利用Red系统快速敲除家蚕核型多角体病毒orf60基因

用Red重组系统和最近构建的家蚕核型多角体病毒（BmNPV）bacmid在大肠杆菌BW25113中快速地敲除BmNPV orf60基因。从大肠杆菌BmDH10Bac中提取BmNPV bacmid,将其电转化到含有质粒pKD46（能表达Red重组酶）的大肠杆菌菌株BW25113中,获得了可用于BmNPV基因打靶的菌株BW25113-Bac。设计一对长63bp的引物（5′端为orf60基因的左右同源臂,长45bp;3′端长18bp,为氯霉素抗性基因（cat）的首尾序列）,以pKD3质粒（含cat）为模板,PCR扩增携带orf60左右同源臂的cat,即打靶线性化片段。将该线性化片段电转入BW25113-Bac菌株,在Red重组酶的作用下,线性化片段与BmNPV bacmid中的orf60基因发生同源重组。设计3对特异引物,用PCR方法证明cat成功地替换了BmNPV orf60基因。重组bacmid DNA转染BmN细胞后,Western blot分析未检测到orf60基因的表达。     

利用Red系统快速敲除家蚕核型多角体病毒orf60基因

用Red重组系统和最近构建的家蚕核型多角体病毒（BmNPV）bacmid在大肠杆菌BW25113中快速地敲除BmNPV orf60基因。从大肠杆菌BmDH10Bac中提取BmNPV bacmid,将其电转化到含有质粒pKD46（能表达Red重组酶）的大肠杆菌菌株BW25113中,获得了可用于BmNPV基因打靶的菌株BW25113-Bac。设计一对长63bp的引物（5′端为orf60基因的左右同源臂,长45bp;3′端长18bp,为氯霉素抗性基因（cat）的首尾序列）,以pKD3质粒（含cat）为模板,PCR扩增携带orf60左右同源臂的cat,即打靶线性化片段。将该线性化片段电转入BW25113-Bac菌株,在Red重组酶的作用下,线性化片段与BmNPV bacmid中的orf60基因发生同源重组。设计3对特异引物,用PCR方法证明cat成功地替换了BmNPV orf60基因。重组bacmid DNA转染BmN细胞后,Western blot分析未检测到orf60基因的表达。     

利用λRed重组系统敲除伤寒沙门氏菌rfaH基因

目的：利用λRed重组系统敲除伤寒沙门氏菌的rfaH基因。方法：以伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi Ty2,S.ty2）基因组为模板扩增得到的同源臂,与两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因片段共同构建同源重组载体;以重组载体为模板扩增打靶片段,将其转化S.ty2;在抗生素压力和λRed重组系统帮助下,打靶片段和菌体基因组发生同源重组,通过卡那抗性筛选得到带有抗性标记的重组菌;转入重组酶表达质粒pCP20以去除抗性标记,得到保留单一FRT位点的突变菌株;通过PCR鉴定重组菌,并经透射电子显微镜分析表型。结果：在S.ty2中敲除了rfaH基因,经PCR扩增和序列测定正确;初步的表型分析表明突变体的鞭毛合成显著减少。结论：获得了S.ty2突变株,为将沙门氏菌进一步减毒成为疫苗表达载体奠定了基础。     

利用λRed重组系统敲除鼠伤寒沙门氏菌sopB基因

利用λRed重组系统敲除鼠伤寒沙门氏菌LT2的(Salmonella enterica serovar typhimurium LT2,S.typhimurium LT2)sopB基因。以pKD4质粒为模板,扩增得到中间带有卡那霉素抗性基因且两端各带有59 bp分别与sopB基因上下游序列同源的同源打靶片段,将其转化至表达Red重组酶的S.typhimurium LT2感受态细胞中;在抗生素压力和λRed重组系统帮助下,同源片段和菌体sopB基因发生同源重组,通过卡那霉素筛选得到带有抗性标记的阳性重组菌;转入重组酶表达质粒pCP20以除去抗性标记,得到保留单一FRT位点的突变菌株;利用PCR技术鉴定重组菌,并通过检测沙门氏菌效应蛋白SopB的分泌以及沙门氏菌感染HeLa细胞后pAKT的激活反应来鉴定sopB基因是否被敲除。构建的ΔsopB突变菌株失去了分泌SopB蛋白的能力,且不能够像野生型菌株那样在感染HeLa细胞的过程中激活pAkt。本研究获得了S.typhimurium LT2的sopB基因缺失突变株,为沙门氏菌感染宿主过程中SopB的功能研究提供工具,同时也为进一步探索其他类型细菌的基因敲除提供了线索。     

Red重组系统在痢疾杆菌基因敲除中的应用研究

利用λ噬菌体的Red系统在细菌中进行基因敲除的技术,最近发展较快,但多在大肠杆菌中进行。以alkA、wcaJ、yphF和dam 4个基因为例,分别在大肠杆菌和痢疾杆菌中利用Red系统进行基因敲除。对于大肠杆菌,除dam基因外,其余3个基因均能被有效敲除,而在痢疾杆菌中只能敲除一个alkA基因。结果表明,为使该系统能有效地应用于痢疾杆菌和其它细菌,还需对该系统进行改进。     

Red重组系统及在微生物基因敲除中的应用

在完成了对各种微生物基因组的测序以后,功能基因学的研究变得尤为重要。研究基因功能最直接的方法便是将待研究的基因失活。最初构建基因突变体是采用大肠杆菌的RecA系统,但是RecA重组系统操作复杂,重组效率低。最近建立了Red重组系统,该系统由3个蛋白组成：α蛋白(即λ核酸外切酶),β蛋白,Gam蛋白。应用Red系统进行基因敲除,可以直接利用线性打靶DNA,两侧同源臂长度在35~60 bp即可发生同源重组,且重组效率高。 Abstract:Since many DNA-sequencing projects of varied microorganisms have been completed,studies on their functional genomics become more important.Inactivation of an interesting gene is a direct method to characterize its function.Though the Esherichia coli RecA recombination system can be used to produce gene mutants,it needs a complex manipulation process.Furthermore,its efficiency is very low.Recently a Red recombination system was developed.This recombination system consists of three proteins:α protein（λ exonuclease）,β protein and Gam protein.In this system,the linear targeting DNA which contains a selectable marker flanked with a homologous region as short as only 35~60 bp can be directly targeted for gene knock-out with a higher efficiency.     

利用Red同源重组系统进行牛β酪蛋白基因敲除

利用EL350基因工程菌进行同源重组, 成功进行基因敲除已有报道, 但利用该系统进行乳腺生物反应器质粒构建的研究却未见报道。实验采用含有完整的牛b 酪蛋白基因的CSN2质粒作为基因打靶的载体, 设计不同的同源臂, 成功地敲除了b 酪蛋白基因的编码区。并且同时利用同源重组技术对敲除不同大小的DNA片段的效率进行了研究。为进一步利用CSN2质粒两端的调控序列, 插入新的基因, 研究其表达功能, 或者进行乳腺生物反应器的研究奠定了基础。     

BAI1基因敲除打靶载体的快速构建

BAI1(脑血管生成抑制因子1)因其具有抑制血管生成的作用而得名,研究表明肿瘤的发生可能与BAI1的低表达有关.为了进一步探索BAI1的作用机制,运用改良的Red重组系统和低拷贝中间载体,利用50 bp的同源重组序列直接从BAC载体中克隆长片段的小鼠基因组序列;将得到的基因组序列再次通过重组和改造,构建了BAI1基因的完全敲除并带有报告基因的打靶载体,为后续的构建BAI1基因敲除小鼠模型、在动物体内研究基因功能奠定了基础.     

GPR126条件性基因敲除载体的快速构建

基因敲除小鼠模型是在动物体内研究基因功能的重要和可靠的手段之一,而构建用于同源重组的基因敲除载体是构建基因敲除小鼠模型的关键一步.条件性基因敲除技术将针对靶基因的修饰作用限制在小鼠的特定发育时期或特定类型的组织细胞中,通过加入具有位点特异性的重组系统,该修饰作用在时间和空间上均处于可调控的状态;条件性基因敲除技术既可以避免某些具有重要功能基因的敲除所带来的早期胚胎致死问题,还可用于精确分析某些多效基因在不同组织或不同发育阶段的特定功能差异.通过合理利用改良的Red重组系统,将两个LoxP位点快速准确地插入到了目标位置,实现了GPR126条件性基因敲除载体的快速构建,为后续的构建GPR126基因敲除小鼠模型、在动物体内研究基因的功能奠定了基础.     

Red重组技术研究进展

主要从Red系统组成元件、作用机理、重组策略以及先进性和发展前景四个方面综述了利用Red 重组系统敲除或替换细菌染色体目的基因的方法。首先简要介绍了传统的细菌染色体重组技术,指出了其中的缺陷。然后提出了Red重组技术的定义：利用噬菌体Red系统介导来实现外源线性DNA片断与细菌染色体的靶基因进行同源重组的方法,外源线性DNA通常是PCR产物、寡核苷酸片断等,在它们的两翼各含有与染色体靶基因两翼同源的序列40~60bp。这种Red重组技术省去了体外DNA酶切和连接等步骤,使细菌染色体靶基因的敲除与替换操作相对简单,逐渐成为基因功能探索以及新菌株构建的有力手段。     

Molecular Dissection of Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus orf8 Gene

Viruses including baculoviruses are obligatory parasites, as their genomes do not encode all the proteins required for replication. Therefore, viruses have evolved to exploit the behavior and the physiology of their hosts and often eoevolved with their hosts over millions of years. Recent comparative analyses of complete genome sequences of baculoviruses revealed the patterns of gene acquisitions and losses that have occurred during baculovirus evolution. In addition, knowledge of virus genes has also provided understanding of the mechanism of baculovirus infection including replication, species-specific virulence and host range. The Bm8 gene of Bombyx mori nucleopolyhedrovirus (NPV) and its homologues are found only in group I NPV genomes. The Autographa californica NPV Acl6 gene is a homologue of Bm8 and, encodes a viral structural protein. It has been shown that Bm8/Ac 16 interacts with baculoviral and cellular proteins. Bm8/Ac 16 interacts with baculoviral IE1 that is facilitated by coiled coil domains, and the interaction with IE1 is important for Bin8 function. Ac16 also forms a complex with viral FP25 and cellular actin and associates with membranes via palmitoylation. These data suggested that this gene family encodes a multifunctional protein that accomplishes specific needs of group INPVs.     

零背景转座技术高效构建重组家蚕杆状病毒表达系统

摘要：【目的】获得零转座背景的基于家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus, BmNPV) Bac-to-Bac 系统,为高效经济构建重组BmNPV在家蚕体内表达目标蛋白提供新系统。【方法】利用R6Kγ作为复制子构建新的条件复制型杆状病毒转移载体pRADM,同时封闭BmNPV-Bacmid（BmBacmid）宿主菌（Escherichia coli BmDH10Bac）的Tn7转座受体位点attTn7,获得新的封闭型宿主菌E.coli BmDH10Bac△Tn7。【结果】由于pRADM无法在宿主菌E.coli BmDH10Bac中复制,封闭了attTn7位点的宿主菌也不能再和BmBacmid竞争与转移载体的重组,显著提高了转座效率。封闭宿主菌的attTn7位点,能使转座效率提高近4倍,使用条件复制型转座载体pRADM时,转座效率提高近10倍。而用pRADM转座E.coli BmDH10Bac△Tn7时,转座阳性率为100％。避免了获得重组病毒DNA的鉴定程序,缩短了获得重组蛋白所需时间。用携带红色荧光蛋白基因DsRed的重组质粒pRADM-Red转座E.coli BmDH10Bac△Tn7,获得重组BmBacmid转染BmN细胞,红色荧光蛋白在细胞中得到高效表达。【结论】结果表明pRADM和E.coli BmDH10Bac△Tn7是一种零背景高效构建重组BmNPV的新系统。     

Propagation of Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus in nonpermissive insect cell lines

This study addresses the susceptibility of Spodoptera frugiperda (Sf9 and Sf21), Trichoplusia ni (Hi5), and S. exigua (Se301) cells to the Bombyx mori nucleopolyhedrovirus (BmNPV). Although these cells have classically been considered nonpermissive to BmNPV, the cytopathic effect, an increase in viral yield, and viral DNA synthesis by BmNPV were observed in Sf9, Sf21, and Hi5 cells, but not in Se301 cells. Very late gene expression by BmNPV in these cell lines was also detected via beta-galactosidase expression under the control of the polyhedrin promoter. Sf9 cells were most susceptible to BmNPV in all respects, followed by Sf21 and Hi5 cells in decreasing order, while the Se301 cells evidenced no distinct viral replication. This particular difference in viral susceptibility in each of the cell lines can be utilized for our understanding of the mechanisms underlying the host specificity of NPVs.     

Genome of a Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus Strain Isolated from India

Bombyx mori nucleopolyhedrovirus (BmNPV), a member of the Baculoviridae, is a major pathogen of silkworm and has also been recently developed as an expression vector for heterologous gene expression in the silkworm larvae and pupae. To better understand the diversity of this important baculovirus, we sequenced the complete genome of the BmNPV strain isolated from India, where its host is available throughout the year due to its tropical climate. The genome of the Indian strain consists of 127,879 nucleotides, with a G+C content of 40.36%. There are 138 open reading frames (ORFs) encoding the predicted proteins of more than 50 amino acids. Genomic comparison of the Indian strain with 3 other reported BmNPV strains showed that the baculovirus repeat ORFs (bro) and homologous repeat regions (hr''s) are highly variable. These results suggest that the BmNPV strain heterogeneity is mainly caused by single-nucleotide polymorphisms (SNPs) and changes in the hr''s and bro genes.     

Autographa Californica Multiple Nucleopolyhedrovirus orf13 Is Required for Efficient Nuclear Egress of Nucleocapsids

Virologica Sinica - Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) orf13 (ac13) is a conserved gene in all sequenced alphabaculoviruses. However, its function in the viral life cycle...     

利用同源重组改变家蚕丝心蛋白重链基因

在家蚕丝心蛋白重链基因5‘和3‘端序列之间插入以绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）基因（gfp）与人工合成丝心蛋白样基因的融合基因,利用电穿孔方法导入蚕卵中,卵孵化、发育和结茧后,用紫外灯检查,在约5400个茧中有73个“亮茧”,茧蛋白在ELISA应中可以与GFP的多克隆抗体反应。“亮茧”对应的蚕蛾进行交配、制种。对其后代进行了基因鉴定,Southern杂交的结果表明,gfp基因和人工合成丝心蛋白样基因都存在于家蚕基因组DNA中且发生了预期的同源重组事件。上述结果说明“亮茧”这一表型能用于筛选转基因蚕,融合基因已通过同源重组进入家蚕基因组。     

家蚕核型多角体病毒广东株bro基因家族分析

对BmNPV广东株进行了空斑纯化,并对该基因组的bro基因家族进行克隆,获得4个bro基因序列(bro-a、bc、、d),与GenBank数据库中BmNPVbro基因序列及本实验室测定的重庆株的bro基因序列进行比较分析,结果表明广东株BmNPVbro基因存在插入及缺失,其氨基酸的改变主要发生在对应蛋白的N端部分;同时进行的bro基因的系统发生分析表明,广东株bro基因分别位于3个亚组中,广东株bro-d与日本T3、重庆CQ1株bro-d以及法国SC7株bro-Ⅲ属于亚组A,广东株bro-a、c与T3、CQ1株bro-a、c以及SC7株bro-Ⅱ属于亚组B,广东株bro-b与T3、CQ1株bro-b、e以及SC7株bro-Ⅰ属于亚组C,bro基因进化与地理位置的相关性不明显。根据bro基因在四个不同株系基因组中的位置特征,进一步支持了Kang等的观点:bro-d是BmNPV生存所必需的,bro-a和bro-c相互间功能互补。同时推测:SC7株的3个bro基因可能是BmNPVbro家族出现的最简约形式。