棒状杆菌灭活原生质体种间融合

原生质体融合技术越来越广泛地应用于遗传学基础理论和工业育种研究,且融合的方法不断改进。近来报道用灭活的亲株原生质体融合也能达到遗传重组:用链霉素灭活枯草芽孢杆菌原生质体、热灭活巨大芽孢杆菌原生     

棒状杆菌原生质体的形成、再生以及融合的初步探讨

Corynebacterium 属中的一些种是生产氨基酸的重要菌株。它们对蛋清I容菌酶和其他几种酶均不敏感。作者用0.4—0.8u／ml青霉素G处理对数期菌令菌体,可明显增加对蛋清溶菌酶的敏感性。继而用0.5—1.0mg／ml的蛋清溶菌酶,于37℃,12—15小时保温,渗透压敏感细胞可达99％以上。在丁二酸钠高渗完全培养平皿上,原生质体再生率可达20％。C. pekinenseAS 1.563与C. crenutum 82原生质体融合率为3×10-4 每对原生质体。融合菌株不稳定呈现出不同程度的分离现象。对融合菌株发酵产物——氨基酸进行了纸层析,70％的融合株同时产生两亲株所产的氨基酸,10％菌株不产生两亲株所产的氨基酸。通过光学显微镜和电镜技术,观察了原生质体的形成、再生和原生质体聚集现象。     

双歧杆菌原生质体的制备与回复研究

进行了双歧杆菌原生质体的制备与回复相关技术研究 ,为其基因操作及相关研究提供技术基础。采用浓度分别为 1 ,5 ,1 0mg/LMutanolysin(变溶菌素 )对长双歧杆菌进行脱壁处理 ,以探讨其原生质体形成与时间和酶浓度的关系 ,然后选用较适宜的酶浓度 ( 5mg/LMutanolysin)制备其原生质体 ,并将其倾入自制的双层再生培养基上 ,观察其在不同环境条件下培养时的回复生长情况。结果表明 ,长双歧杆菌的细胞壁对Mu tanolysin较为敏感 ,用浓度为 5mg/L的Mutanolysin处理长双歧杆菌 40min ,在普通光学显微镜下即可见90 %的原生质体形成 ,当Mutanolysin浓度为 1 0mg/L时 ,只需 2 5min其原生质体形成率就达此值。制备的长双歧杆菌原生质体倾入自制的双层再生培养基中 ,在厌氧条件下能很好地回复生长。     

保加利亚乳杆菌原生质体的制备与回复研究

目的:通过对保加利亚乳杆菌的原生质体的制备和回复的方法学探讨,为乳杆菌的基因操作和其相关研究提供技术思路和实验条件.方法:用酶浓度分别为1 μg/ml、4 μg/ml、10μg/ml Mutanolysin(变溶菌素)对保加利亚乳杆菌进行处理,脱去细胞壁以探讨其原生质体形成与时间和酶浓度的关系;并选用较为适宜的酶浓度制备其原生质体,在自制的双层再生培养基上观察其原生质体在普通培养、CO2培养、厌氧培养时的回复生长情况.结果:保加利亚乳杆菌对Mutanolysin较敏感,酶浓度为1 μg/ml时只需40min大部分菌体形成原生质体.经1μg/ml Mutanolysin处理后制得的保加利亚乳杆菌原生质体倾入自制的双层再生培养基中,置于CO2和厌氧环境条件下培养能很好的回复生长.结论:本文的研究为乳杆菌的基因工程方面的研究提供了相关的技术条件和实验基础.     

产琥珀酸放线杆菌的原生质体制备与再生

基因组重组技术是一项重要的菌种改造技术,原生质体制备和再生是进行基因组重组的前提和基础。目前少有关于产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)CGMCC2650原生质体研究的报道。为了优化该菌的原生质体制备和再生条件,及利用基因组重组技术构建优良菌种提供参考,研究了甘氨酸预处理,菌龄,酶浓度,作用时间,温度对产琥珀酸放线杆菌原生质体制备和再生的影响,并考察了不同渗透压稳定剂对其再生的影响。结果表明,菌体在添加了0.6mg/ml甘氨酸的TSB培养基中培养5h后收集,用SMM稀释到OD660=1.0,用0.025mg/ml溶菌酶在37℃下酶解45min制备原生质体,将原生质体涂布于含0.3mol/L蔗糖的再生培养基中,再生率最大,达到40.9%。确定了产琥珀酸放线杆菌原生质体制备和再生的最佳条件,所用的原生质体制备的方法对琥珀酸的产生没有影响,这为进一步开展该菌的原生质体诱变及基因组重组等研究奠定了基础。     

棒状杆菌中质粒DNA的快速检测方法

在棒状杆菌质粒DNA快速检测中,比较了三种方法:强碱法、快裂法和我们设计的酶法。用强碱法抽提的质粒带很淡,快裂法其次,且不能区别两个分子量相近的质粒;而用酶法则显带清晰,且能很好地区分两个大小相近的质粒,分辨率高,认为在棒状杆菌质粒快速检测中是一种很好的方法。     

地衣芽孢杆菌原生质体电转化方法的研究

为了解决地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)工业菌株难以转化的问题,将原生质体制备、电穿孔和原生质体再生技术相结合,建立了一种地衣芽孢杆菌原生质体电击转化方法。在对菌体生长状态、溶菌酶作用时间、电转电压、渗透压保护剂等条件进行优化后,试验了将不同类型的表达载体,即游离型质粒p GJ103(3.3kb)和整合型质粒p AX01(9.3kb),分别转入两株地衣芽孢杆菌工业生产菌株B.licheniformis CICC 10181和B.licheniformis CICC 20204中。实验结果显示,对数生长期后期的菌体酶解40min后制备的地衣芽孢杆菌原生质体得率为96%,再生率达25%以上。原生质体与质粒DNA在最适电压0.6k V/mm下电击转化,并以0.5mol/L山梨醇或甘露醇作为渗透压保护剂进行再生培养后,最终游离型质粒的转化率可达0.88×102~1.1×102CFU/μg p GJ103,整合型质粒的转化率达到0.45×102~0.52×102CFU/μg p AX01。该方法为地衣芽孢杆菌野生工业菌株的遗传改造提供了一种新的、高效的转化手段。     

棒状杆菌发酵基因工程研究进展

传统的育种方法由于本身的缺陷受到了基因工程育种的强有力挑战,基因工程技术应用于发酵工业创立了全新的发酵基因工程。传统发酵菌种棒状杆菌的分子生物学研究欣欣向荣,棒状杆菌的受体系统、载体系统以及ＤＮＡ转移技术都已取得长足进展。对棒状杆菌的分子遗传机制的阐明使得构建表达载体并表达目的基因成为现实。利用基因突变和基因重组技术选育优良的棒状杆菌发酵菌种,业已取得明显成效。     

鼠棒状杆菌PCR检测方法的建立及其应用

目的建立鼠棒状杆菌PCR检测方法并应用于临床样本检测。方法用脑心浸出液培养基复苏、培养鼠棒状杆菌（corynebacteriumkutscheri,C．kutscheri）并提取基因组DNA作模板;根据GenBank中C．kutsche6的16S基因序列设计合成引物,建立鼠棒状杆菌PCR检测方法并进行敏感性和特异性的评价;人工感染昆明鼠,建立小鼠棒状杆菌感染模型,采集肝脏和肾脏,提取DNA进行检测。结果成功建立了鼠棒状杆菌PCR检测方法,该方法可检测到100个阳性质粒;对小鼠沙门氏菌、肺炎链球菌和巴氏杆菌无交叉反应;全部8个人工感染样本全部检测为阳性。结论建立的鼠棒状杆菌PCR检测方法灵敏度高、特异性好,可作为鼠棒状杆菌感染的快速检测方法。     

不同方法生产的短棒状杆菌生物学活性比较

提高短棒状杆菌疫苗临床疗效,解决接种后局部硬结,发烧等不良副反应。在菌体菌苗的基础上,采用超声、破碎、离心、胰酶消化脱脂的方法提取细胞壁做脾激活抑瘤试验生物学检定。结果显示,纯化的短棒状杆菌细胞壁可使小鼠脾激活指数达到4.06。能抑制艾氏腹水瘤的生长,而菌体脾指数3.18。实验证实,纯化的短棒杆菌细胞壁菌苗的活性好于菌体菌苗。     

地衣芽孢杆菌原生质体的制备、再生及转化研究

目的：提高地衣芽孢杆菌原生质体的产量和形成率,为进一步提高原生质体转化率打下基础。方法：通过酶解法对地衣芽孢杆菌工业生产菌株Bacillus licheniformis303原生质体的制备及再生条件进行了研究。考察了菌体生长状态、溶菌酶浓度、处理时间、渗透压稳定剂和再生培养基等因素对地衣芽孢杆菌原生质体的制备及再生的影响。结果：对数生长后期的菌体,以SMMP作渗透压稳定剂,溶菌酶浓度为100mg/mL,37℃下酶解30min,原生质体生成量可达8×109个/mL;再生培养基选用含1mol/L琥珀酸钠的DM3时,再生率最高可达17%。在此条件下,采用PEG法将游离型质粒pHY-P43-secQ转化宿主菌B.lichenifor-mis303,转化率可达10~15 CFU/μg DNA。     

制备小麦叶肉原生质体方法的一点改进

我们对库姆斯等人制备小麦叶肉原生质体采用单子叶植物如小麦、大麦和玉米通用的刀片切割叶片(横切成大约0.5～1.0mm的切段)的方法(生物生产力和光合作用测定技术,科学出版社1986年,124页)作了一点改进,效果较好。兹介绍如下:将小麦幼苗叶片平放于玻璃板上(或手指夹着),用钟表尖头镊子沿着平行叶脉撕裂成细丝状。置显微镜下观察时,撕裂面的叶肉细胞均在细胞之间的中胶层分离,细胞壁完整无损。这     

谷氨酸棒状杆菌尿素传感器的研究

基于腺酶催化尿素分解产生氨,以氨气敏电极为基础电极,用含脲酶丰富的谷氨酸棒状杆菌研制成测定尿素的微生物传感器.在30℃、pH8.0、0.1mol/L磷酸盐缓冲液中,该传感器的线性范围为1.1×10^-4～1.4×10^-2mol/L,斜率为51.2mV/decade,检测下限为1.0×10^-5mol/L,寿命可达45d.考察了传感器响应初速和底物浓度之间的关系,测定了微生物膜中脲酶的表观米氏常数K_m及最大响应初速v_m.     

产生L-谷氨酸的棒状杆菌新种

从北京某食品厂的淀粉废浆水中分离出一株革兰氏染色阳性、无芽孢的产L-谷氨酸细菌。生物素是必需生长因素,硫胺素或某些氨基酸有促进生长的作用,能耐较高浓度的尿素,除由葡萄糖、果糖、甘露糖、麦芽糖、蔗糖及商藻糖产酸外,还能由肌醇、糊精及木糖产酸,但均不产气。通气培养在含葡萄糖和尿素或铵盐的适宜培养基中,能积累大量L一谷氨酸,经鉴定认为是一新种,定名为北京棒状杆菌A S 1.299(Corynebacterium pekinensen. Sp. A S 1.299)。