萼脊兰ACC氧化酶基因片段的克隆及其反义基因表达载体的构建

根据已报道的几种不同属的兰科植物ACO基因序列,设计并合成了一对特异引物,以萼脊兰的基因组DNA为模板,用PCR扩增方法克隆出萼脊兰ACO基因的部分片段,将其连接到pMD19-T质粒载体上进行测序.结果显示,该片段的长度为333 bp,序列和蝴蝶兰(Phalaenopsis hybrid)、卡特兰(Cattleya intermedia)、两棱蕾丽兰(Laelia anceps)的相应ACO片段的同源性分别达到达到99.7%、92.49%和92.19%;和大花蕙兰(Cymbidium hybrid)、石斛兰(Dendrobium crumenatum)的同源性分别是89.49%和89.19%.将此片段反向插入植物表达载体pBI221的CaMV35S启动子和NOS终止子之间,成功构建了萼脊兰ACO的反义基因植物表达载体pBI-antiACO.     

澳洲坚果MtMADS1-like基因的克隆与表达分析

MADS～box家族基因广泛分布于植物中,在植物花发育的整个阶段起着至关重要的作用.为了探索MADS-box基因在澳洲坚果花发育过程中的分子机理,本研究以澳洲坚果'695'为试材,采用RT-PCR及RACE技术克隆获得澳洲坚果MADS-box类转录因子基因cDNA全长,命名MtMADS1-like(GenBank登录号:MK491608).该基因全长967 bp,开放阅读框ORF长672 bp,编码223个氨基酸,5'-UTR和3'-UTR分别为58 bp和237 bp.序列分析表明,MtMADS1-like具有保守的MADS-box结构域(MADS-MEF2-like)和半保守的K-box结构域,属于Type Ⅱ型MADS-box家族基因.进化分析表明,MtMADS1-like与其他植物中MADS-box蛋白具有较高的同源性,且与猴面花(Erythranthe guttata)MADS-box家族中SVP254的同源性高达67.10％,亲缘关系最近.生物信息学分析表明MtMADS1-like属于不稳定的亲水性蛋白,不具备信号肽,属于非分泌蛋白,α-螺旋和无规则卷曲构成了二级结构的主要蛋白框架,三级结构中MADS-box结构域和K-box形成该蛋白的核心结构,并且作为转录因子定位于细胞核.qPCR分析表明,MtMADS1-like基因在不同的澳洲坚果品种中差异表达,在品种'333'中表达量最高,在品种'344'中表达量最低.研究结果为进一步验证MtMADS1-like的功能及阐明澳洲坚果花发育和开花调控的分子机制奠定了基础.     

澳洲坚果MtMADS1-like基因的克隆与表达分析

MADS～box家族基因广泛分布于植物中,在植物花发育的整个阶段起着至关重要的作用.为了探索MADS-box基因在澳洲坚果花发育过程中的分子机理,本研究以澳洲坚果'695'为试材,采用RT-PCR及RACE技术克隆获得澳洲坚果MADS-box类转录因子基因cDNA全长,命名MtMADS1-like(GenBank登录号:MK491608).该基因全长967 bp,开放阅读框ORF长672 bp,编码223个氨基酸,5'-UTR和3'-UTR分别为58 bp和237 bp.序列分析表明,MtMADS1-like具有保守的MADS-box结构域(MADS-MEF2-like)和半保守的K-box结构域,属于Type Ⅱ型MADS-box家族基因.进化分析表明,MtMADS1-like与其他植物中MADS-box蛋白具有较高的同源性,且与猴面花(Erythranthe guttata)MADS-box家族中SVP254的同源性高达67.10％,亲缘关系最近.生物信息学分析表明MtMADS1-like属于不稳定的亲水性蛋白,不具备信号肽,属于非分泌蛋白,α-螺旋和无规则卷曲构成了二级结构的主要蛋白框架,三级结构中MADS-box结构域和K-box形成该蛋白的核心结构,并且作为转录因子定位于细胞核.qPCR分析表明,MtMADS1-like基因在不同的澳洲坚果品种中差异表达,在品种'333'中表达量最高,在品种'344'中表达量最低.研究结果为进一步验证MtMADS1-like的功能及阐明澳洲坚果花发育和开花调控的分子机制奠定了基础.     

毛尖紫萼藓抗旱相关基因Gp-LEA的克隆与表达分析

以毛尖紫萼藓干旱cDNA文库中获得的一段与LEA基因同源性较高的EST序列为基础,采用RACE技术分离该基因cDNA全长序列,命名为Gp-LEA。Gp-LEA基因的cDNA全长814bp,开放阅读框456bp,编码含151个氨基酸蛋白质。生物信息学分析结果显示,Gp-LEA蛋白为稳定蛋白,分子质量为16.612kD,理论等电点（pI）为5.06,含有LEA₂功能结构域,不属于跨膜蛋白且不存在信号肽。系统发生分析表明,Gp-LEA基因编码蛋白与花旗松LEA蛋白亲缘关系最近。荧光定量PCR分析显示,Gp-LEA基因在复水和快速干旱模式下均能表达。推测Gp-LEA基因在毛尖紫萼藓的复水和干旱过程中起着重要作用。     

毛竹实时荧光定量PCR内参基因的筛选及成花基因PheTFL1表达分析

通过qRT-PCR对毛竹相关成花基因PheTFL1的表达进行研究,为毛竹开花机理的研究提供理论依据.从毛竹UBC18、PP2A和EF1α等9个候选内参基因中筛选出在叶、幼嫩花序、花序轴、枝、竹青等11个组织器官中都稳定表达的PP2A用于毛竹PheTFL1基因qRT-PCR结果的校正.结果显示:PheTFL1基因在开花竹叶、枝和竹青中低丰度表达,与未开花竹差异不显著,但在花和花序轴中高丰度表达;在实生苗叶和根中高丰度表达,在实生苗茎中低丰度表达.PheTFL1基因在具有分生能力的幼嫩组织中高丰度表达,说明其不仅参与花发育的调控,还参与了分生组织生长的调控.     

春兰CgSEP3基因的克隆和表达分析

该研究采用RT-PCR和RACE技术从春兰(Cymbidium goeringii)中分离到1个SEPALLATA3(SEP3)基因。序列分析表明,该基因含有1个732bp的开放阅读框(ORF),共编码243个氨基酸。系统进化树分析显示,该基因是MADS-box基因家族AP1/AGL9组SEP的同源基因,其编码蛋白与其它植物SEP3类蛋白具有较高的一致性,命名为CgSEP3(登录号为KF924272)。实时荧光定量分析表明,CgSEP3在春兰花器官中均有表达,其中在唇瓣、侧瓣和萼片中的表达量较高,在子房和蕊柱中的表达量较低;而且CgSEP3在花发育各个时期都有表达,在1~2cm的花芽中表达量最高,在盛开的花中的表达量最低。研究认为,CgSEP3基因可能在春兰花瓣和萼片的形成过程中具有重要作用。     

荷花LEAFY基因的克隆及表达分析

LEAFY（LFY）基因是花分生组织形成的必需基因,在成花过程中发挥重要作用。本研究以荷花品种‘红霞满天’为材料,利用已经获得的荷花LFY基因片段,采用RT-PCR和RACE技术克隆得到荷花LFY基因cDNA序列,命名为NnLFY。NnLFY全长cDNA为1 494 bp,开放阅读框（ORF）为1 173 bp,编码390个氨基酸,预测其相对分子量为44 517.1 Da。与其他物种已知的LFY基因序列进行同源性对比分析并构建系统进化树,结果显示荷花LFY基因与甜瓜LFY基因的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果表明,LFY基因在荷花幼叶期、花蕾期、盛花期的根、茎、叶、花中均有表达,其中,花蕾期各器官的表达量较高。     

苹果PDHB-1基因家族的鉴定与表达分析

丙酮酸脱氢酶E1组分β亚基-1 (pyruvate dehydrogenase E1 component subunit beta-1,PDHB-1)基因是编码丙酮酸脱氢酶复合物E1酶β亚基的基因,在果实酸度积累过程中具有重要作用。为了探究苹果(Malus domestica L.) PDHB-1家族的进化特征及其在不同酸含量苹果中的表达情况,本研究利用NCBI、Pfam等数据库和Clustal X、MEGA、TBtools等软件进行生物信息学分析,通过结合可滴定酸含量测定与实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR,q RT-PCR)分析,获得该家族基因在‘艾斯达’和‘成纪1号’2个不同酸含量的苹果中的表达情况。PDHB-1家族主要定位于叶绿体、细胞质和线粒体中,α-螺旋和不规则卷曲是该家族二级结构形成的主要因素。组织特异性表达谱显示大部分成员的表达量在果实中高于其他组织。q RT-PCR结果表明,大部分成员其表达量变化趋势与可滴定酸含量变化趋势一致,在果皮中,有14个成员的表达水平在酸含量较高的‘艾斯达’苹果中显著高于酸含量较低的‘成纪1号’,其中M...     

苎麻抗坏血酸过氧化物酶基因的克隆和表达分析

本研究根据苎麻转录组测序结果中的抗坏血酸过氧化物酶（APX）的基因片段,利用RT-PCR结合RACE方法从苎麻（Boehmeria nivea L.）中克隆到一个APX基因的全长cDNA,命名为BnAPX1。BnAPX1 cDNA全长1 201 bp,开放阅读框(ORF)为870 bp,推测其编码一个含289个氨基酸序列的多肽。生物信息学分析表明,BnAPX1属于植物过氧化物酶超家族成员,与其他物种过氧化物酶体APX相似性较高,C端具1个跨膜区。荧光定量PCR结果表明,BnAPX1在苎麻的根、茎中段、茎尖、茎皮、幼叶各部位均有表达,其中幼叶表达量最高,且该基因BnAPX1受重金属镉诱导上调表达,可能在重金属镉胁迫防御中起重要作用。     

中国水仙NtAP1基因的克隆与表达分析

采用RT-PCR和RACE技术,从中国水仙(Narcissus tazetta var.chinensis)幼嫩花芽中分离得到1个与花发育相关的MADS-box基因,将其命名为NtAP1(GenBank登录号为JN704304)。该基因全长1 155bp,含有1个762bp的开放阅读框,编码253个氨基酸。系统进化分析表明,该基因属于AP1-like基因。半定量RT-PCR分析表明,该基因在水仙品种‘金盏银台’和‘玉玲珑’的花瓣、副冠、雄蕊和雌蕊中均有表达,且在雌蕊中的表达量最高。研究认为,该实验分离出的NtAP1基因在‘玉玲珑’重瓣的形成过程中没有发挥重要的作用。     

山茶CjMYB1基因的克隆及表达分析

该研究通过序列比对分析,以野生红山茶和不同花色品种山茶为材料,采用PCR方法克隆CjMYB1基因,并通过生物信息学和表达分析对其进行初步研究,为深入研究山茶CjMYB1基因在花色形成和花发育过程的调控机理奠定理论基础。结果表明：(1)成功克隆获得山茶CjMYB1基因(GenBank登录号为OL347930),其开放阅读框长为879 bp,编码292个氨基酸,相对分子质量为33.17 kD;CjMYB1基因属于R2R3-MYB转录因子,且与拟南芥MYB基因家族的第7亚组处于同一分支。(2)荧光定量PCR分析发现,山茶CjMYB1基因在野生红山茶花芽中表达量最高,在萼片、花瓣、雄蕊和心皮中都有较高的表达量,推测其在山茶花器官发育中发挥着重要作用;在红色山茶品种中表达量较高,而在粉色、淡黄色、白色山茶品种中表达量较低,说明CjMYB1基因可能在红色山茶品种的花色苷合成途径中起到了关键作用。(3)亚细胞定位实验表明,CjMYB1蛋白定位在细胞核。     

鸭儿芹肉桂酸4-羟化酶基因的克隆与不同温度下的表达分析

为研究鸭儿芹木质素合成相关基因,以贵州省野生鸭儿芹为研究对象,克隆到1条1 631bp长的肉桂酸4-羟化酶(C4H)基因(CjC4 H),并以鸭儿芹生长过程中主要面临的4种不同温度(10℃、18℃、30℃和38℃)处理0、0.5、1、2、4、8、12和24h,考察鸭儿芹木质素合成基因CjC4 H的表达情况,探讨鸭儿芹木质素合成基因受温度的调控关系,为鸭儿芹适宜生长温度的选择提供参考。开放阅读框(ORF)分析显示,CjC4 H基因的开放阅读框(ORF)长度为1 521bp,可编码506个氨基酸,蛋白分子质量为58.13kD,等电点为9.38。进化树分析表明,同科植物之间C4H进化上相对保守。实时定量PCR检测鸭儿芹中CjC4 H基因与温度的响应表达,结果表明38℃高温处理4h时,CjC4 H基因表达量远高于其他温度处理;而10℃和18℃相对低温处理,CjC4 H基因表达在24h时明显提高。     

鸭儿芹羟基肉桂酸转移酶基因的克隆及其对不同温度的响应

以贵州省野生鸭儿芹为研究对象,用RT-PCR克隆获得与木质素合成有关的羟基肉桂酸转移酶基因(CjHCT),并分析CjHCT基因对不同温度的响应,探索人工栽培鸭儿芹的适宜温度。结果表明:(1)CjHCT基因开放阅读框长度为1 290bp,编码429个氨基酸;蛋白质分子质量为47.58kD,等电点为6.67;进化树分析表明,CjHCT与茄科植物的HCT亲缘关系最近。(2)荧光定量PCR分析显示,CjHCT基因在贵州鸭儿芹根、叶柄、叶及花不同组织中的表达具有组织特异性,且在根中CjHCT基因的表达量最高,而在叶中表达量最低,花与叶中该基因表达量相近。(3)对鸭儿芹生长过程中主要面临的4种不同温度(10℃、18℃、30℃和38℃)分别处理0、0.5、1、2、4、8、12、24h,荧光定量PCR检测显示,CjHCT基因的表达量(以0h处理作为对照,表达量为1)在高温(30℃和38℃)处理下于0.5h时最高,其中30℃处理的CjHCT基因表达量高于38℃处理;在低温(10℃和18℃)下鸭儿芹CjHCT基因表达量于12h时最高,其中10℃处理0.5h时CjHCT基因较对照表现为下调;高温(30℃和38℃)下CjHCT基因表达量峰值比低温(10℃和18℃)下表达量峰值高,而且峰值出现的时间也较早。该实验意义在于初步研究发现低温栽培鸭儿芹能抑制CjHCT基因的表达,为人工栽培鸭儿芹温度调控提供了参考。     

丹参环阿屯醇合酶基因克隆及表达分析

以丹参cDNA为模板,克隆了丹参环阿屯醇合酶(cycloartenol synthase,CAS)基因的cDNA序列(SmCAS),对其序列进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR方法研究了该基因在丹参不同器官及不同胁迫处理下的表达模式。结果显示:该基因全长2 346bp,包含2 271bp开放阅读框,编码756个氨基酸。预测其编码蛋白分子量为86.16kD,具有氧化鲨烯环化酶超家族典型的DCTAE结构域和QW结构域。该基因推测的氨基酸序列与人参、田七、积雪草、甘草、拟南芥的相似性分别为83%、84%、83%、81%和80%。SmCAS基因在丹参根、茎、叶、花中均有表达,在花中表达量最高;而且SmCAS基因能够响应ABA、低温和干旱的诱导。     

金银花丙酮酸激酶基因的克隆与表达特性分析

采用RT-PCR和RACE技术,首次从金银花中克隆丙酮酸激酶基因全长cDNA,命名为LjPkc(GenBank登录号JQ621946.1),LjPkc基因编码区序列全长为1 533bp,共编码510个氨基酸。基于基因序列亲缘关系分析结果显示,LjPkc基因与烟草Pkc基因亲缘关系最近,属于双子叶植物Pkc基因家族。蛋白质亚细胞定位分析认为LjPkc在线粒体或叶绿体中发挥作用。LjPkc蛋白质的三维空间结构预测结果显示,LjPkc蛋白主要由α-螺旋、不规则盘绕组成。定量PCR检测发现,LjPkc基因在金银花不同组织中广泛表达,但表达水平各有差异,黄花中表达量最高。该研究丰富了Pkc基因库资源,为揭示LjPkc基因在金银花糖代谢方面的生物学作用奠定了基础。     

水芹肉桂醇脱氢酶基因的克隆与表达特性分析

以‘八卦洲水芹’及其紫色叶柄突变型水芹‘南选八卦洲紫水芹’为实验材料,利用RT-PCR方法从‘南选八卦洲紫水芹’中克隆得到水芹肉桂醇脱氢酶(CAD)基因,命名为OjCAD。OjCAD基因开放阅读框长为1 074bp,编码357个氨基酸。OjCAD蛋白相对分子质量为39 143.10,理论等电点为6.91,属于MDR家族。系统进化分析显示,水芹OjCAD与同属伞形科的胡萝卜CAD进化关系最近,具有高度保守性。OjCAD编码的蛋白属于疏水蛋白,空间结构主要由7个α-螺旋和17个β-折叠组成。实时定量PCR分析显示,OjCAD基因在紫色和非紫色水芹的叶片和叶柄中相对表达量存在差异,水芹OjCAD基因在叶片中的表达量显著高于叶柄,在‘八卦洲水芹’中的表达量高于‘南选八卦洲紫水芹’。该研究结果为进一步分析水芹木质素生物合成奠定了基础。     

甘蓝型油菜热激转录因子的克隆及表达分析

以甘蓝型纯系油菜为试材,用RT-PCR和RACE方法首次从油菜种子中获得油菜热激转录因子的cDNA全长序列,命名为BnHSFA4a,GenBank登录号为HQ435241。结果表明:该cDNA长1 667bp,编码1个具有389aa的蛋白质,该基因编码的氨基酸序列与拟南芥热激转录因子AtHSFA4a编码的氨基酸序列间相似度为82%。对34条编码不同热激转录因子的氨基酸序列进行多重比对,结果在100～190aa处序列间氨基酸总相似性超过60%,显示出较高的保守性。构建原核表达载体并成功表达出预期蛋白。半定量RT-PCR结果显示,该基因的表达先于油菜肌醇半乳糖苷合成酶(BnGOLS1)基因,符合该基因调控BnGOLS1的假设。推测AtHSFA4a基因可能通过调控BnGOLS1的表达量进而在油菜种子脱水耐性获得过程中发挥一定的作用。     

毛果杨HDA901基因的克隆和表达分析

该实验克隆了毛果杨组蛋白去乙酰化酶基因HDA901的编码序列,并进行生物信息学、亚细胞定位和盐胁迫表达分析。序列分析表明,HDA901开放阅读框为1 245bp,编码1个由414个氨基酸残基组成的蛋白质,等电点为5.77;毛果杨HDA901与其他植物同源蛋白具有一段保守序列,在进化上与拟南芥AtHDA14亲缘关系较近。启动子分析表明,毛果杨HDA901基因启动子序列包含ACE、ABRE、HSE和TC-rich repeats等多个与逆境相关的顺式作用元件。亚细胞定位分析表明,毛果杨HDA901蛋白在细胞核和细胞质中无分布,可能位于线粒体或穿梭于线粒体和叶绿体之间。实时荧光定量PCR结果显示,毛果杨HDA901基因表达受盐胁迫调节,在盐胁迫下,根和茎中HDA901基因表达受抑制;叶中HDA901基因表达受诱导。研究表明,毛果杨HDA901基因参与盐胁迫应答反应。