外源性端粒酶基因对人脐静脉内皮细胞的影响

为了观察外源性端粒酶逆转录酶基因(hTERT)在人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)的表达及对细胞功能和生长的影响。采用逆转录病毒载体转导的方法,将hTERT基因转入HUVEC,检测基因转导后内皮细胞端粒酶的活性和生物学特性。结果发现hTERT转导后细胞端粒酶表达阳性,未转导的亲代细胞为阴性;转导细胞的体外生存时间延长但未永生化,而内皮细胞黏附分子表达的功能未受影响。     

肝细胞生长因子抑制糖基化终产物诱导人脐静脉内皮细胞的凋亡作用

目的探讨肝细胞生长因子(HGF)抑制糖基化终产物(AGEs)诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的作用及其相关分子机制。方法体外培养ECV-304人脐静脉内皮细胞,采用噻唑蓝(MTT)法测定HGF对AGEs作用后ECV-304细胞生长抑制率的影响;通过Hoechst33258荧光染色观察细胞形态学改变、流式细胞术测定AnnexinV-FITC/PI双染标记的细胞凋亡率,检测HGF对AGEs诱导ECV-304细胞凋亡的影响;Western印迹法检测Bax、Bcl-2蛋白的表达。结果HGF能明显降低AGEs对ECV-304细胞生长的抑制作用;AGE诱导培养的ECV-304细胞出现明显的凋亡形态学改变,在一定浓度范围内,ECV-304细胞凋亡率与AGEs的浓度和作用时间呈依赖关系,加入HGF处理后可显著降低不同时间的内皮细胞凋亡率;HGF作用ECV-304细胞后Bcl-2蛋白表达明显升高,而Bax蛋白表达无明显变化。结论AGEs能诱导内皮细胞凋亡,而HGF能部分抑制AGEs诱导的内皮细胞凋亡,其作用机制可能与上调Bcl-2蛋白的表达水平有关。     

三七总皂苷及单体组合对ox-LDL诱导内皮细胞ICAM-1表达的影响

目的:研究三七总皂苷及其单体组合对ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)粘附分子ICAM-1表达的影响.方法:体外培养人脐静脉内皮细胞,加入100mg·L-lox-LDL刺激HUVECs,诱导单核-内皮细胞黏附,加入不同浓度的PNS及单体组合进行干预,蛋白染料法测定黏附值,RT-PCR检测HUVECs粘附分子ICAM-ImRNA的表达,Western-blotting检测HUVECs粘附分子ICAM-1蛋白的表达.结果:PNS各剂量组及单体组合组可有效降低单核-内皮细胞的黏附;ox-LDL可显著增加HUVECs的ICAM-1 mRNA及蛋白表达(P＜0.05);PNS各剂量组及单体组合组与ox-LDL组相比,均能显著降低ICAM-1的mRNA及蛋白表达(P＜0.05).结论:抑制ox-LDL诱导的内皮细胞ICAM-1mRNA及蛋白的表达,可能为PNS抗动脉粥样硬化作用机制之一.     

血管内皮细胞MICA基因mRNA和蛋白质表达

MICA系MHC-I类相关多态性基因A,其表达细胞膜蛋白质分子与器官移植免疫排斥有关.新生儿脐带静脉血管内皮细胞(HUVEC)被分离和培养至4～6代.11例新分离培养的HUVEC和7种人细胞株的MICAmRNA转录水平用RT-PCR检测,应用细胞流式检测细胞膜表面的MICA分子的表达情况,同时应用免疫印迹的方法对整个细胞MICA蛋白质的表达水平进行检测和分析.结果显示MICAmRNA在所有检测细胞中有表达,HUVEC细胞膜或胞浆中MICA蛋白质表达量很高,而在人体淋巴细胞膜表面和胞内未检出MICA分子的表达.提示HUVEC和淋巴细胞在MICA表达的差异性可能与不同细胞的内部调节机制有关.而供体器官血管内皮细胞表达多态性MICA分子有可能成为移植抗原发生免疫排斥反应.     

脑血管内皮细胞Prmt5在脑血管发育过程中的表达及其下游靶分子

目的:研究内皮细胞中蛋白精氨酸甲基转移酶5(PRMT5)在脑血管发育及血脑屏障建成的关键时期的表达变化及其潜在下游靶分子。方法:原位观察PRMT5在小鼠不同发育时期脑血管内皮上的分布;流式分选获得原代脑血管内皮,利用real-time PCR分析Prmt5的表达;体外培养小鼠内皮细胞敲降Prmt5后,利用Western印迹、real-time PCR、ChIP等方法检测其对经典下游分子的影响。结果:PRMT5在胚胎期各时间点的脑血管内皮细胞质均有表达,小鼠出生后主要表达在脑血管内皮细胞核,在胚胎期18.5 d时表达量显著升高;小鼠脑血管内皮细胞体外细胞系中基因敲降Prmt5后,其经典对称甲基化组蛋白产物H4R3me2s及H3R2me2s均明显下降,Bmp4表达显著上调;免疫共沉淀实验提示Bmp4启动子区域组蛋白具有H3R2me2s修饰,Prmt5基因敲降后,该组蛋白修饰显著减少。结论:脑血管发育过程中PRMT5在脑血管内皮细胞中表达的位置和水平均发生变化,脑血管内皮细胞中PRMT5可以调节H4R3和H3R2对称二甲基化水平,Bmp4启动子区域组蛋白具有H3R2me2s修饰,且PRMT5可以抑制Bmp4表达。     

细胞周期素A在血管瘤组织中的表达及临床意义

目的 探讨细胞周期素A在血管瘤中的表达及与血管瘤发生、发展的关系。方法收集武汉大学人民医院病理科1996—2001年皮肤毛细血管瘤存档蜡块49例,所有标本常规HE染色和免疫组织化学SP法检测增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）,按Mulliken分类标准并结合PCNA的表达进行分组;然后采用免疫组织化学SP法和原位杂交检测49例皮肤毛细血管瘤增生期、退化期及正常皮肤组织中细胞周期素A的表达水平,并结合检测Ⅷ因子相关抗原的表达证实血管瘤组织中表达细胞周期素A的细胞的确是血管瘤内皮细胞,对免疫组织化学结果采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告管理系统对细胞周期素A的表达进行定量分析。并用SPSS11．5软件对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和SNK（q）检验。结果增生期血管瘤内皮细胞中细胞周期素A高表达,退化期呈低表达。经q检验,增生期组与退化期组之间、增生期组与正常皮肤组之间,细胞周期素A的平均光密度及阳性面积率有显著性差异（P〈0．01）,退化期组与正常皮肤组之间平均光密度及阳性面积率的差异无显著性（P〉0．05）。结论细胞周期素A在增生期血管瘤组织中的过度表达使细胞周期紊乱,是增生期血管瘤内皮细胞不断分裂增生。     

缺氧复氧诱导脐静脉内皮细胞凋亡的机制

目的探讨缺氧复氧诱导人脐静脉内皮细胞凋亡发生的机制.方法体外培养人脐静脉内皮细胞,随机分为5组:缺氧0h(对照组)、3h、6h、12h、24h复氧组.向培养瓶内通入95%N2和5%CO2按不同时间孵育,随后通入5%CO2和95%空气复氧2h,建立内皮细胞缺氧复氧模型.采用台盼蓝染色、TUNEL技术对凋亡和死亡细胞进行定量分析,DNA电泳观察内皮细胞凋亡的形态学.Western blot检测细胞凋亡调节蛋白Bcl-2和Bax表达强度,同时检测丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)中磷酸化ERK1/2的表达.采用凝胶成像分析系统灰度扫描检测蛋白质表达相对量.结果缺氧复氧后内皮细胞凋亡明显,而且内皮细胞凋亡数随缺氧时间延长而增多(P<0.05).Western blot表明缺氧复氧增强内皮细胞Bax的表达,对Bcl-2的表达量和磷酸化ERK1/2没有明显影响,使Bcl-2/Bax比值减小.结论缺氧复氧可以诱导内皮细胞凋亡,证实缺氧复氧上调促凋亡蛋白Bax的表达,对抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达无显著影响.首次证实缺氧复氧诱导内皮细胞凋亡是取决于Bcl-2/Bax比值,而不是通过MAPK磷酸化途径.     

二苯乙烯苷对H202诱导血管内皮细胞ICAM-1及VCAM-1表达的影响

目的：通过研究二苯乙烯苷（TSG）对H20：诱导的人脐静脉内皮细胞ICAM-1、VCAM-1表达的影响,探明二苯乙烯苷抗氧化保护内皮细胞的作用机制。方法：体外培养人脐静脉内皮细胞,实验分为空白对照组、H20：组、辛伐他汀组、TSG组,运用逆转录聚合酶链式反应和酶联免疫吸附试验分别检测ICAM-1及VCAM-1mRNA与其蛋白的表达。结果：200μmol·L。的H202作用内皮细胞24h后。ICAM．1和VCAM-1的mRNA和蛋白表达水平均明显上调,与空白对照组比较,差异有显著性（P〈0．01）。而在200μmol·L。的H202作用前用1μmol·L^-1二苯乙烯苷预处理体外培养人脐静脉内皮细胞4h,结果显示二苯乙烯苷能抑制H2O2诱导的内皮细胞ICAM-1、VCAM-1的mRNA和VCAM-1的蛋白水平表达,与H2O2组比较差异有显著性（P〈0．01）;而ICAM-1的蛋白表达水平与H202组比较差异有统计学意义（P〈0．05）;辛伐他汀组ICAM-1和VCAM-1的mRNA及其蛋白水平表达降低,与H20：组比较差异均有显著性（P〈0．01）。实验结果表明二苯乙烯苷可抑制H2O2诱导的内皮细胞粘附分子ICAM-1、VCAM-1表达。结论：二苯乙烯苷可通过降低细胞粘附分子ICAM-1和VCAM-1的表达保护氧化应激引起的人脐静脉内皮细胞损伤。     

晚期糖基化终产物对人脐静脉内皮细胞的肝细胞生长因子表达的影响

目的探讨晚期糖基化终产物(AGEs)对人脐静脉内皮细胞的肝细胞生长因子(HGF)mRNA及蛋白表达的影响。方法体外培养人脐静脉内皮细胞,予不同浓度(100mg/L、200mg/L、400mg/L)的AGEs刺激24h及400mg/LAGEs作用6h、12h、24h及48h,采用RT-PCR及免疫细胞化学法检测内皮细胞HGFmRNA及蛋白的表达水平。结果在一定范围内随着AGEs浓度增加,内皮细胞HGF表达逐渐增高;AGEs早期作用内皮细胞,促进HGFmR-NA及蛋白的表达,随着AGEs的持续作用,HGF表达减弱。结论随着AGEs作用时间的延长,HGF对受损内皮细胞的修复作用先增强后减弱。     

丙型肝炎病毒感染的体外培养细胞的抗原表达

建立丙型肝炎病毒（HCV）体外感染细胞模型,观察其感染细胞的HCV抗原表达,用抗HCV抗体和HCVRNA阳性及阴性血清感染MOLT-4细胞,制备细胞片进行免疫酶染色。结果显示HCV感染MOLT-4细胞4天和阴性对照HCV抗原均为阴性;感染后7天胞浆内可见HCV抗原阳性免疫反应产物;15天阳性细胞达到高峰,43天仍可见少量阳性细胞。结果表明HCV体外感染MOLT-4细胞胞浆内观察到HCV抗原表达。     

伪原薯蓣皂苷对Ox-LDL诱导人脐静脉内皮细胞COX-2表达的影响及机制研究

为探究伪原薯蓣皂苷对Ox-LDL诱导的内皮细胞COX-2表达的影响。体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC),加入伪原薯蓣皂苷预处理细胞24 h,再以氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)诱导HUVEC细胞表达COX-2;采用Real-time PCR和western blot分别检测了COX-2的mRNA和蛋白表达水平,以及与COX-2炎症信号通路相关的激酶活性。结果显示,伪原薯蓣皂苷剂量依赖的下调COX-2的表达,同时抑制p38MAPK的激酶活性。这些结果表明,伪原薯蓣皂苷可能通过抑制TLR2/p38MAPK通路而抑制内皮细胞炎症介质COX-2的表达,提示其对内皮细胞的抗炎效应。     

二苯乙烯苷对H2O2诱导血管内皮细胞ICAM-1及VCAM-1表达的影响

目的:通过研究二苯乙烯苷(TSG)对H2O2诱导的人脐静脉内皮细胞ICAM-1、VCAM-1表达的影响,探明二苯乙烯苷抗氧化保护内皮细胞的作用机制.方法:体外培养人脐静脉内皮细胞,实验分为空白对照组、H2O2组、辛伐他汀组、TSG组,运用逆转录聚合酶链式反应和酶联免疫吸附试验分别检测ICAM-1及VCAM-1 mRNA与其蛋白的表达.结果:200 μmol· L-1的H2O2作用内皮细胞24h后,ICAM-1和VCAM-1的mRNA和蛋白表达水平均明显上调,与空白对照组比较,差异有显著性(P＜0.01).而在200μmol· L-1的H2O2作用前用1μmol· L-1二苯乙烯苷预处理体外培养人脐静脉内皮细胞4h,结果显示二苯乙烯苷能抑制H2O2诱导的内皮细胞ICAM-1、VCAM-1的mRNA和VCAM-1的蛋白水平表达,与H2O2组比较差异有显著性(P＜0.01);而ICAM-1的蛋白表达水平与H2O2组比较差异有统计学意义(P＜0.05);辛伐他汀组ICAM-1和VCAM-1的mRNA及其蛋白水平表达降低,与H2O2组比较差异均有显著性(P＜0.01).实验结果表明二苯乙烯苷可抑制H2O2诱导的内皮细胞粘附分子ICAM-1、VCAM-1表达.结论:二苯乙烯苷可通过降低细胞粘附分子ICAM-1和VCAM-1的表达保护氧化应激引起的人脐静脉内皮细胞损伤.     

人、猪、鼠血管内皮及平滑肌细胞培养与纯化方法的改进

对培养和纯化猪主动脉内皮细胞,人脐静脉内皮细胞,猪和鼠主动脉平滑肌细胞的方法进行改进。对其鉴定方法进行了讨论,用胶原酶或胰酶消化法,或机械法分别从猪主动脉,人脐静脉,鼠主动脉获得内皮细胞和平滑肌细胞进行培养,用光学相差显微镜,免疫组化的方法进行鉴定,结果显示,相差显微镜观察,人脐静脉内皮细胞接种后2-3小时贴壁,继而铺开生长,在视野内形成散在细胞团,细胞呈铺路石样排列的单层,随着传代次数增多,可见核分裂,双核及多核,猪血管内皮细胞呈鹅卵石样,多角形,生长分裂旺盛时可见两个或多个核,猪和鼠的平滑肌细胞在相差显微镜下外观为长梭形,细胞生长致密时排列成束,相互平行,并且重叠生长,表现为典型的“波峰”与“浪谷”状。猪血管内皮细胞DiI-Ac-LDL染色,在荧光显微镜下显示特征性的黄绿色荧光,人Ⅷ因子抗原免疫组化检测人脐静脉内皮细胞,显微镜下可见核周胞浆呈现阳性反应,免疫组织化学法进行平滑肌细胞α-肌动蛋白染色,显微镜下见细胞浆内着色,本介绍的培养及纯化猪血管内皮细胞,猪平滑肌细胞,鼠平滑肌细胞的方法简便易行。     

大鼠脑微血管内皮细胞培养及其药物转运体Oatp2和P-gp的表达

贴块法培养脑微血管内皮细胞(BMECs),倒置显微镜动态观察细胞生长及形态,Ⅷ因子相关抗原、CD34免疫细胞化学联合鉴定细胞并确定纯度。免疫细胞化学和Western印迹法检测药物转运体有机阴离子转运多肽亚型2(Oatp2)及P-糖蛋白(P-gp)在培养内皮细胞上的表达。结果显示,获得的BMECs呈多角形或铺路石形,单层贴壁生长;培养细胞Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学、CD34免疫荧光染色均为阳性,细胞纯度90%;培养细胞有Oatp2及P-gp表达,且二者均主要表达于BMECs细胞膜。提示贴块法可获得原代培养BMECs,方法简便易行,细胞纯度较高。原代培养的BMECs上有药物转运体Oatp2及P-gp的表达,为血脑屏障上药物转运体的体外研究提供了可能途径。     

人脐静脉内皮细胞的原代培养和鉴定

目的：探索建立稳定有效的脐静脉内皮细胞体外培养方法。方法：用0．1％II型胶原酶消化分离人脐静脉肉皮细胞,加入含内皮细胞生长因子的M199完全培养液中培养,用胰蛋白酶-EDTA进行消化传代培养,用光镜和免疫组化方法对培养的细胞进行形态观察和鉴定。结果：原代培养的内皮细胞在接种后24h后完全贴壁生长,第445天后融合呈铺路石样镶嵌排列,免疫组化可见胞浆中第Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应,证实培养的细胞为内皮细胞。结论：脐静脉灌注II型胶原酶消化法配合M199完全培养液可获得高纯度的内皮细胞,细胞可传代5—6次,但细胞产出量不高,不能传10代以上,5代以后细胞形态变化较大,对于复杂的基础研究应用受限。     

单核细胞趋化蛋白-1诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的分子机制(英文)

本研究旨在探讨单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotacitic protein-1,MCP-1)诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,hUVECs)凋亡的分子机制。胶原酶消化收集hUVECs,体外培养细胞,用胰蛋白酶-EDTA混合液消化传代,用血管性假血友病因子(von Willebrand factor,vWF)和VEGF受体2(KDR)免疫染色证实培养细胞为内皮细胞;用不同浓度MCP-1(0.1、1.0、10、100ng/mL)分别作用hUVECs24h、48h;用流式细胞术及蛋白免疫印迹法检测凋亡相关蛋白Fas、Bcl-2、Bax的表达。如我们前期结果所示,MCP-1能诱导hUVECs的凋亡,其效应随浓度和时间的增加而增强;与对照组比较,MCP-1下调抑凋亡蛋白Bcl-2的表达,上调促凋亡蛋白Fas、Bax的表达。以上结果表明,MCP-1能诱导hUVECs凋亡,其作用机制可能与上调Bax、Fas蛋白及下调Bcl-2蛋白表达有关。     

CCR7和B7-2在抗原负载树突状细胞诱导特异性CTL抗肿瘤效应中的表达和意义

目的:研究CCR7(趋化因子受体7)和B7-2(白细胞分化抗原86)与抗原负载树突状细胞(dentritic cell,DC)诱导特异性CTL(细胞毒性T淋巴细胞)抗肿瘤效应的关系.方法:分离和培养DC,制备B16黑色素瘤细胞抗原,进行共培养,即为抗原负载的DC,建立B16黑色素瘤小鼠模型,于肿瘤周围皮下注射抗原负载的DC.应用原位杂交和免疫组织化学方法检测CCR7和B7-2的表达情况.结果:原位杂交和免疫组织化学染色显示,CCR7和B7-2阳性细胞主要分布于肿瘤周围组织,随着注射抗原负载DC时间的进展,CCR7和B7-2呈强阳性表达.结论:CCR7和B7-2的表达与抗原负载树突状细胞诱导特异性CTL抗肿瘤效应有关.     

水蛭素抑制人脐静脉内皮细胞基质金属蛋白酶-2的生成及活化

研究凝血酶对人脐静脉内皮细胞表达基质金属蛋白酶的影响及重组水蛭素的作用。将原代培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的第2～5代分组后与凝血酶(4．0ku／L)共同温育,同时分别加入水蛭素(6．0ku/L)和肝素(6．0ku／L),在不同时间,用逆转录聚合酶链反应和免疫组织化学分析的方法评价基质金属蛋白酶-2的表达情况。结果显示凝血酶促进血管内皮细胞产生和活化基质金属蛋白酶-2。重组水蛭素可以有效地阻断凝血酶的上述作用。     

细胞周期素G1、G2在皮肤血管瘤组织中的表达及意义

目的探讨细胞周期素G1、G2与血管瘤发生发展及退化的关系。方法采用免疫组织化学S-P法对50例血管瘤和5例正常皮肤组织检测细胞周期素G1、G2的表达;对所获得的检测结果进行图像分析处理。结果增生期血管瘤内皮细胞胞浆或胞核内cyclin G1呈强阳性表达,退化期血管瘤内皮细胞胞浆内cyclin G1无表达;增生期血管瘤内皮细胞胞浆内无cyclin G2表达,退化期血管瘤内皮细胞胞浆内cyclin G2呈强阳性表达。增生期组与退化期组、正常皮肤组分别相比,细胞周期素G,阳性表达差异有显著性（P〈0．05）,退化期组与增生期组、正常皮肤组之间,细胞周期素G2的阳性表达差异有显著性（P〈0．05）。结论细胞周期素G1、G2在血管瘤发生、发展及退化中起着重要作用。     

中国版纳小型猪近交系动脉异种移植靶抗原研究

目的　研究中国版纳小型猪近交系动脉的异种靶抗原α -Gal的分布和半定量分析 ,为研究异种移植超急性排斥反应和异种生物材料提供资料。方法　通过亲和免疫组织化学法和图象分析对 10头版纳小型猪的四级动脉进行α Gal的分布和半定量研究。结果　 (1)各级血管组织中血管内皮细胞阳性表达明显 ,弹性纤维、胶原纤维和平滑肌细胞未见表达 ,外膜有微弱表达 ;(2 )图象分析显示 ,管径越细 ,其内皮细胞的表达越高 (P <0 .0 1) ,各级动脉内皮细胞阳性表达的面积密度比的组间差异显著 (P <0 .0 1) ,t检验发现每两组间的动脉内皮细胞阳性表达面积密度比相差显著 (P <0 .0 1)。结论　 (1)版纳小型猪动脉内皮细胞均有异种抗原α Gal分布 ,但是分布不均匀 ;(2 )微血管血栓是异种移植超急性排斥反应中的重要环节 ,小型猪的异种器官移植、彻底解决异种移植超急性排斥反应的关键是防治微血管栓塞