组蛋白乙酰转移酶PCAF在原核细胞的表达及其生物学活性检测

p300/CBP相关因子（p300/CBPassociated factor,PCAF）是真核细胞内一种重要的组蛋白乙酰转移酶,它主要通过催化核心组蛋白的乙酰化,促进特定基因的转录,参与细胞内多种生物学过程。国内目前尚没有制备出具有生物学活性的组蛋白乙酰转移酶PCAF的报道。为此, PCAF全长cDNA被克隆入原核表达载体pGEX-5X-1,通过对诱导条件进行优化,实现了PCAF在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中的高效可溶性表达并进行了亲和纯化。利用体外乙酰转移酶活性分析实验,检测到所表达的GST-PCAF融合蛋白能够使组蛋白H3发生乙酰化。这种具有生物学活性的PCAF蛋白的成功制备为进一步研究PCAF的转录调控功能以及它与其它蛋白间的相互作用奠定了基础。     

p300/CBP及其相关因子PCAF与转录调控

p300/CBP及相关因子PCAF具有乙酰转移酶活性,能通过乙酰化组蛋白和非组蛋白的方式参与基因的转录调控.同时,它们能在转录因子和基本转录复合物之间起到桥梁作用,而且也能为整合多种转录因子提供支架,是一种典型的转录辅激活子. p300/CBP与细胞周期调控、细胞凋亡以及癌症的发生等过程之间有着直接的联系。本文概括了p300/CBP与PCAF的基本特性,并简要介绍它们与其他蛋白之间的相互作用,特别是E1A的最新研究进展。     

乳腺癌细胞中PCAF/WSTF/MOF复合物调控H3K9ac和H4K16ac

为了研究WSTF调控Ras相关乳腺癌细胞特性的机制。研究采用Western Blot检测WSTF磷酸化和组蛋白修饰水平;经GST pull-down验证WSTF与PCAF、MOF之间的相互作用,采用乙酰化酶活性实验验证PCAF和MOF酶活性;经Ch IP、Real-time PCR检测基因表达,并采用体内成瘤实验验证细胞成瘤能力。研究发现WSTF与PCAF、MOF之间存在相互作用。Ras通路激活后,WSTF磷酸化水平上调,使其与PCAF的结合增强的同时与MOF的结合减弱。这一变化引起PCAF的乙酰化酶活性上调而MOF的酶活性下调,导致H3K9ac上调和H4K16ac下调。组蛋白修饰的变化引起通路下游肿瘤相关基因表达发生改变,增强细胞成瘤能力。综上,WSTF蛋白通过调节与PCAF和MOF的相互作用,影响下游H3K9ac和H4K16ac水平及肿瘤相关基因表达,调控乳腺癌细胞成瘤能力。     

BRD7结构功能域Bromodomain的研究以及一个新的BRD7交互作用蛋白的鉴定

溴区包含蛋白7(BRD7)是采用cDNA代表性差异分析方法克隆的一个新基因.研究证实了BRD7能够与乙酰化的组蛋白3结合,其识别位点在组蛋白3的14位氨基酸;并且证实了溴区结构域(Bromodomain)缺失型的BRD7突变体失去了与乙酰化组蛋白3的结合能力.Bromodomain是在进化上高度保守的功能结构域,该结构域在空间构象上具有鲜明的特征:包括4个左手、呈反向平行排列的“螺旋(αz,αA,αB,αC)”以及2个“连结环”(ZAloop,BCloop).通过生物信息学等综合分析,预测BRD7可能具有上述特征.依据上述分析结果,构建了BRD7的Bromodomain相关缺失突变体,通过肽段结合实验分析上述突变体与乙酰化组蛋白3结合的能力.结果表明,ZAloop与BCloop的完整性对于BRD7结合乙酰化的组蛋白3有着重要的意义.同时通过免疫荧光分析,证实了ZAloop与BCloop的完整性能够影响BRD7的亚细胞定位.最后,证实了BRD7与CBP可能存在交互作用.CBP不仅具有乙酰化转移酶活性(HATs),能够对组蛋白末端进行乙酰化修饰,并且作为一种重要的细胞转录因子广泛参与细胞的各种生物学活动.     

NPAT分子的调控机制

正常的细胞周期进程需要对组蛋白的合成转录进行精确调控。NPAT(nuclear protein ataxia-telangiectasia)蛋白由cyclin E/CDK2(cyclin E/cyclin dependent kinase 2)激活,是调控组蛋白转录和细胞周期的重要分子。NPAT定位于细胞核内的特殊结构组蛋白基座体(histone locus body,HLB),这一定位与其功能密切相关。近期研究揭示了一系列与NPAT具有相互作用的蛋白分子,这些蛋白分子通过不同的方式对NPAT的功能及其细胞内定位进行调控。该文对近些年来NPAT在组蛋白转录调控和细胞周期中的作用以及NPAT的调控机制方面的研究进行综述。     

重组p300组蛋白乙酰转移酶结构域的表达及应用

组蛋白乙酰化修饰是基因起始转录的关键步骤. p300等组蛋白乙酰转移酶（HATs）催化组蛋白和非组蛋白的乙酰化. HATs具有多种细胞功能,而且乙酰化对底物蛋白的功能改变也具有重要功能. 组蛋白乙酰转移酶p300可乙酰化多种细胞内蛋白,某些病毒蛋白与p300有相互作用并促进病毒复制. 因此, p300是细胞内具有广泛功能的转录激活因子. 组蛋白乙酰转移酶结构域（HAT区）是p300乙酰化酶活性的最小中心功能域,在p300乙酰化底物中具有重要功能. 本文重组表达了对应p300 HAT区的GST-p300 HAT蛋白,对其乙酰化酶的活性进行检测. 结果证实,p300 HAT蛋白在体外可高效乙酰化组蛋白H3. 随后,对体外乙酰化反应的条件进行优化. 总之,本文构建了一种简单高效、非放射性体外乙酰化体系,适用于对潜在底物蛋白的乙酰化水平和机制进行分析,以及乙酰化蛋白的相关功能的研究.     

小鼠Myf5真核表达载体的构建及其在细胞中的定位

目的：获得小鼠生肌调节因子Myf5基因并构建pEYFP-C1真核表达载体,观察Myf5在小鼠C3H10T1/2细胞中的定位。方法：利用PCR获得Myf5基因克隆到pEYFP-C1载体中,利用脂质体将构建的表达载体转染C3H10T1/2细胞,荧光观察融合蛋白的表达。结果：从小鼠cDNA文库中得到760bp的myf5的CDS序列后,重组到pEYFP-C1载体中并转染C3H10T1/2细胞,荧光显示Myf5蛋白定位在细胞核中。结论：Myf5载体成功构建并在小鼠C3H10T1/2细胞表达,证明了Myf5蛋白定位于细胞核,为进一步研究Myf5与其他蛋白的相互作用奠定了基础。     

人乳头瘤病毒次要衣壳蛋白L2核定位

在人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)次要衣壳蛋白L2的N端和C端,有大量带正电荷的氨基酸残基组成核定位信号(nuclear localization signal,NLS)。细胞的核结构域10(nuclear domain 10,ND10)是细胞周期和病毒生活周期的重要调节者。L2定位到ND10的过程不仅会受到早幼粒细胞白血病蛋白(promyleocytic leukaemia protein,PML)、死亡结构域相关蛋白(deathdomain-associated protein,Daxx)、Sp100核抗原(Sp100 nuclear antigen)等细胞蛋白的影响,也会与L1在ND10发生相互作用。在HPV感染和组装过程中,L2的核定位信号有着重要作用。     

Daxx在转录调控及凋亡中的作用

Daxx是细胞核内的一种新型转录调控蛋白,它与早幼粒细胞性白血病蛋白（promyelocytic leukemiaprotein,PML）在体内相互作用共定位PML癌基因结构域（PML omcogenic domains,PODs）。人Daxx(human Daxx ,hDaxx)和PML作为PODs主要蛋白质,关系到PODs球状结构的形成、维持及其它蛋白质在该区的定位。HDaxx能结合Fas死亡结构域（death domain,DD）,激活Jun氨基端激酶通路诱导细胞凋亡。HDaxx与PML、Fas等多种蛋白质相互作用,与细胞周期调节及凋亡相关,这将为某些疾病发病机理研究提供一定的理论与实验基础。     

拟南芥WRKY8转录因子相关基因VQ10和VQ11受多种非生物逆境胁迫诱导表达

拟南芥WRKY8转录因子能与VQ蛋白家族成员VQ9相互作用共同调控植物的耐盐反应。本研究中进一步发现,WRKY8能与多个VQ蛋白在酵母细胞中相互作用,其中VQ5、VQ10、VQ11、VQ16、VQ20、VQ23及VQ32等与WRKY8之间有较强的相互作用,而VQ13、VQ14、VQ17、VQ21、VQ25及VQ31等与WRKY8之间的相互作用相对较弱。基因表达分析表明,WRKY8相关的VQ10、VQ11及VQ23基因受ABA诱导明显,其中VQ23基因受ABA诱导最高达241倍,表明它们可能参与调控植物体内的ABA信号传导途径。此外,VQ10、VQ11及VQ23基因的表达还受高盐、高渗透压、低温或高温胁迫的诱导。亚细胞定位实验表明,VQ10蛋白特异性的定位于细胞核,而VQ11蛋白定位于细胞核和细胞质。研究结果表明,WRKY8转录因子相关的VQ10、VQ11及VQ23蛋白可能参与调控植物多种非生物逆境反应。     

Overexpression of promyelocytic leukemia protein precludes the dispersal of ND10 structures and has no effect on accumulation of infectious herpes simplex virus 1 or its proteins

A key early event in the replication of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is the localization of infected-cell protein no. 0 (ICP0) in nuclear structures knows as ND10 or promyelocytic leukemia oncogenic domains (PODs). This is followed by dispersal of ND10 constituents such as the promyelocytic leukemia protein (PML), CREB-binding protein (CBP), and Daxx. Numerous experiments have shown that this dispersal is mediated by ICP0. PML is thought to be the organizing structural component of ND10. To determine whether the virus targets PML because it is inimical to viral replication, telomerase-immortalized human foreskin fibroblasts and HEp-2 cells were transduced with wild-type baculovirus or a baculovirus expressing the M(r) 69,000 form of PML. The transduced cultures were examined for expression and localization of PML in mock-infected and HSV-1-infected cells. The results obtained from studies of cells overexpressing PML were as follows. (i) Transduced cells accumulate large amounts of unmodified and SUMO-I-modified PML. (ii) Mock-infected cells exhibited enlarged ND10 structures containing CBP and Daxx in addition to PML. (iii) In infected cells, ICP0 colocalized with PML in ND10 early in infection, but the two proteins did not overlap or were juxtaposed in orderly structures. (iv) The enlarged ND10 structures remained intact at least until 12 h after infection and retained CBP and Daxx in addition to PML. (v) Overexpression of PML had no effect on the accumulation of viral proteins representative of alpha, beta, or gamma groups and had no effect on the accumulation of infectious virus in cells infected with wild-type virus or a mutant (R7910) from which the alpha 0 genes had been deleted. These results indicate the following: (i) PML overexpressed in transduced cells cannot be differentiated from endogenous PML with respect to sumoylation and localization in ND10 structures. (ii) PML does not affect viral replication or the changes in the localization of ICP0 through infection. (iii) Disaggregation of ND10 structures is not an obligatory event essential for viral replication.