脂肪储存小滴蛋白5重组腺病毒的制备

目的：利用AdEasy腺病毒表达系统构建含有小鼠脂肪储存小滴蛋白5（LSDP5）基因的重组腺病毒。方法：从小鼠肝脏cDNA克隆出LSDP5基因全长,克隆至pMD18-T载体中,酶切测序。回收酶切产物,连接到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV,构建pShuttle-CMV-LSDP5重组质粒,经PmeI酶切线性化后转化至含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183中。筛选阳性克隆,提取重组质粒,PacI酶切线性化并转染AD293细胞进行包装,提取病毒DNA,鉴定重组病毒并检测病毒滴度。结果：LSDP5基因克隆经测序证实与Genebank公布一致,双酶切重组pMD18-T载体得到1400 bp左右的片段。重组穿梭载体经Kpn I和Sal I双酶切后得到预期片段。PacI酶切得到30 Kb大片段和4.5 Kb小片段。转染AD293细胞后收集病毒,经PCR鉴定,获得理想的目的片段。取病毒上清反复感染AD293细胞以扩增病毒,最后所得病毒滴度为2.5×109pfu/ml。结论：成功构建了携带脂肪储存小滴蛋白5基因的重组腺病毒载体,为进一步研究LSDP5基因功能奠定基础。     

脂肪储存小滴蛋白5 重组腺病毒的制备

目的:利用AdEasy腺病毒表达系统构建含有小鼠脂肪储存小滴蛋白5(LSDP5)基因的重组腺病毒。方法:从小鼠肝脏cDNA克隆出LSDP5基因全长,克隆至pMD18-T载体中,酶切测序。回收酶切产物,连接到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV,构建pShuttle-CMV-LSDP5重组质粒,经PmeI酶切线性化后转化至含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183中。筛选阳性克隆,提取重组质粒,PacI酶切线性化并转染AD293细胞进行包装,提取病毒DNA,鉴定重组病毒并检测病毒滴度。结果:LSDP5基因克隆经测序证实与Genebank公布一致,双酶切重组pMD18-T载体得到1400 bp左右的片段。重组穿梭载体经Kpn I和Sal I双酶切后得到预期片段。PacI酶切得到30 Kb大片段和4.5 Kb小片段。转染AD293细胞后收集病毒,经PCR鉴定,获得理想的目的片段。取病毒上清反复感染AD293细胞以扩增病毒,最后所得病毒滴度为2.5×109pfu/ml。结论:成功构建了携带脂肪储存小滴蛋白5基因的重组腺病毒载体,为进一步研究LSDP5基因功能奠定基础。     

人白细胞介素-36受体拮抗剂基因的克隆及序列分析

[目的]构建人白细胞介素-36受体拮抗剂(interleukin-36 receptor antagonist,IL-36Ra)的真核表达载体,并对其基因全长编码区进行分析。[方法]提取总RNA,逆转录出IL-36Ra c DNA序列。设计人IL-36Ra基因的上游引物和下游引物。利用热启动PCR扩增目的基因,将扩增出的IL-36Ra基因编码区通过限制性内切酶酶切后,把酶切的目的片段与载体pc DNA3.1连接,转化到感受态细胞大肠杆菌DH5α中。通过氨苄青霉素抗性筛选、双酶切及菌落PCR鉴定,最后选取阳性克隆进行测序。[结果]重组载体pc DNA3.1-h IL-36Ra经菌落PCR和酶切鉴定,最后通过序列分析证实,其序列与Gen Bank中数据一致。[结论]人IL-36Ra基因的重组真核表达载体pc DNA3.1-h IL-36Ra的成功构建,为进一步研究IL-36Ra在免疫性疾病中的作用奠定了实验基础。     

人Stathmin基因siRNA腺病毒载体的构建及病毒鉴定

目的:为了寻求解决非特异性杀伤作用的星形细胞瘤的基因治疗问题的新途径.本研究构建带有Stathmin siRNA的复制缺陷腺病毒载体并包装病毒.方法:(1)两个目标siRNA基因片段合成并分别插入pSilencer4.1-CMV载体中从而构建两个重组真核表达栽体:pSilencer4.1-CMV-S1和pSilencer4.1-CMV-S2.(2)用EcoR Ⅰ和BamH Ⅲ双酶切pSilencer4.1-CMV-S1和pSilencer4.1-CMV-S2,将目的片段分别装进穿梭质粒,从而构建pShuttle-CMV neo-S1和pShuttle-CMV neo-S2.以独特的限制性内切酶PI-Sce Ⅰ合I-Ceu Ⅰ双酶切这两个穿梭质粒并重组至骨架Adeno-XTM Viral DNA上.并以PCR方法来鉴定.(3)线性化Ad-pShuttle-CMV neo-S1和Ad-pShuttle-CMV neo-s2并转染入HEK293细胞,出毒后进行PCR毒种鉴定和滴度分析.结果:(1)酶切分析和DNA测序表明,小干扰RNA片段的成功连接到pSilencer4.1-CMV载体上分别.(2)酶切分析表明两个目的基因片段,都分别成功连接入穿梭载体pShuttle.PCR表明pShuttle-CMV neo-S1和pShuttle-CMV neo-S2分别与骨架重组成功.(3)腺病毒DNA进行PCR鉴定后表明成功地在体外重组并生产出腺病毒.且冻融产毒细胞保证了较高的重组腺病毒滴度.结论:Adeno-XTM系统是一个能简单而有效生产能表达目的基因腺病毒的系统.我们构建的腺病毒有望成为星形细胞瘤新的高效而安全的治疗方法.     

人snail真核表达载体构建与鉴定

目的:构建人snail基因真核表达载体并鉴定。方法:使用RT-PCR法获取人snail基因全长c DNA,经Bam H I、Eco R I双酶切、连接,插入pc DNA3.1(+)真核表达载体,转化TOP10感受态细胞,用含氨苄青霉素的LB培养基筛选阳性克隆,提取质粒双酶切电泳及测序鉴定,瞬时转染siha细胞Western-blot从蛋白水平鉴定重组质粒在真核细胞内的表达。结果:pc DNA3.1-snail重组质粒经酶切电泳符合预期片段,测序鉴定插入片段与NCBI Gen Bank文库中人snail序列一致,重组质粒瞬时转染后snail蛋白表达量明显增高。结论:成功构建pc DNA3.1-snail重组质粒载体,为进一步探讨snail基因生物学功能奠定了基础。     

香蕉凝集素BanLec基因转化毕赤酵母及转化子的鉴定

以pMD-BanLec质粒为模板扩增BanLec基因片段,该片段经EcoR I/XbaI双酶切后定向克隆到同样经EcoRI/XbaI双酶切的pPICZα表达载体上。将连接产物转化感受态DH5α,用低盐Zeocin抗性LB固体培养基筛选阳性克隆菌落。将重组质粒电转化毕赤酵母菌GS115后,通过PCR鉴定目的基因整合入酵母菌的基因组中,将有助于进一步研究BanLec蛋白的表达,为探讨香蕉凝集素的活性及生化功能等奠定基础。     

含G0S2基因启动子的荧光素酶报告基因载体的构建

目的:克隆人G0S2基因启动子并构建荧光素酶报告基因载体,为进一步研究G0S2基因转录调控提供质粒。方法:利用PCR技术从人胚肾293A细胞基因组DNA中克隆获得G0S2基因启动子的DNA片段,将其克隆至pGL3-basic表达载体中,并转化人大肠杆菌DH5α,经限制性内切酶酶切、PCR及测序鉴定得到确认;将重组载体质粒与半乳糖苷酶表达质粒psV-β-Galactosidase共转染至大鼠血管平滑肌细胞(VSMC),检测细胞中荧光素酶的活性。结果:pGL3-G0S2-Promoter重组质粒插入片段和相邻序列正确,克隆的G0S2基因片段有启动子活性(P0.05)。结论:成功构建了pGL3-G0S2-Promoter报告基因质粒,为进一步研究G0S2基因的表达奠定了基础。     

人eNOS复制缺陷型重组腺病毒的构建

目的:构建以巨型细胞病毒(CMV)为启动子的heNCS重组腺病毒转移载体.方法和结果:将heNOS cDNA全长亚克隆到穿梭质粒启动子CMV的下游,通过I-Ceu Ⅰ和PI-SceⅠ两个稀有酶切位点将目的基因heNOS与腺病毒质粒DNA(pAdeno-X)进行体外连接,获得重组腺病毒质粒DNA(pAdeno-heNOS),后者经限制性内切酶PacⅠ切割,利用脂质体转染法获得heNOS重组腺病毒.PCR双引物法鉴定是否成功构建heNCS重组腺病毒.结论:PCR双引物检测含有heNOS片段,表明成功构建了heNOS重组腺病毒转移载体AdhCMV-heNOS.     

OKP-B-13型β-内酰胺酶的克隆与表达

目的构建OKP-B-13型β-内酰胺酶的表达载体。方法抽提菌株的质粒,应用PCR扩增OKP-B-13基因全长编码序列,扩增产物经Nde I、Xho I酶切后连接至pET-26b(+)表达载体,重组质粒经酶切及DNA测序确证后,转入大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。超声破碎法提取表达蛋白产物,检测其活性,等电聚焦电泳检测蛋白的等电点(pI)。结果PCR扩增获得879 bp的产物,重组表达载体经Nde I、Xho I酶切及DNA测序后表明,目的基因已成功接入表达载体,重组菌的粗提物经头孢硝噻吩检测显示具有β-内酰胺酶活性,显示载体[pET-26b(+)/OKP-B-13]构建成功。目的等电点为7.1。结论β-内酰胺酶OKP-B-13在原核表达细胞中实验了基因重组表达,为进一步分析酶的特性提供条件。     

跨膜型TNF-alpha单克隆抗体腺病毒表达载体的构建和鉴

目的：应用AdEasy-1 系统构建包含tmTNF-alpha单克隆抗体轻、重链序列的重组腺病毒表达载体。方法：首先PCR 合成抗体 轻、重链序列,分别将轻、重链序列插入经过改造的含有双启动子的穿梭质粒pShuttle-2CMV,将穿梭载体电转化转化AdEasy 系 统BJ5183 感受态,挑取单克隆扩增质粒后酶切鉴定。结果：成功构建重组腺病毒表达载体pAdEasy-tmTNF-alpha,抗体重链、轻链序 列酶切后经1%琼脂糖凝胶电泳证实条带片段大小正确,电转化BJ5183 后挑选重组克隆提取质粒,PacI酶切后重组片段位于4.5 kb及3 kb位置,证明重组腺病毒质粒pAdeasy-1-tmTNF-alpha构建成功。结论：将腺病毒系统与单克隆抗体技术相结合,利用AdEasy-1 系统成功构建腺病毒重组tmTNF-alpha单克隆抗体表达载体,为进一步开展肿瘤基因治疗的研究提供基础。     

细菌内同源重组法制备FMDV聚蛋白编码基因重组腺病毒

采用PCR方法从重组质粒pMD18_T/PP中扩增出FMDV的聚蛋白(PP)编码基因,再亚克隆至腺病毒穿梭质粒中,形成重组穿梭质粒rpAd_CMV/PP;将获得的重组穿梭质粒与腺病毒骨架载体通过在大肠杆菌内质粒间同源重组获得重组腺病毒质粒rpAd/PP。将腺病毒载体线性化后用脂质体介导转染293细胞从而获得含有口蹄疫病毒PP编码基因的重组腺病毒。通过倒置显微镜观测,可见明显的细胞病变,利用荧光显微镜可观测到报告基因绿色荧光蛋白的表达,并在电镜下观察到FMDV的空衣壳。结果证明已成功获得了含有口蹄疫病毒PP编码基因的重组腺病毒rAd/PP,并成功表达组装FMDV空衣壳,为FMDV腺病毒活载体疫苗的研究奠定了基础。     

单纯疱疹病毒2型糖蛋白D成熟肽基因毕赤酵母表达载体的构建及序列分析

构建单纯疱疹病毒2型包膜糖蛋白D成熟肽基因毕赤酵母表达载体,并对序列进行分析,为进行高抗原性的真核表达重组gD蛋白奠定基础。采用PCR扩增HSV2-gD成熟肽基因,将该段基因克隆于pGEM-T克隆载体,转化鉴定后,与巴斯德毕赤酵母表达载体(pPIC9K)酶切连接,转化大肠杆菌DH5α,筛选测序确定构建了pPIC9K?gD的真核表达载体,对克隆的序列进行分析,预测表达产物的理化特性及抗原性。结果显示,获得的重组的酵母表达载体pPIC9K-gD,测序结果证实为HSV2-gD成熟肽基因,序列分析其高度保守,预测蛋白分子量40.63kD,等电点pI为7.15,包含完整成熟肽分值达1.7的多个抗原决定簇。成功构建了HSV2-gD成熟肽基因的毕赤酵母表达载体。     

在DH5α中拼接构建ADAM10全长真核表达载体的基因突变

目的:构建ADAMI0真核表达载体,为进一步研究其生物学功能打基础.方法:将人ADAM10的上下两部分基因片段(分别为全长基因的1 ～910bp和911 ～2 247bp片段),依次与真核表达载体pcDNA3.1相连,以大肠杆菌DH5α或BL21(DB)作为感受态宿主菌用于转化连接产物,拼接成全长的阳性克隆通过PCR、酶切和测序鉴定.结果:ADAM10下段基因与已正确连入上段的pcDNA3.1重组质粒拼接时,若用DH5α为感受态菌,则下半段出现碱基插入增加512bp,测序结果显示为ADAM10基因第1 531 bp～2 042 bp间的序列有紧邻的双份;若用BL21(DE3)为感受态,则无突变.结论:将ADAM10基因与pcDNA3.1真核表达载体依次拼接构建重组质粒时,以DH5α为宿主菌可出现基因序列增加的罕见突变,而以BL21(DE3)为宿主则无突变,由此成功构建ADAM10全长基因与pcDNA3.1的重组质粒.     

光滑球拟酵母金属硫蛋白基因的亚克隆和表达研究

用BamHI和PstI双酶切质粒pMTIIa－91s,获得光滑球拟酵母金属硫蛋白基因（MTIIa）片段,将其亚克隆到M13载体,扩增并回收MTIIa基因片段,经Southern杂交验证插入片段正确后,分别将MTIIa基因片段插入到大肠杆菌表达载体pBV220和大肠杆菌一酵母菌穿梭载体YIp352中,转化大肠杆菌DH5a,使其对CUSO₄的抗性提高0．7mol／L左右;转化酿酒酵母受体菌YS59,使YS59对CUSO4的抗性提高1．5mol／L左右。结果证明光滑球拟酵母MTIIa基因在     

牛分枝杆菌mpb64基因的克隆、鉴定及其表达

以牛型分枝杆菌基因组DNA为模板,PCR方法扩增mpb64基因,纯化PCR产物并与pDM18-T载体连接、转化,经酶切及核苷酸序列鉴定为正确后,酶切产物亚克隆到原核表达载体pET30a(+)的KpnI／EcoRI位点,构建重组表达质粒pET30a+-mpb64,转化到大肠杆菌DE3内,以IPTG进行诱导,终浓度为1mmol／L,诱导产物进行SDS-PAGE电泳。结果表明,PCR方法成功扩增出mpb64基因,核苷酸序列测定验证了其正确性,重组表达质粒表达的pET30a+-mpb64融合蛋白相对分子量为30.4kDa,与实测相符。牛分枝杆菌pET30a+-mpb64的成功表达为牛结核病的诊断及新型疫苗的研究奠定了基础。     

桑蚕金属硫蛋白基因在大肠杆菌中的克隆和表达

用\%Bam\%HⅠ和\%Sac\%Ⅰ双酶切质粒pCM1\|1,获得酵母的MTI基因片段,用非放射性地高辛标记作为探针。提取桑蚕肥苏蚕卵的总DNA,分别用\%Eco\%RⅠ、\%Bam\%HⅠ和\%Hin\%dⅢ酶切,与MTI探针进行Southern杂交,出现较强的杂交信号。然后用\%Eco\%RⅠ完全酶切桑吞的总DNA,电洗脱法回收1～6kb的染色体片断,与\%Eco\%RⅠ酶切的M13-载体以3∶1比例连接,转化受体菌DH5α。筛选到4 000多个白色转化子,与探针MTI进行Southern杂交筛选阳性转化子,选择到有强杂交信号的三个转化子［编号为T1(pZHC\|1)\,T5(pZHC\|5)\,T7(pZHC\|7)\]。用12种限制性内切酶对pZHC\|5重组质粒进行酶切分析表明插入片段约12kb,在基因内有一个\%Hin\%dⅢ位点。抗性测定表明受体菌DH5α在含有50mmol/L CuSO\-4的培养基上生长,在含有52mmol/L CuSO\-4的培养基上不生长,而转化子确能在含有52mmol/L CuSO\-4以上的培养基上生长。上述研究结果表明12kb左右的插入片段含有桑吞的金属硫蛋白基因。     

一种简单的哺乳动物细胞附着体质粒CaCl2转化方法

目的:建立一种简单经济的哺乳动物细胞附着体质粒还原实验方法。方法:构建附着体载体,转染中国卵巢仓鼠(CHO)细胞和小鼠脑神经瘤细胞Neuro-2a,利用改良的赫特裂解法提取附着体质粒,CaCl2法转化附着质粒至宿主菌大肠杆菌DH5α,再次从DH5α中提取质粒,将转染前后质粒用KpnⅠ/BamHⅠ双酶切和BamHⅠ单酶切,并将转染前后的质粒进行DNA测序分析。结果:与最初转染的质粒相比,还原质粒双酶切和单酶切后的条带大小一致;DNA测序分析表明,转染前后质粒中的插入序列相同。结论:建立了可用于质粒还原实验的简单的CaCl2转化方法。     

大肠杆菌-长双歧杆菌穿梭载体的构建及PTEN在长双歧杆菌中的表达

长双歧杆菌可特异地定植于实体瘤低氧区,可用做肿瘤靶向性基因治疗的载体,而构建大肠杆菌-长双歧杆菌穿梭质粒则被证明是外源基因在长双歧杆菌中稳定表达的有效途径。为了构建能在长双歧杆菌中稳定表达外源基因的穿梭质粒并检测携带抑癌基因的工程菌对小鼠实体瘤的抑制效果,利用软件设计并合成了48条部分序列相互重叠的引物,通过PCR合成了长双歧杆菌质粒pMB1序列及长双歧杆菌HU启动子区序列,插入克隆载体pMD18-T,构建穿梭载体pMB-HU,该载体可在大肠杆菌DH5α及长双歧杆菌L17中稳定复制。PTEN基因编码具有蛋白质和酯类双重特异性磷酸酶活性的抑癌因子。将PTEN基因cDNA序列插入载体pMB-HU中HU启动子下游,构建重组质粒pMB-HU-PTEN,电击转化长双歧杆菌后,Western blot检测表明,表达产物中存在55kDa的PTEN蛋白特异条带。抑癌试验表明:与对照组相比,携带PTEN基因的长双歧杆菌可显著抑制小鼠实体瘤的生长。上述结果为以长双歧杆菌为载体的实体瘤靶向性基因治疗研究奠定了基础。     

Cry1Ac基因载体构建及其在枯草芽孢杆菌中的杀虫活性表达

根据苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis HD-73基因Cry1Ac和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis木糖诱导型启动子PxylR序列, 分别设计2对特异引物Cry1Ac F/R和Pxy F/R,扩增获得了完整的启动子PxylR和Cry1Ac基因序列,进一步以上述产物混合物为模板,以Pxy F/Cry1Ac R作引物进行重迭PCR,获得了载体PxylR-Cry1Ac,经SphⅠ和BamHⅠ完全酶切后,将PxylR-Cry1Ac插入大肠杆菌-苏云金芽孢杆菌穿梭载体pHT315,重组表达质粒pCry1Ac315转化枯草芽孢杆菌感受态细胞。工程菌株质粒酶切电泳分析、SDS-PAGE电泳分析和杀虫生物活性测定结果证实了Cry1Ac基因的导入及其在枯草芽孢杆菌JAAS01D中的有效表达。     

Molecular analysis of the Salmonella typhimurium phoN gene, which encodes nonspecific acid phosphatase.

The phoN gene of Salmonella typhimurium encodes nonspecific acid phosphatase (EC 3.1.3.2), which is regulated by a two-component regulatory system consisting of the phoP and phoQ genes. We cloned the phoN region into a plasmid vector by complementation of a phoN mutant strain and determined the nucleotide sequence of the phoN gene and its flanking regions. The phoN gene could encode a 26-kDa protein, which was identified by the maxicell method as the product of phoN. Results of the enzyme assay and Southern hybridization with chromosomal DNA of Escherichia coli K-12 suggests that there is no phoN gene in E. coli. The regulatory pattern of phoN in E. coli and Southern hybridization analysis of the E. coli chromosome with the S. typhimurium phoP gene suggest that E. coli K-12 also harbors the phoP and phoQ genes.