞周期特异性表达及编码产物同源性分析

低剂量辐射诱导表达新基因LRIGx被克隆 .Northern印迹杂交结果表明 ,在 0 2Gyγ射线照射后 2～ 4h ,人A5 4 9细胞中该基因mRNA表达水平显著上调 .当照射剂量增加到 2Gy时 ,其诱导表达水平明显低于 0 2Gy照射 .通过细胞周期同步化 ,观察到LRIGx基因表达高峰在G2 M期 .同源性比较和功能保守域分析结果显示 ,该基因编码产物与DNA修复和重组蛋白RAD5 4、ERCC 6 ,染色质重构和转录调节功能蛋白SWI2 SNF2等有同源性 ,其N端具有与染色质重构、基因转录调控和DNA修复有关的 3个功能结构域 ,即CHROMO、SNF2N和解旋酶C端结构域     

病毒诱导的PVX cp转基因沉默及其DNA甲基化

利用PCR方法获得了马铃薯X病毒(PVX)外壳蛋白(CP)基因(cp),并将其构建到植物表达载体中,利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草(Nicotiana tabacum L.).Northern杂交及Run on实验表明有3株转基因烟草发生了转录后基因沉默.发生沉默的cp基因的甲基化分析结果表明,发生转录后基因沉默的cp基因发生了不同程度的甲基化,说明DNA甲基化并没有完全抑制cp基因的转录.利用PVX病毒对外壳蛋白正常表达的转基因烟草进行接毒,Northern杂交检测结果表明,病毒诱导cp发生了基因沉默.进一步的Run on结果表明,转基因烟草中cp基因在沉默前后转录速率并没有发生变化,说明病毒诱导的沉默是一种转录后沉默.对cp基因沉默前后的甲基化分析表明,病毒的侵染导致了cp基因甲基化程度的增加.     

病毒诱导的PVX cp转基因沉默及其DNA甲基化

利用PCR方法获得了马铃薯X病毒(PVX)外壳蛋白(CP)基因(cp),并将其构建到植物表达载体中,利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草(Nicotiana tabacum L.)。Northern杂交及Run on实验表明有3株转基因烟草发生了转录后基因沉默。发生沉默的cp基因的甲基化分析结果表明,发生转录后基因沉默的cp基因发生了不同程度的甲基化,说明DNA甲基化并没有完全抑制cp基因的转录。利用PVX病毒对外壳蛋白正常表达的转基因烟草进行接毒,Northern杂交检测结果表明,病毒诱导cp发生了基因沉默。进一步的Run on结果表明,转基因烟草中cp基因在沉默前后转录速率并没有发生变化,说明病毒诱导的沉默是一种转录后沉默。对cp基因沉默前后的甲基化分析表明,病毒的侵染导致了cp基因甲基化程度的增加。     

西府海棠(Malus micromalus)MaMAPK基因的克隆及表达特性

依据高等植物MAPK基因的保守区设计简并引物,用 RT-PCR方法,首次从西府海棠幼苗叶片中克隆了促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)基因(MaMAPK)的cDNA全序列.Southern杂交结果表明在西府海棠中存在一个小的MAPK基因家族.20%PEG处理西府海棠幼苗不同时间后的Northern杂交分析表明,该基因在根系和叶片中均有表达,随着胁迫时间延长表达量增加,说明西府海棠MaMAPK基因在转录水平上受水分胁迫诱导表达.     

玉米根系蛋白磷酸酶基因ZmPP2C的克隆及表达特性

依据植物蛋白磷酸酶2C(protein phosphatase2C,PP2C)基因的保守区设计简并引物,运用RT-PCR方法,从玉米根系中分离到一个长度为936 bp的PP2C基因的cDNA克隆,命名为ZmPP2C.Southern杂交结果表明它在玉米基因组中是低拷贝的,且存在一个小的PP2C基因家族.Northern杂交结果表明,不同玉米组织之间ZmPP2C的表达差异明显;分别用CaCl2、MgCl2、PEG、EGTA和ABA处理根系24 h,只有CaCl2处理增加表达量,说明Ca2 能诱导玉米ZmPP2C基因在转录水平上的表达,或被依赖于Ca2 的方式诱导.     

水稻AtpH基因的表达受冷抑制

采用RT-PCR差异显示法,从水稻(Oryza sativa L.)幼苗克隆了1个受冷抑制表达的cDNA片段.该片段序列与水稻叶绿体基因组编码ATP合酶CF0Ⅲ亚基的atpH基因完全同源,且覆盖了atpH基因编码区.以Northern杂交分析了水稻幼苗在冷处理不同时间后的atpH基因转录水平,结果表明,atpH基因的转录受冷抑制,在冷处理第1天就明显下降,第2天以后完全受抑制.     

ERF类转录因子OPBP1基因的超表达提高烟草的耐盐能力

ERF是植物中的一类重要的转录因子,参与调节植物的生长,发育以及抗胁迫等过程,对一烟草OPBP1基因（属于ERF类基因）的烟草转化,获得了该基因超表达的植株,转基因植株明显地增加了耐盐能力,Northern杂交结果表明,OPBP1基因有不同程度的表达,而且表达丰度与其耐盐性有一定的正相关性,凝胶阻滞实验结果证明OPBP1融合蛋白能特异地与含GCC盒的DNA序列结合,这些结果说明OPBP1基因可能作为一转录因子来调节烟草耐盐相关的基因。     

真菌Mucor amphibiorum RCS1中一个类S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶基因的蓝光诱导表达

【目的】确定真菌Mucor amphibiorum RCS1中一个类S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶基因(S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase-like,sahhl)受蓝光诱导表达。【方法】以真菌M.amphibiorum RCS1为研究对象,在随机PCR过程中从中获得了一段555 bp长度的DNA序列。以地高辛对这段已知序列进行标记制备探针,通过Northern杂交检测M.amphibiorum RCS1菌丝体培养过程中,由黑暗到蓝光再到黑暗这一光照条件改变的情况下,sahhl基因的转录情况。同时结合应用real-time PCR方法进行分析检测。【结果】经过比对确定这段555bp序列与已经发表的人(Homo sapiens)、家鼠(Mus musculus)和部分真菌的S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶基因sahh有较高的同源性。因此,初步确认这段mRNA序列来自M.amphibiorum RCS1的一个类S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶基因。sahhl基因在黑暗预培养24 h的情况下,蓝光诱导24 h时通过Northern杂交和real-time PCR均可从菌丝体中检测到sahhl基因的大量转录。但sahhl基因在黑暗预培养48 h的情况下,通过real-time PCR没有检测到sahhl基因的大量表达。【结论】上述结果说明,蓝光可以诱导M.amphibiorum RCS1中生长旺盛的菌丝体中sahhl基因的表达。     

玉米花粉特异的非编码RNA基因ZM401 cDNA全长的克隆及其发育表达模式

通过差异筛选法并结合冷噬菌斑筛选,从玉米(Zea mays L.)成熟花粉cDNA文库中克隆到一个玉米花粉特异表达的cDNA片段ZM401(663bp).Northern杂交表明ZM401是一个玉米花粉特异表达的基因.本文采用5'RACE,3'RACE及重叠PCR技术获得了ZM401 cDNA的全长(1 149 bp).采用生物学软件对ZM401 cDNA的序列和结构进行分析,结果表明,该基因缺乏明显的开放阅读框架,序列中最长的开放阅读框架仅有89个氨基酸,但具有poly(A)尾部结构,符合非编码RNA基因的特点.推断ZM401基因是一个非编码基因.RT-PCR及Northern blot分析表明ZM401基因从玉米花粉小孢子四分体时期、单核期、双核期、成熟花粉开始表达,而且表达量依次增强,证明ZM401可能与玉米花粉的晚期发育过程相关.同时,Northern杂交显示ZM401基因在玉米花粉发育中有两种转录本存在.     

拟南芥AtWRKY25、AtWRKY26和AtWRKY33在非生物胁迫条件下的表达分析

WRKY 转录因子家族在调控植物逆境诱导反应、生长发育及其信号转导等方面起着重要的分子生物学功能。文章采用Northern 杂交的方法, 对拟南芥3个WRKY基因进行表达谱分析。结果表明: AtWRKY25、AtWRKY26和AtWRKY33受多种非生物逆境因子(温度因子、高盐、渗透胁迫和激素脱落酸)的影响, 其中低温和高盐对AtWRKY25、AtWRKY26和AtWRKY33的诱导尤为明显, 表明这3个AtWRKY基因可能在响应环境信号方面起着一定的作用。作为序列相似性较高的AtWRKY25、AtWRKY26和AtWRKY33对一些胁迫因子的表达模式呈现一定的相似性; 但AtWRKY33受高温的抑制和低温的快速诱导, 与另外两个基因的表达模式不同, 推测它们对温度胁迫因子的反应存在差异。此外, 对启动子序列的生物信息学分析发现, 3个基因的启动子包含多个与非生物逆境反应相关的顺式作用元件。     

垂体瘤转化基因1(PTTG1)的表达变化对人前列腺癌细胞LNCaP生长增殖的影响

垂体肿瘤转化基因1(PTTG1)具有促进肿瘤生长和转移的作用.通过上调或下调基因表达的策略,观察PTTG1基因对人前列腺癌细胞株LNCaP细胞生长增殖的影响.利用PCR技术分离出PTTG1全长cDNA,分别正向和反向插入真核表达载体pIRES2-EGFP,重组载体分别命名为正义PTTG1-S/pIRES2-EGFP(即pI-P-S)和反义PTTG1-AS/pIRES2-EGFP(即pI-P-AS),将这两种重组载体稳定转染LNCaP细胞,通过流式细胞仪和MTT法分别检测了细胞周期和细胞增殖的情况.转染正义PTTG1后处于S期和G2期的细胞明显增加,细胞生长增殖能力增强;相反,转染反义PTTG1后处于S期和G2期细胞明显减少,细胞生长增殖能力减弱(P<0.05).结果表明,PTTG1能明显改变人前列腺癌细胞株LNCaP的细胞周期和细胞生长增殖能力,它的异常表达可能参与前列腺癌细胞生长增殖过程.     

甲胎蛋白对HeLa细胞N-ras、p53和p21~(ras)表达的促进作用

大量研究已证明甲胎蛋白 (alpha fetoprotein ,AFP)对肿瘤细胞的增殖具有调节作用 .为探讨AFP对细胞生长促进作用的分子机理 ,采用从人脐带血中提取的AFP作用于体外培养的HeLa细胞 ,用Northern印迹分析法分析不同作用时间时细胞N rasmRNA的表达以及用Western印迹分析法分析p5 3、p2 1ras的表达 .结果发现 ,在AFP(2 0mg L)作用后 ,HeLa细胞的N rasmRNA、p5 3蛋白质和p2 1ras蛋白质的表达量与对照组比较在 12h和 2 4h时都有明显增加 .AFP的作用均可被抗AFP单克隆抗体所拮抗 .实验结果提示 ,AFP对细胞生长的调节作用可能通过促进这些原癌基因的表达来实现 .     

siRNA沉默SIRT1基因对宫颈癌细胞HeLa增殖和凋亡的影响

化学合成靶向SIRT1基因的小干扰RNA,脂质体法转染人宫颈癌细胞株HeLa,观察小干扰RNA沉默SIRT1基因对HeLa增殖及细胞凋亡的影响。在优化siRNA SIRT1转染条件的基础上,应用RT-PCR和Western blot分别检测各组SIRT1 mRNA、SIRT1蛋白及凋亡相关蛋白的表达;CCK-8法检测细胞增殖抑制率;Hoechst荧光染色法和流式细胞仪检测细胞凋亡。结果表明,siRNA SIRT1转染细胞组SIRT1 mRNA水平和蛋白表达量明显低于对照组;siRNA SIRT1转染组细胞增殖受抑制,细胞凋亡率明显增加;凋亡相关蛋白P53、P21表达上调,Survivin表达下调。上述结果表明:siRNA SIRT1诱导的HeLa细胞凋亡与P53、P21、Survivin通路关系密切,但siRNA SIRT1诱导HeLa细胞凋亡的详尽机制有待进一步研究。     

放疗与吉西他滨治疗对肺癌A549细胞自噬相关基因Beclin1表达的影响

目的:探讨放疗与吉西他滨(Gemcitabine,GEM)治疗对人肺腺癌A549细胞中自噬相关基因Beclin1表达的影响。方法:使用60Coγ照射(6Gy)人肺腺癌A549细胞,细胞继续培养6、12和24h。使用人剂量吉西他滨处理人肺腺癌A549细胞,细胞继续培养24 h后,以未处理的A549细胞为对照,用RT-PCR和Western blotting法检测A549细胞中Beclin1 m RNA和蛋白的表达。结果:经过放射线照射后,三组A549细胞内Beclin1 m RNA和蛋白的表达量均增加,且在24小时末表达量达到最大。经过吉西他滨处理后,吉西他滨处理组A549细胞内Beclin1 m RNA和蛋白的表达量均增加。结论:放射治疗与吉西他滨治疗均可导致A549细胞内自噬相关基因Beclin1表达上调。     

CHD5基因RNAi慢病毒载体的构建及其对结直肠癌细胞生物学功能的影响

目的:研究人类肿瘤相关基因CHD5基因miR-shRNA慢病毒对结直肠癌Lovo细胞的影响。方法:利用软件设计对CHD5基因干扰有效的序列,合成靶序列,退火形成双链DNA,酶切后与载体相连接。将重组慢病毒载体pPRIME-TET-GFP-CHD5与慢病毒包装质粒pCMV-VSV-G,pRSV-Rev,pMDLg-pRRE共转染293FT细胞,将包装重组慢病毒感染人类结直肠癌Lovo细胞。通过荧光定量PCR和Western blot验证CHD5基因在细胞中的表达情况,应用MTT检测CHD5低表达对Lovo细胞增殖的影响。结果:成功构建pPRIME-TET-GFP-CHD5重组质粒,经酶切及序列测定正确,包装的病毒滴度为3.1×106TU/ml。用制备的病毒上清感染Lovo细胞后,荧光定量PCR和Western blot分析结果显示该慢病毒可分别在转录和蛋白质水平上抑制Lovo细胞CHD5基因的表达,并使得Lovo细胞增殖失控。结论:成功构建CHD5慢病毒表达载体,表达的慢病毒可有效的感染Lovo细胞,提高Lovo细胞的增殖能力。     

ω-6脂肪酸脱氢酶基因在乳腺癌细胞内的表达和作用

为探讨ω- 6脂肪酸脱氢酶基因fat -1在人类乳腺癌细胞MCF- 7中表达和对其生长的作用,将fat -1基因插入到腺病毒载体中,构建腺病毒重组载体(Ad·GFP·fat1) .通过包装细胞系(2 93)产生重组腺病毒,感染MCF 7细胞.用核糖核酸酶保护性分析技术,检测fat -1基因在MCF- 7细胞内的表达,细胞增殖试剂盒(MTT)和凋亡染色试剂盒染色分析fat 1基因对MCF- 7细胞增殖和凋亡的影响,用酶联免疫分析花生酸类(eicosanoids)前列腺素E2 (prostaglandinE2 )的含量.结果显示,腺病毒介导的fat- 1基因能在MCF- 7细胞内有效异源表达,抑制MCF -7细胞的增殖且导致凋亡,前列腺素的含量也明显地减少.结果说明,fat- 1基因在乳腺癌的基因治疗中具有良好利用价值.     

应用DNA芯片鉴定HPV18 E6-siRNA诱导HeLa 细胞凋亡的分子机制

高危型人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）的E6基因在宫颈癌的发生中起关键作用,特异siRNA能有效抑制宫颈癌HeLa 细胞内HPV18 E6基因的表达,诱导肿瘤细胞凋亡.为进一步探讨HPV18 E6-siRNA诱导HeLa 细胞凋亡的分子机制,针对HPV18-E6基因设计siRNA序列,利用人源U6启动子为模板,经PCR表达框架法体外扩增,转染宫颈癌HeLa细胞抑制HPV18 -E6基因表达,从而诱导肿瘤细胞凋亡.对转染前后HeLa细胞总RNA样品进行荧光标记后,与Agilent Human 1A寡核苷酸芯片杂交、扫描、数据分析及标准化处理,确定表达差异的基因并经荧光定量PCR对部分基因进行验证,结合PANTHER数据分析系统,将这些基因按照生物学功能进行归类,查阅GenBank数据库及相关文献,对其结果进行深入分析及讨论.在检测的18 716个基因和EST中,共筛出差异表达基因359个,其中307个基因表达上调,52个基因表达下调,主要包括细胞周期相关基因CCNG1、p21;凋亡相关基因CASP4、CASP6、IGFBP3、DFFA;泛素蛋白酶解途径相关基因E6-AP、UBE2C;角化细胞分化相关基因KRT4、KRT6E、KRT18;抑癌基因RECK、VHL等.研究结果表明,HPV18 -E6基因抑制引起的细胞凋亡效应主要是通过P53信号途径和泛素蛋白酶解信号途径调节细胞周期相关基因和凋亡相关基因的表达,从而抑制HeLa细胞增殖、促进细胞凋亡.同时,抑癌基因的激活,角化细胞分化和免疫相关基因的表达上调,都说明了E6抑制后肿瘤细胞恶性转化程度的下降.     

siRNA抑制c—myc基因的表达对宫颈癌细胞增殖的影响

目的：利用siRNA（small interference RNA）技术研究C-myc基因的对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响。方法：依据Promega公司在网上提供的设计软件,设计针对C-myc基因的siRNA,合成DNA模板,体外转录合成siRNA。通过阳离子聚合物jet—SITM—ENDO将合成的siRNA转染入HeLa细胞,以未转染细胞以及错义序列siRNA—scr转染细胞为对照。用细胞计数法检测siRNA对HeLa细胞增殖的影响。流式细胞法检测细胞周期及蛋白表达的变化,RT—PCR法比较转染前后C-myc mRNA表达水平的变化。结果：细胞计数法结果显示,转染24h后c-myc基因siRNA明显抑制MCF-7细胞增殖,转染48h后,抑制效率稳定。c-myc基因siRNA转染后能有效地抑制HeLa细胞的增殖,阻滞细胞周期于G0／G1期,siRNA转染组c-myc mRNA、蛋白的表达量明显低于空白对照组、错义序列组。结论：体外转录合成的siRNA可有效降低HeLa细胞c-myc基因的表达,抑制细胞增殖。     

靶向XBP1S的RNA干扰质粒对细胞增殖的影响

目的 构建靶向人XBP1S的siRNA真核表达载体（pSUPER-XBP1S）并观察其对人HeLa细胞和HepG2细胞增殖能力的影响.方法 设计并合成针对XBP1S基因的siRNA,退火成互补双链后克隆至真核表达载体pSUPER构建重组质粒,并将其转染入HeLa细胞和HepG2细胞中.采用RT-PCR检测转染前后XBP1S在HeLa细胞和HepG2细胞中的转录,Western印迹检测转染前后XBP1S蛋白的表达;MTT法、细胞计数检测重组质粒对HeLa细胞和HepG2细胞增殖能力的影响.结果 重组质粒能有效地抑制HeLa细胞和HepG2细胞中XBP1S基因的转录和表达;转染HeLa细胞和HepG2细胞后,细胞增殖抑制率及细胞增殖数与对照组比较,差异有统计学意义（P〈0.05）.结论 成功构建了靶向人XBP1S的siRNA表达载体pSUPER-XBP1S,并且有效的抑制了HeLa细胞和HepG2细胞中XBP1S的转录和表达,有效抑制了细胞的增殖能力.