羽衣甘蓝柱头酵母双杂交cDNA文库的构建与分析

目的:构建应用于酵母双杂交系统的羽衣甘蓝柱头cDNA文库。方法:以羽衣甘蓝S13-bS13-b自交不亲和系为材料,提取柱头的总RNA,用亲和层析法分离纯化mRNA,利用CytoTrapXR建库试剂盒构建羽衣甘蓝柱头cDNA文库。结果:羽衣甘蓝柱头cDNA原始文库的库容量为2.5×105;扩增后文库的库容量约为4×108,重组率为96%,插入片段大小为0.4～3kb,平均长度在0.8kb左右。结论:构建了应用于酵母双杂交系统的羽衣甘蓝自交不亲和系柱头的cDNA文库,为探讨芸苔属植物自交不亲和的分子机理奠定了基础。     

应用酵母双杂交系统筛选新基因Collectrin相关蛋白

Collectrin是在小鼠 5 6肾切除后 ,在肾小球的高滤过、高增生期分离克隆的一个新基因 .通过酵母双杂交系统从人肾脏cDNA文库中筛选与collectrin相互作用的蛋白 ,可以为该基因的功能研究提供线索 .构建collectrin的真核表达载体collectrin pGBKT7 c myc ,转化酵母菌AH10 9.Western印迹证实 ,collectrin蛋白能够在酵母中正常表达 ,对酵母细胞无毒性 ,不存在自激活现象 .将AH10 9 collectrin pGBKT7 c myc与转化了成人肾脏cDNA文库的酵母菌Y187接合 ,共筛选到 5个与细胞代谢有关的蛋白 ,包括鞘磷脂激活蛋白、精氨琥珀酸合成酶、氨基酸转运蛋白XAT2、NADH脱氢酶 1和金属硫蛋白 2A .由此推论 ,collectrin可能通过与细胞内某些酶类相互作用而影响细胞代谢 ,为新基因collectrin的功能研究提供了重要线索 .     

灰飞虱高带毒（RSV）群体酵母双杂交cDNA文库的构建

为了研究灰飞虱Laodelphax striatellus Fallén与水稻条纹病毒（rice stripe virus, RSV）互作机制, 本研究构建了灰飞虱高带毒群体酵母双杂交cDNA文库。以实验室筛选的灰飞虱高带毒群体为材料, 分离纯化mRNA, 反转录合成双链cDNA, 并连接三框型接头, 层析柱分级纯化。采用同源重组反应制备三框型cDNA入门文库, 再通过同源重组将入门文库转移到Gateway兼容载体pGADT7-DEST上, 构建获得酵母双杂交cDNA文库。检测结果表明： 文库库容量为3.68×10⁷ cfu, 扩增文库滴度为2.62×10¹⁰ cfu/mL; 文库重组率大于95%, cDNA插入片段平均长度>1 kb, 达到了标准cDNA文库的要求。灰飞虱高带毒群体酵母双杂交cDNA文库的构建为开展昆虫介体与水稻条纹病毒互作机制的研究奠定了基础。     

油菜AP2/ERF-B4类转录因子克隆及表达载体的构建

利用油菜UniGene数据库,以拟南芥转录因子保守序列为探针,通过电子克隆方法分离得到一个UniGene库Bna.17538,进一步序列拼接得到一个油菜AP2/ERF-B4亚族的转录因子BnaERFB4-1,长度为672 bp,并进行了相关的生物信息学分析.结果显示BnaERFB4-1是亲水性蛋白,蛋白质三级结构与拟南芥RAP2.6L非常相似,蛋白质无序化程度大于拟南芥RAP2.6L.设计引物通过PCR和RT-PCR方法分别从甘蓝型油菜沪油15幼苗的DNA和cDNA中分离了BnaERFB4-1基因,命名为BnaERFB4-1-Hy15.序列测定和分析显示,来源于沪油15的BnaERFB4-1-Hy15基因与电子克隆的基因序列差异很小,有3个氨基酸位点不同,存在一个内含子.将BnaERFB4-1-Hy15基因通过BamHⅠ和SacⅠ酶切后分别插入酵母表达载体YK3302和植物双元表达载体pYF1404的相应位置,构建了BnaERFB4-1-Hy15基因的酵母体内结合和植物转化载体,为深入研究该基因在油菜抗逆调控中的作用奠定了基础.     

碱茅(puccinellia tenuifolra)Put-Cu/Zn-SOD基因的克隆及在酵母中的表达

从碱茅根cDNA文库分离得到Put-Cu/Zn-SOD全长cDNA,其序列全长为2 700 bp,该基因的开放读码框为长615 bp,所编码的蛋白由204个氨基酸组成,其预测分子量约为20.6 kD、理论等电点约为5.63.Put-Cu/Zn-SOD氨基酸序列与水稻Cu/Zn-SOD序列有较高的同源性为87%.将Put-Cu/Zn-SOD基因构建到酵母表达载体pYES2,并转化至酵母(INVSc1).对pYES2-Put-Cu/Zn-SOD转化酵母进行盐碱、氧化胁迫实验.结果表明:重组酵母的抗盐碱、氧化能力明显高于对照(pYES2转化酵母),结果显示了碱茅的Cu/Zn-SOD基因在酵母表达中,具有提高酵母抗盐碱和耐氧化能力.     

稻瘟菌诱导的水稻 WRKY 基因OsWRKY52 的分离和鉴定

WRKY 蛋白参与植物对生物或非生物胁迫反应和一些发育、代谢过程,在植物中组成一个转录因子大家族 . 从水稻 cDNA 文库中分离到一个新的 WRKY 基因——— OsWRKY52 cDNA ,包括一个 1 719 bp 的开放读码框,推测编码一个由 572 个氨基酸组成的蛋白质,与燕麦 (Avena sativa) AsWRKY1 具有 54 ％的氨基酸一致性 . 该基因被非亲和性稻瘟菌快速诱导 . 凝胶阻滞实验结果表明,原核表达的 OsWRKY52 能与水稻 PR1a 启动子上的 W 盒元件特异结合 . 采用酵母单杂交体系的方法证明了 OsWRKY52 具有转录激活活性 , 其丝氨酸岛、苏氨酸岛和 C 端的富酸性氨基酸区是负责转录激活的区域 . 这些结果提示 OsWRKY52 作为一个转录激活子,可能参与植物对稻瘟菌的应答反应 .     

中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母双杂交文库的构建

【目的】本研究旨在利用位点特异性重组技术(FullCoV)将中华蜜蜂 Apis cerana cerana 幼虫膜蛋白cDNA连接到pPR3-N载体上,构建中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母双杂交cDNA文库。【方法】提取2-3日龄中华蜜蜂工蜂幼虫总RNA;分离mRNA后,在反转录酶的作用下合成幼虫膜蛋白cDNA第1链,并合成双链cDNA。在双链cDNA的5′端加上带有重组序列的接头后,通过FullCoV技术与载体pPR3-N进行连接,然后将连接产物电转化到DH10B感受态细胞,构建中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母双杂交cDNA文库,并对该文库插入片段大小和文库滴度进行检测。【结果】通过FullCoV技术成功构建了中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母双杂交cDNA文库,经检测,中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母cDNA文库的总库容量为1.5×10^7 cfu,文库滴度为3×10^6 cfu/mL,重组率达到100%。【结论】本研究利用FullCoV技术成功构建了中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母cDNA文库,为进一步探究感染中华蜜蜂的病原微生物与宿主蛋白互作研究奠定了基础。     

草鱼细胞系CIK酵母双杂交cDNA文库的构建及初步应用

旨在探索草鱼呼肠孤病毒与宿主细胞蛋白质间的相互作用,运用SMART技术构建了草鱼肾组织细胞系CIK(Ctenopharyngodon idellus kidney)的酵母双杂交cDNA文库。提取CIK细胞总RNA后,分离纯化mRNA,然后以mRNA为模板,反转录合成cDNA第一链,再在DNA聚合酶作用下,通过长距离PCR,扩增双链cDNA。利用SMART技术,通过同源重组的方法,在酵母株Y187中构建了草鱼CIK细胞全长cDNA文库。经检测,未扩增文库的转化率为1.6×105,文库容量为2.4×106,插入的双链cDNA片段的长度为250-2 000 bp,文库滴度为7×107 CFU/mL,重组率为98%,此文库具有良好的cDNA片段多态性和完整性。利用构建的CIK酵母双杂交文库,以草鱼呼肠孤病毒的VP7和VP5蛋白作为诱饵进行筛选试验,得到VP7相互作用蛋白的阳性菌落,未得到VP5相互作用蛋白的阳性菌落。草鱼CIK细胞酵母双杂交cDNA文库的构建为研究草鱼呼肠孤病毒与宿主细胞间的互作机制提供了重要研究工具。     

巴西橡胶树43 kD橡胶粒子膜蛋白基因的cDNA克隆及表达

对43 kD的橡胶粒子膜蛋白进行了分离纯化和其N端氨基酸序列分析,根据N端氨基酸序列,设计一简并引物,通过3'RACE(Rapid Amplification ofcDNA Ends)的方法,获得了43 kD的橡胶粒子膜蛋白的cDNA.该cDNA含有1 385个核苷酸,含有完整的阅读框架,编码381个氨基酸.在终止密码子下游,包含有一个239bp的3'非编码区.该cDNA由5个首尾相连的重复单元组成,每个单元编码76个氨基酸组成的泛素(ubiquitin)单体.编码43 kD橡胶粒子蛋白的基因具有多个拷贝,在胶乳、叶片和树皮都表达.     

云南红豆杉紫杉烯合成酶基因克隆、序列分析与植物表达载体的构建

利用分段RT—PCR法成功地从云南红豆杉叶片总RNA中分离出两条长约1．4kb和1．5kb的cDNA片段,克隆到pUCm—T载体中,序列拼接分析表明,该cDNA片段与Wildung MR等发表的紫杉二烯合成酶基因编码区2586bp有41个核苷酸不同,同源性为98．42％,具有编码862个氨基酸蛋白质的能力．为了检测所克隆的基因编码产物是否具有活性,并进一步制备抗体以便于将来转基因植物的检测,构建了一个酵母表达载体GAPA-T14;为了转化植物构建了两个具有不同启动子的植物表达载体,pBI121-T14(含35S启动子)和pBIH-T14(在pBI121的基础上以胶乳特异启动子取代35S启动子)．     

产角质酶酵母菌的发现与鉴定及产酶条件的优化

为得到有效水解杜仲角质层的角质酶,通过生物酶法提取杜仲中的活性成分。从病变的杜仲叶中分离出一株能高产角质酶的菌种,鉴定分析证实该菌株是胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa),这是首次从植物病原真菌以外发现产角质酶的酵母菌,并对该菌株发酵产角质酶的条件进行优化。这一发现意义重大,因为酵母菌比植物病原菌安全许多,更利于大规模生产。     

信息库

1.由光滑球拟酵母从葡萄糖发酵生产丙酮酸 丙酮酸是代谢途径巾重要的有机酸。它是许多药物合成的原料和动物细胞培养的重要成分,它还是酶法合成L-色氨酸,L-酪氨酸,L-二羟苯丙氨酸等氨基酸的底物。许多酵母,如酵母属,球拟酵母属,毕赤酵母属,假丝酵母属和丝孢酵母属中,用羟基硫胺素(硫胺素类似物)的休眠细胞法都可以筛选到产丙酮酸的菌株。在初筛中,酵母属菌株产丙     

人胎肝唾液酸转移酶基因的克隆及测序*

根据已克隆的唾液酸转移酶的保守区的序列,以人胎肝mRNA为模板扩增出150bp的片段并测序。其中一个片段(s38)与已克隆的唾液酸转移酶的活性中心有57％～97％的同源性。根据s38的序列合成寡核苷酸并标记后用作探针筛选人胎肝cDNA文库。从文库中分离了一个编码α2,3－唾液酸转移酶的cDNA。该cDNA序列含一个编码340个氨基酸的开放读框,推导的氨基酸序列与人颌下腺(Galβ1,GalNAc。Α2,3－唾液酸转移酶相同,与猪颌下腺α2,3－唾液酸转移酶有83.2％的同源性。表明从人胎肝cDNA文库中分离的cDNA所编码的蛋白为Galβ1,3GalNAcα2,3－唾液酸转移酶。     

毛木耳漆酶基因的克隆、序列分析及其鉴定

本文利用PCR和RACE技术首次从毛木耳AP4菌株中获得编码漆酶基因的cDNA及其基因组全长序列,基因组大小为2514 bp.通过比较该漆酶基因的cDNA和基因组DNA的全长序列,发现该基因包含14个外显子和13个内含子.cDNA序列的全长为1972 bp,其包含一个完整的ORE长度为1860 bp,编码619氨基酸,推测的分子量大小为68 kD,等电点pI为5.15.在氨基酸序列的氨基末端存在一个信号肽序列,同时该基因还包括含铜氧化酶的三个功能结构域KOG1263、SufI和pfam00394.氨基酸序列与GenBank中登录的真菌漆酶蛋白序列比对表明:该氨基酸序列与其它真菌漆酶蛋白序列有较高的同源性,氨基酸序列相同性最高达41%,相似性为58%,并且含有真菌漆酶的四个保守的Cu-bind结构域.将获得的漆酶基因lacl与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,构建重组质粒pYH3660,将其转化到毕赤酵母中,经甲醇诱导该基因在第10天产酶高达123 IU/L,并通过Native SDS-PAGE电泳获得预期大小的漆酶蛋白条带.结构分析和功能验证均表明:本研究获得的基因lacl为漆酶基因.     

巴西橡胶树HbSIP2互作蛋白的筛选和鉴定

可溶性无机焦磷酸酶在天然橡胶生物合成中具有重要的调控作用,HbSIP2是胶乳中关键的可溶性无机焦磷酸酶基因。为了深入了解HbSIP2调控橡胶生物合成的机理,本研究对HbSIP2互作蛋白进行了筛选和鉴定。结果表明:诱饵载体p GBKT7-Hb SIP2无自激活活性,且对酵母无毒性作用,可以用于酵母文库筛选。将诱饵载体与橡胶树胶乳cDNA文库进行杂交,初步筛选获得20个与HbSIP2互作的蛋白。进一步通过双分子荧光互补实验证实,Hb SIP2能够与橡胶延伸因子发生蛋白互作。本研究结果为HbSIP2调控橡胶生物合成的机理研究提供了重要的理论依据。     

酵母DNA修复基因RAD16温度敏感突变株的分离及人类互补基因的鉴定

用PCR介导的基因重组法敲除酵母RAD16基因, 用羟胺处理酵母RAD16基因表达质粒, 获得RAD16基因突变库,并将其转化RAD16基因敲除的酵母细胞. 用平皿复制法获得温度敏感突变株 rad16-ts2,经互补试验证实,该突变表型为RAD16基因突变所致.将人cDNA表达文库转化rad16-ts2后筛选温度敏感拯救(rescue)表型, 回收拯救表型酵母细胞中的质粒. 测序结果表明,所获得的人cDNA克隆为HLTF/Zbu1/SMACA3基因.比较分析显示,人类该基因编码蛋白质氨基酸序列与酵母Rad16的同一性为32%,相似性则达50%.人HLTF/Zbu1/MACA3基因在HeLa细胞中过表达,可显著抑制过氧化氢损伤和UV照射诱导的细胞凋亡.     

亚洲棉Ｃ４Ｈ同源cDNA的分离和表达特征分析

根据Ｐ４５０保守序列设计简并引物,从亚洲棉（Gossypium arboreum L.)cDNA库中分离到两个肉桂酸－４－羟化酶（Ｃ４Ｈ）同源cDNA克隆。这两个棉花Ｐ４５０被划分到ＣＹＰ７３Ａ亚族中,分别被命名为ＣＹＰ７３Ａ２５和ＣＹＰ７３Ａ２６。它们各编码５０５个氨基酸残基,彼此之间的氨基酸序列同源性为９１．３％。它们与其他植物Ｃ４Ｈ的同源性高达９０％以上。ＲＴ－ＰＣＲ分析表明,ＣＹＰ７３Ａ２６在棉花的花瓣、花萼果皮以及发育种子中均有较高水平的表达。ＣＹＰ７３Ａ２５在花瓣、花萼和果皮中有较强表达,而在种子中表达很弱。     

菜豆泛肽基因在生物和非生物胁迫下的表达

差别筛选HgCl2胁迫处理的菜豆（Phaseolus vulgaris L.）幼苗叶片cDNA库,分离出1个重金属胁迫响应基因PvSR52克隆,其cDNA长度为281bp。cDNA和氨基酸序列同源性分析表明PvSR52编码一种多聚泛肽。Southern blot结果表明菜豆泛肽可能由少数基因编码。Northern blot分析表明多聚泛肽叶片中表达较少;重金属Hg、Cd和As等、过量的Zn和Cu及高温、病毒侵染和水杨酸等环境胁迫均能强烈地刺激其在叶片中的表达。推测泛肽水解系统在提高植物的抗塑性方面有重要作用。     

盾叶薯蓣环阿屯醇合酶基因克隆与表达

利用巢式PCR和RACE技术从盾叶薯蓣中克隆了阿屯醇合酶的cDNA(定名为DZCAS).结果表明,该cDNA的开放读码框为2 280 bp,编码759个氨基酸的多肽,分子量为86 924 Da,等电点为6.39.氨基酸序列比对表明盾叶薯蓣阿屯醇合酶与其他植物阿屯醇合酶的相似性超过70%,含有环阿屯醇合酶共有的保守序列.利用氧化鲨烯环化酶基因缺陷型酵母表达DZCAS,并用高效液相色谱和液质联用仪检测酵母细胞中环阿屯醇合成情况,证明DZCAS编码环阿屯醇合酶.RT-PCR分析表明,DZCAS在盾叶薯蓣幼叶中表达量最高,其次是在地下幼嫩块茎中,而地上幼茎表达量最低.     

眼镜王蛇泛素融合蛋白基因和核糖体蛋白L30基因的克隆及分析

从广西产眼镜王蛇（Ophiophagus hannah）毒腺中抽提总RNA,经mRNA纯化后构建眼镜王蛇毒腺cDNA文库。从所构建的cDNA文库中,随机筛选200个克隆测序,得到两个在进化上高度保守的基因：泛素融合蛋白基因（GenBank登录号为AF297036）和核糖体蛋白L30基因（GenBank登录号是AF297033）。前者cDNA的开放阅读框为387bp,后者为348bp。前者编码128个氨基酸残基组成的泛素融合蛋白前体;后者编码115个氨基酸残基组成的核糖体蛋白L30前体。由cDNA序列推导出的氨基酸序列分析表明,泛素融合蛋白前体包括N-末端的泛素结构域（76个氨基酸残基）和C-末端的核糖体蛋白L40结构域（52个氨基酸残基）。该蛋白为一高碱性蛋白,C末端含有一个“锌指”模式结构。与16个物种比较的结果表明,眼镜王蛇与脊椎动物的泛素融合蛋白氨基酸序列相似度较高,具有高度的保守性。