用套式PCR方法检出腹泻及健康犬粪中的犬冠状病毒

自2003年夏至2004年初的8个月内收集犬粪样112份,其中南京地区家庭单养的腹泻犬粪便43份,某养犬场群养健康犬粪便30份,沈阳地区某养犬基地群养健康犬粪便39份,用套式PCR方法检测犬冠状病毒(CCV).结果显示,南京家庭单养腹泻病犬CCV阳性率为40.9%(18/43),CCV检出率与季节相关,冬季的检出率较高.健康犬阳性率为84.1%(58/69),其中沈阳某场健康犬CCV的感染率(87.2%)高于南京某犬场(80.0%).取南京腹泻犬和沈阳健康犬阳性样本各2份测序,结果表明,4个样本M基因212bp的序列与GenBank登录的中国大熊猫源的CCV同源性最高(94.8～96.7),并且南京和沈阳CCV毒株之间存在一定序列差异.所有阳性样本用CCV基因型鉴别PCR鉴定,均为CCVⅡ型.     

从健康狐狸、貉粪中检出犬冠状病毒的两种基因型

取某养殖场健康狐狸 (6 1份 )、貉 (2 4份 )粪样 ,用套式PCR(RT-nPCR)方法检测犬冠状病毒 (CCV)并进行基因型鉴定。结果显示 :狐狸粪样中有 4 3份 (70 . 5 % )为CCVⅡ型阳性 ,2 9份 (47. 5 % )为CCVⅠ型阳性 ,两型混合感染2 5份 ,占 4 1 0 % ,两型总感染率为 77 .0 %。 2 4份貉粪样中 ,2 2份为CCVⅡ型阳性 (91 .7% ) ,其中 16份为CCVⅠ型、Ⅱ型混合感染 (6 6 . 7% )。分别取狐狸和貉粪样中CCVⅠ、Ⅱ型阳性PCR产物各 2份 (共 8份 )进行测序 ,均与CCV的M基因序列相符 ,证实PCR结果非假阳性。序列及系统进化分析表明 ,CCVⅠ型与源于意大利腹泻犬的CCVⅠ型 (AF5 0 2 5 83)同源性最高 (96 . 7%～ 98. 1% ) ;CCVⅠ、Ⅱ两种基因型同源性为 88. 3%～ 89. 7% ,在进化树中处于两个大的分支上 ;同为CCVⅡ型 ,狐狸源与貉源序列也存在多个位点差异。首次在貉粪中检出CCV ,证实在健康狐狸、貉群体中存在CCV流行 ,且CCVⅠ、Ⅱ型并存。     

山东地区犬冠状病毒的分子流行病学调查及其基因型多样性分析

【目的】了解分析山东地区健康犬及腹泻犬中犬冠状病毒(CCoV)的分子流行病学及其基因型。【方法】采集2017年以来山东省宠物市场、流浪犬中心、犬舍、各地宠物医院等的健康和腹泻犬只的肛拭子样品,采用PCR方法检测CCoV及其CCoV-Ⅰ和CCoV-Ⅱ(CCoV-Ⅱa和CCoV-Ⅱb)基因分型情况,并对扩增出的M、S全基因进行测序分析。【结果】199份样品中,共检出CCoV阳性样品79份,健康犬中的检出率为40.2%(33/82),腹泻犬中的检出率为39.3%(46/117)。健康犬中CCoV-Ⅰ型与CCoV-Ⅱ型阳性检出率分别为78.8%(26/33)和51.5%(17/33);腹泻犬中CCoV-Ⅰ型与CCoV-Ⅱ型阳性检出率分别为39.13%(18/46)和80.4%(37/46)。基因型阳性比率分析表明,健康犬中单独感染CCoV-I型的比率最高,为48.5%(16/33);腹泻犬中单独感染CCoV-Ⅱa比率最高,为47.8%(22/46)。测序分析获得48株M基因序列,遗传进化分析表明,12株CCoV-Ⅰ型毒株中除1株外,其余均从健康犬中分离。36株CCoV-Ⅱ型毒株中除7株来自健康犬外,其余均为腹泻犬中获得。获得的3株S全基因均来自腹泻犬且均属于CCoV-Ⅱa亚型。【结论】山东地区犬群中CCoV检出率较高,说明CCoV广泛流行,健康犬和腹泻犬中均存在多重感染情况,健康犬中主要流行CCoV毒株为CCoV-Ⅰ型,腹泻犬中主要流行CCoV-Ⅱa型。     

粪便分离大肠埃希菌CRISPR系统在耐药及毒力中的作用

目的探索粪便分离大肠埃希菌成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)在耐药及毒力中的作用。方法收集某院2018年8-12月分离自慢性腹泻患者及健康体检者粪便样本的大肠埃希菌。采用纸片扩散法检测其药物敏感性,PCR法检测并比较分析腹泻患者及健康体检者粪便样本分离大肠埃希菌的系统发育群、耐药基因及CRISPR系统。结果共收集到142株大肠埃希菌,源于63例慢性腹泻患者(疾病组)和79例健康体检者(健康组)。药敏结果显示,氨苄西林耐药率为48.0%,其余抗菌药物敏感率为73.1%～100.0%。63株源于慢性腹泻患者粪便样本分离大肠埃希菌中CRISPR系统的检出率显著低于79株源于健康体检者(3.2%vs 46.8%,χ~2=33.538,P0.001)。在被检测的耐药基因中,63株疾病组中11株阳性(7株bla_(CTX-M-1)组、3株bla_(CTX-M-9)组和1株mcr-1),79株健康组中4株bla_(CTX-M-1)组,未携带耐药基因菌株中CRISPR系统的检出率显著高于携带耐药基因菌株(0.0%vs 29.9%,P=0.011)。43株高毒力菌株(B2群和D群)中CRISPR系统的检出率显著高于99株低毒力菌株(A群和B1群)(44.2%vs 20.2%,χ~2=8.656,P=0.003)。结论粪便分离大肠埃希菌对常用抗菌药物仍保持较高敏感性。CRISPR系统可能在粪便分离大肠埃希菌毒力及耐药基因的传播方面发挥重要作用。     

犬瘟热和犬冠状病毒联合RT-PCR检测方法的应用

塔里木农垦大学乔军、解放军大学夏咸柱、东北农业大学何宠彬等对此课题进行了研究。他们利用犬瘟热(CDV)和犬冠状病毒(CCV)牧异性引物对同一样品中CDV和CCV的RNA模板进行联合RT—PCR扩增,并优化其扩增条件,得到两条大小与试验设计完全相符的特异性扩增带,且不扩增犬细小病毒、犬腺病毒、犬副流感病毒、轮状病毒的核酸。其敏感性试验表明：该联合PCR能检测出10^-4倍稀释的CDV模板(10^6.6TCID50／0．1mL)。对7份临床发病犬病科检测,其阳性检出率可高于电镜负染检查。这表明此法有高度敏感、特异、准确、快速等特点,适用于当前民用和军用兽医临床对CDV、CCV的检测和对犬的其他疾病的鉴别诊断。     

腹泻患者艰难梭菌及其毒素A/B检出率分析

目的了解住院腹泻患者艰难梭菌及其毒素A/B的检出情况,为临床诊断抗生素相关性腹泻提供参考依据。方法收集2015年9月至2016年8月崇州市人民医院疑似抗生素相关性腹泻住院患者的粪便标本163份,用艰难梭菌快速检测试剂盒检测艰难梭菌特异性抗原谷氨酸脱氢酶(GDH);用酶联免疫荧光法检测GDH阳性标本中艰难梭菌毒素A/B的产生情况。结果 163份粪便标本中GDH阳性为34份,阳性率为20.86%。34份GDH阳性标本中艰难梭菌毒素A/B阳性率为41.18%(14/34),可疑阳性率为17.65%(6/34),阴性率为41.18%(14/34)。结论疑似抗生素相关性腹泻住院患者艰难梭菌GDH检出率较高,毒素A/B阳性率也比较高,提示临床应重视抗生素相关性腹泻患者艰难梭菌感染的诊断。     

腹泻犬中细小病毒携带情况以及VP2基因进化分析

为了解四川省部分地区腹泻犬中细小病毒的感染情况以及VP2基因的遗传变异情况。从四川省部分地区收集了50例疑似CPV感染的腹泻犬粪便,对标本采用PCR扩增VP2,并对VP2基因全序列进行测序分析。PCR检测阳性标本19份。序列分析显示,15份扩增出VP2基因全序列标本均为CPV-2a型,聚类分析显示全部序列聚类在同一分支,本次研究的四川省部分地区流行的CPV均为CPV-2a型。可推测目前四川省部分地区所常见的CPV流行株依然以CPV-2a型为主。本次试验所扩增的15份CPV阳性标本与国内外传统毒株有着极高的同源性,提示目前四川省部分地区CPV还未出现重大的变异情况。     

犬冠状病毒南京株M基因的同源重组分析

对来自腹泻犬粪样的犬冠状病毒(CCV)南京株NJ17株及参考株1-71的M基因进行了克隆、测序,并与GenBank中所有已知CCV毒株及同亚群的猪冠状病毒(TGEV)和猫冠状病毒(FCoV)代表株的M基因进行了同源性比较和系统进化分析,同时对M蛋白的结构和功能进行了预测分析.结果表明,CCV1-71与近年在中国分离到的CCV毒株V1、V2及大熊猫源的毒株具有98.9%～99.5%的同源性,说明这些毒株可能是来自同一毒株的准种.NJ17与其他中国分离株及国外分离株的同源性为87.0%～91.9%,显示国内可能存在一个相对独立进化的CCV毒株.序列比较发现,所有CCV毒株在可能的同源重组"热点"区内都有一个CTTTAG序列,与鸡传染性支气管炎病毒同源重组模板交换位点附近的特征序列相似.CCV NJ17株M蛋白在N端50氨基酸序列与FCoV 79-1683同源性高,而在后212氨基酸序列与TGEV同源性高,提示该毒株可能在M基因上曾经发生过不同病毒的同源重组.CCV M蛋白的结构及功能预测表明,所有毒株都具有分泌型信号肽,有4个螺旋跨膜区,N末端和C末端均位于膜内.M蛋白的两末端具有较强的抗原性,M蛋白上存在多种功能性氨基酸修饰位点且相对保守.N末端的氨基酸变异很大,但是功能性修饰位点相对保守,提示N末端的功能可能与构象有关.     

犬冠状病毒南京株M基因的同源重组分析

对来自腹泻犬粪样的犬冠状病毒(CCV)南京株NJ17株及参考株171的M基因进行了克隆、测序,并与GenBank中所有已知CCV毒株及同亚群的猪冠状病毒(TGEV)和猫冠状病毒(FCoV)代表株的M基因进行了同源性比较和系统进化分析,同时对M蛋白的结构和功能进行了预测分析。结果表明,CCV171与近年在中国分离到的CCV毒株V1、V2及大熊猫源的毒株具有98.9%～99.5%的同源性,说明这些毒株可能是来自同一毒株的准种。NJ17与其他中国分离株及国外分离株的同源性为87.0%～91.9%,显示国内可能存在一个相对独立进化的CCV毒株。序列比较发现,所有CCV毒株在可能的同源重组“热点”区内都有一个CTTTAG序列,与鸡传染性支气管炎病毒同源重组模板交换位点附近的特征序列相似。CCVNJ17株M蛋白在N端50氨基酸序列与FCoV791683同源性高,而在后212氨基酸序列与TGEV同源性高,提示该毒株可能在M基因上曾经发生过不同病毒的同源重组。CCVM蛋白的结构及功能预测表明,所有毒株都具有分泌型信号肽,有4个螺旋跨膜区,N末端和C末端均位于膜内。M蛋白的两末端具有较强的抗原性,M蛋白上存在多种功能性氨基酸修饰位点且相对保守。N末端的氨基酸变异很大,但是功能性修饰位点相对保守,提示N末端的功能可能与构象有关。     

圈养小熊猫几种病毒的PCR检测

本文采用巢式PCR/ RT-PCR 方法,对我国10 个动物园中无临床症状的圈养小熊猫的71 个肛拭子和61 个唾液拭子样品,进行犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)、犬冠状病毒(CCV)、犬腺病毒(CAV)和犬疱疹病毒(CHV)的检测,以评估我国圈养小熊猫是否面临这几种病毒的威胁。对阳性PCR 结果进行测序分析,并与GenBank 上的序列进行比较。结果,在肛拭子样品中检测到3 个CPV 和6 个CCV 阳性结果,经测序后,与GenBank 上序列的同源性分别达99% 和100% 。而在唾液拭子样品中没有检测到任何阳性结果,且CDV、CAV和CCV 的检测结果均为阴性。从阳性CPV 的肛拭子样品中分离到一株细小病毒毒株,表明圈养小熊猫已受到细小病毒和犬冠状病毒的感染,今后应加强这两种病毒的预防工作。本文所采用的PCR 方法检测病毒性疾病,能检测到微量的病毒模板,可对小熊猫病毒性感染进行早期诊断。