用磁珠富集法从AFLP片段中分离微卫星DNA标记

将花生(Arachis hypogaea L．)基因组DNA经酶切后转变成AFLP DNA片段,然后用生物素标记的简单重复序列(SSR)作探针与其杂交,杂交复合物固定到包被有链亲和素的磁珠上,经过一系列的洗涤过程,含有SSR的AFLP片段被吸附在磁珠表面。这些片段经洗脱下来后,先用对应的AFLP引物扩增,再进行克隆和测序,根据SSR两端的保守序列设计引物,经过多态性分析后,便可得到微卫星DNA标记。整个实验过程操作简单、消耗少,可在一周内完成,可作为从植物中分离SSR的一种简单有效的方法。     

磁珠富集法分离小黄李基因组微卫星DNA片段

将微卫星探针5′端生物素化后与链亲和素磁珠特异结合,用磁珠和探针的结合物与两端连接已知序列人工接头的中国李品种小黄李(Prunus salicinacv.Xiaohuangli)基因组DNA酶切片段杂交,以此杂交片段为模板用人工接头序列为引物进行PCR扩增,根据PCR产物测序结果设计引物作为微卫星DNA的标记引物.结果在随机挑选的36个克隆进行菌落PCR检测时,从31个阳性克隆中挑选18个克隆进行测序后获得了12条特异序列,设计的8对SSR引物均在5个中国李受试品种上获得了预期的扩增产物,其中4对引物在受试品种上表现出多态性.     

磁珠富集法分离刀鲚微卫星标记

利用磁珠富集法分离微卫星序列,以开发长江刀鲚微卫星分子标记。将长江刀鲚基因组DNA经限制内切酶Mse I酶切,回收400-1 000 bp片段,安装接头,构建长江刀鲚全基因组PCR文库。用生物素标记的微卫星探针(CA)12与其杂交,磁珠富集含有微卫星序列的DNA片段。将洗脱所得片段进行PCR扩增,然后进行克隆。经过菌落PCR检验后挑选出118个阳性克隆进行测序,其中97条含有微卫星序列。用设计合成59对微卫星引物对30尾养殖长江刀鲚进行引物的多态性筛选,得到9对多态性引物。     

磁珠富集法开发北柴胡多态性简单序列重复标记

目的:利用磁珠富集法分离北柴胡微卫星序列,以开发北柴胡微卫星引物,获得有多态性的简单序列重复(SSR)标记。方法:用生物素标记的混合探针(AC)15、(AG)15、(MAB)12和两端连接已知序列人工接头的北柴胡基因组DNA酶切片段混和后与磁珠杂交,构建微卫星序列富集的小片段插入文库;利用接头引物分别与生物素探针引物Biotin-(AC)15、Biotin-(AG)15、Biontin-(MAB)12形成3个组合,用PCR方法对文库进行初步筛选;对可能的阳性克隆子进行测序复筛,选取微卫星侧翼序列足够长的序列设计引物,用荧光标记的基因分型技术以栽培柴胡种质为材料分析其多态性。结果:开发了5对多态性SSR标记,它们在5份柴胡栽培种质中共扩增出30.70个多态性等位基因,平均每条引物可以扩增出6.14个多态性等位基因;观察等位基因数最多13个,最少3个;有效等位基因数最多11.4个,最少1.6个。同时分析了4对EST-SSR引物,比较了2种SSR标记扩增结果。结论:磁珠富集法是开发柴胡多态性SSR标记的有效方法。     

棉花2个多标记基因系及其杂交后代AFLP分析

应用AFLP分子标记技术,对陆地棉两个多标记基因系T582和T586及其杂交后代F1等进行了DNA多态性分析。结果表明:在58对EcoRI/MseI引物组合中,筛选出41对引物组合具有多态性,多态性的引物组合占筛选总组合的70.69%。AFLP分子标记具有高度的多态性,非常适于基因组差异较小的(棉花)材料之间的多态性筛选。采用聚丙烯酰胺银染法显带技术,AFLP进行PCR扩增能看到30~80条DNA亮带,且检测灵敏度高,可区别只相差十几个bp甚至几个bp大小的DNA片段。但AFLP标记以显性标记占绝对优势,共显性标记比率极少,故而难以区分种质的杂合和纯合,这是它的惟一不足之处。     

巴氏蘑菇微卫星序列的分离及其对Co60辐射诱变菌株的鉴别

根据链霉素磁珠和生物素特异结合的特性,用生物素标记的二聚核苷酸重复序列探针从巴氏蘑菇的基因组中分离微卫星序列。将结合于链霉素磁珠上的标记探针同两端连接已知序列人工接头的巴氏蘑菇DNA酶切片段杂交。洗脱未杂交DNA片段后,用磁珠富集的片段建立微卫星文库。挑取522个菌落用对应重复序列为引物进行PCR筛选,得到48个阳性克隆,经测序有32个菌落含微卫星序列。微卫星富集效率为阳性克隆数的67%,总克隆数的6%。除去重复或无效的微卫星序列,在设计出的12对用于鉴别85个巴氏蘑菇的Co60辐射变异株微卫星引物中,有4对引物总共扩增出明显的变异菌株17个。证明有些微卫星位点可用于巴氏蘑菇辐射变异品种的指纹筛选与鉴别。     

SCoT分子标记在割手密遗传图谱构建中的应用

本研究以割手密GXS85-30×GXS87-16的杂交后代为材料,应用目标起始密码子多态性(SCoT)分子标记对杂交后代进行杂种鉴定,获得由157个单株组成的F1杂种群,同时对比SCoT、AFLP和SSR分子标记在割手密基因组多态性分析和获得分离标记的效果,证实SCoT在扩增DNA多态性上优于SSR分子标记,在获取分离标记上优于AFLP分子标记,验证了SCoT分子标记技术在割手密遗传分析中的应用效果,为割手密遗传分析和遗传图谱构建提供了一种新型高效的目的基因分子标记技术。     

分子标记技术的发展及应用

介绍了几种应用前景较广的分子标记,如基于DNA杂交技术的分子标记:限制性片段长度多态性(RFLP)和DNA可变串联重复数标记(VNRT);基于PCR技术的分子标记:随机扩增多态性 DNA(RAPD)、酶切扩增多态性(CAPS)、扩增片段长度多态性(AFLP)、微卫星DNA(SSR)和DNA单链构象多态性(SSCP);以及新兴的第3代分子标记,即基于DNA芯片技术的分子标记:单核苷酸多态性(SNP)等。分别阐述了它们的原理、方法步骤与优缺点、应用注意事项和适用范围,同时概述了它们在生物学研究中的应用和进展。     

藏鸡微卫星文库的构建与微卫星标记筛选

通过磁珠富集法构建了藏鸡基因组微卫星富集文库,分离微卫星序列并对其进行分析.将藏鸡基因组DNA经Sau3AI酶切后纯化回收,连接特定接头.用生物素标记的(CA)12探针与藏鸡基因组酶切回收片段杂交,捕获200～900 bp片段,随后将获得的片段连接到pMD 18-T载体上,转化至JM109中,成功构建藏鸡微卫星富集文库.从1200个转化子中获得了353个阳性克隆,随机挑选53个测序,根据测序结果成功设计了18对藏鸡微卫星引物,最终筛选出6个具有多态性的微卫星标记,其PIC值均大于0.5,同时可以用于研究藏鸡遗传多样性.实验结果表明磁珠富集法能够有效提高分离微卫星标记的效率.     

DNA分析与扩增

930806 利用引物接头介导对结合在磁性同相上的DNA徽 PCR扩增进行檀物启动手的克隆和直接定序[荚]/Espelund,M.…,BioTechniques.一1992,13(1).一74～81[译自DBA,1992,儿(17),92—09541] 目标DNA是一已知序列的旁侧片段。通过引物一接头(adaptor)与一个经限制性酶切的基因f~[DNA相连,而免去逆向PCR所需的环化步骤。扩增的第一步即有专一性。用一种生物素标记的DNA引物(与已知的侧翼序列互补)进行线性PCR,可产生单链产物,用抗生蛋白链菌素包埋的磁珠可将之纯化。在第一步去除染色体组DNA后,进行两轮指数PCR,先用adaptor一引物…     

利用AFLP技术分析丹顶鹤的亲缘关系

建立了丹顶鹤(Grus japonensis)AFLP分析体系,经筛选,利用28对选择性扩增引物构建了5对丹顶鹤AFLP亲缘关系分析图谱,共得到1 114个扩增条带,其中多态性条带551条,多态性比例为49.5%。每个引物组合扩增的条带数为20～66条,其中,引物E4M1扩增的条带最多,为66条;引物E6M1扩增的条带数最少,为20条。经统计分析,计算了各样品间的相似性系数在0.71～0.88之间,得到5对丹顶鹤的遗传距离,并构建了UPGMA聚类图,结果1号与2号、3号与4号鹤的亲缘关系较近,其余3对鹤(自然配对)亲缘关系较远。表明丹顶鹤具有识别亲缘关系的行为机制,丰富了丹顶鹤繁殖行为机制的研究内容,并为深入研究建立合理的散养丹顶鹤繁育体系提出了建议。     

应用植物形态学和AFLP分子标记鉴别陕西漆树品种

应用植物形态学和AFLP分子标记,对陕西8个漆树栽培品种和6个野生居群进行了鉴别.结果表明:从26个形态性状中筛选出3个主成分,其中:第1主成分指标7个(第5小叶长/宽、花瓣长、花瓣宽、花丝长、花丝直径、花药长和宽)贡献率为30.383%;第2主成分指标5个(小叶数、复叶长、复叶柄长、第5小叶叶柄长、顶端小叶叶柄长)贡献率为19.321%;第3主成分指标2个(第5小叶顶角角度、顶端小叶顶角角度)贡献率为13.777%.筛选的8对AFLP引物组合,均可将漆树14个样品完全区分开.植物形态学和AFLP分子标记相结合,不仅可用于漆树不同品种及野生居群间的鉴别,而且可反映其相互间的亲缘关系.     

二色胡枝子遗传多样性AFLP分析

利用AFLP对二色胡枝子14个居群的161个个体的遗传多样性进行分析,5对引物共扩增出253条带,多态带百分率（P）为96.8%,二色胡枝子种群的平均位点等位基因数（Ao）为1.968,平均有效等位基因数（Ae）为1.643,Nei’s基因多样性指数（H）为0.369,Shannon信息指数（I）为0.544。14个种源的平均多态性条带数为159条,平均多态带百分率为62.9%,平均Nei’s基因多样性指数为0.257,I＝0.373。二色胡枝子遗传多样性的76.68%分布于种源内（Φst＝0.233 2）,各种源间的差异显著。聚类结果表明,二色胡枝14个种源可划分为三个大类,居群的遗传多样性参数与其地理、生态因子均不显著相关,遗传多样性无明显地域分布格局。     

利用AFLP技术鉴定凤凰单丛古茶树种质资源

本文采用AFLP技术对34个凤凰单丛古茶树资源进行了种质鉴定分析.结果显示,筛选出多态性较高的5对引物中,引物组合E41M42、E41M39和E41M33可鉴别出供试的全部资源,鉴别效率为100%;有23份资源具有特异带,占供试材料的67.6%.由此研究表明,AFLP技术可以通过特异带、特异的谱带类型、不同引物提供谱带的组合将风凰单丛古茶树资源区分开来,这对保护凤凰单丛古茶树资源的育种产权、登录新品种、鉴定和检测其种子与苗木的真实性和纯度具有重要的现实意义.     

扩增片段长度多态性技术及其在植物研究中的应用

详述了扩增片长度多态性技术（ＡＦＬＰ）的原理及在植物研究中的应用,并探讨了此项技术在植物检疫中应用的可通用性和在实验操作中应注意的一些问题。     

利用AFLP标记鉴定小豆种质遗传多样性

利用11对AFLP引物对106份小豆种质的基因组DNA进行扩增,共扩增出603条清晰可辨的带型,其中208条具有多态性,比例为34.5%,平均每对引物扩增出18.9条多态性带.基于AFLP标记,把106份小豆种质聚类划分为4个组群,该组群的划分与小豆的生态地域性存在一定的相关性.     

濒危植物毛柄小勾儿茶片断化居群的遗传多样性

采用扩增片段长度多态性(AFLP)标记对我国特有的濒危植物毛柄小勾儿茶(Berchemiella wilsonii var. pubipetiolata)现存于浙江和安徽的4个片断化居群中的89株个体进行了遗传多样性和遗传结构的研究。结果表明,与其它木本濒危植物相比,毛柄小勾儿茶具有与它们相当的遗传多样性,8对选择扩增引物共扩增出122条清晰的条带,居群的平均多态位点百分率为P_p=26.4%,其中马家河居群最高(29.5%)而湍口居群最低(23.8%),居群的平均基因多样度为H_ep=0.162 8(0.140 5~0.172 4);而在物种水平上的遗传多样性为P_s=36.9%, H_es=0.202 4。居群间的遗传分化系数F_ST=0.193 9,表明居群间有显著的遗传分化,进一步利用AMOVA软件对遗传变异进行等级剖分发现:24.88%的遗传变异存在于地理宗间(浙江地理宗和安徽地理宗),14.71%的遗传变异存在于居群间,60.42%存在于居群内。该研究结果表明,由于人为干扰引起的生境片断化和居群减小导致了毛柄小勾儿茶居群的遗传多样性丧失和遗传分化,并对毛柄小勾儿茶的生存造成潜在威胁。该文还就保育策略进行了讨论。     

鼠尾草属部分物种AFLP指纹图谱构建及遗传多样性分析

为了建立适用于鼠尾草属植物的AFLP技术体系,并对鼠尾草属部分物种遗传多样性进行分析。作者经筛选得到24对有效AFLP引物组合,共检测1616个有效扩增位点;其中22对AFLP引物组合针对不同材料可检测到特异性扩增位点,每对引物检测强度从1到16个位点不等;依据AFLP数据计算的22个鼠尾草属植物材料间231个配对遗传相似系数介于0.5677～0.9898,显示了丰富的遗传多样性;系统树显示AFLP分析可以将11个鼠尾草属植物准确区分,其中种内不同居群的材料可有效聚为亚组,说明本文所构建的AFLP技术体系能够有效应用于鼠尾草属植物种间及种内鉴定、遗传多样性分析及系统发育研究中。     

黄瓜霜霉病抗性相关基因的AFLP标记

运用AFLP技术,采用集群分析法研究与黄瓜霜霉病抗性基因相关的分子标记.结果表明,在F2群体中E25M63-103标记与霜霉病病情指数的相关系数(0.337)和回归分析的F值(20.98)都达到了极显著水平.用E25M63-103标记对国内外的其它27份黄瓜材料进行检测,该标记与霜霉病病情指数的相关系数为0.555,也达到极显著相关水平,进一步证明该标记与控制黄瓜霜霉病感病的相关基因是连锁的.E25M63-103片段长度为103 bp,通过BLAST查询,该片段的同源性较小,表明E25M63-103标记可能是黄瓜基因组特有的一段DNA序列.     

红豆杉种质资源遗传多样性的AFLP分析

目的：通过对5份红豆杉种质资源的AFLP分析,探求各种质间的遗传多样性。方法：采用扩增片段长度多态性（AFLP）标记,在DNA水平上进行遗传多样性研究,筛选了32对选择性扩增引物,将扩增出的条带作为原始矩阵,用NTSYS-PC软件计算并分析了红豆杉种质间的相似度,构建了遗传系统进化树。结果：（1）SDS法提取的红豆杉基因组DNA质量较佳,能够满足AFLP分析的要求;（2）从32对选择性扩增引物中,筛选出10对多态性较强、带型较好、分辨率较高的组合;（3）构建了红豆杉AFLP指纹图谱,将5个红豆杉种质全部区分开来;（4）通过构建进化树,把5个种质分成3类。结论：红豆杉种质资源有丰富的遗传多样性。