Qβ复制酶与RNA重组技术

以往的遗传工程主要是设计生物的基因蓝图,转移DNA的过程,其关键是DNA的重组操作。自1983年哥伦比亚大学的Kramer,Mills和Miele建立RNA重组技术以后,人们认为遗传工程的内容必将极大地丰富起来。一、Qβ复制酶和MPV-1 RNA RNA 重组技术是在需求大量 RNA 的刺激下发展起来的。细胞内的RNA是DNA的转录产物,而转录要求一定的条件,进行的规模也很有限。即使在转录活跃的情况下,一个DNA分子一次产生一个RNA分子,RNA分子的量只能按算术级数增长。因此要想得到足     

可使RNA体外特异性扩增的Qβ复制酶技术

Q_β复制酶是由 Q_β噬菌体感染大肠杆菌后诱导产生的一种 RNA 依赖性的 RNA 聚合酶,对 MDV-1RNA 的复制有高度特异性和极高的扩增效率。可利用 RNA 重组技术,以 MDV-1RNA 为载体,制备含特异 RNA探针的可复制的重组 MDV-1RNA,用 Q_β复制酶体外特异性扩增与靶分子杂交的RNA 探针,以达到检测靶分子的目的。这项技术比 PCR 技术更先进,更优越,具有广泛的应用前景。一、Q_β复制酶Q_β复制酶(Q-beta replicase)是由Q_β噬菌体感染大肠杆菌后诱导产生的一种RNA 依赖性的 RNA 聚合酶,由四个亚     

Qβ噬菌体RNA复制酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

构建了带有Qβ噬菌体RNA复制酶cDNA基因的重组表达质粒pKK-Rep,采用电泳分析的方法考察了不同浓度的IPTG、不同的葡萄糖浓度对pKK-Rep在E.coli JM109中表达RNA复制酶蛋白的影响。结果表明,0.01mmol/L IPTG可以有效诱导pKK-Rep表达RNA复制酶蛋白,但表达的RNA复制酶蛋白大多数为不溶性蛋白。在培养基中添加0.02%的葡萄糖对该RNA复制酶蛋白的组成型表达无明显的影响,但当葡萄糖浓度增加至0.04%-1.0%时,这种组成型表达量显著降低。采用MDV－poly( )RNA作为模板来体外检测可溶性表达蛋白的活性,结果表明其具有体外特异扩增RNA模板的活性。     

Qβ RNA 复制酶中亚基的共表达对β亚基溶解性的影响

在体外RNA和蛋白质合成及自复制系统的研究中 ,QβRNA复制酶作为以RNA为模板的RNA聚合酶 ,是比较重要的应用酶种之一。该酶由 4个亚基组成 ,其中只有 β亚基是由病毒基因编码 ,而其他 3个亚基都是宿主蛋白。利用普通表达载体合成Qβ复制酶时 ,得到的 β亚基几乎都是不溶性蛋白 ,从而影响了Qβ复制酶的活性和产率。为尝试提高 β亚基的溶解性 ,构建含有β亚基基因的表达质粒pBAD 33 rep ,同时利用pET2 1a( )为表达载体表达其他 3个亚基进行共表达研究。不同亚基组合的共表达结果通过SDS PAGE分析表明 ,当 β亚基与EF Tu Ts亚基共表达时 ,溶解度有一定的提高 ,而且可溶性部分也具有复制酶活性。通过调节共表达诱导物浓度 ,相对增强可溶性 β亚基的表达 ,可溶性Qβ复制酶酶量得到相应的提高     

重组RNA技术

重组DNA技术已成为生物工程的重要支柱。利用这一技术人们已经开始以工业的规模生产对人类有重要意义的蛋白质。但目前应用重组DNA技术还存在一些难以解决的困难:生产成本昂贵;某些产品的安全性存在一些问题;真核重组DNA分子在现有转录系统中难以表达或表达效率不够理想。然而近年来出现的重组RNA技术将会避免重组DNA技术应用上存在的问题。具有区别于重组DNA突出的特点。     

RNA的重组技术

RNA的重组技术是一种制造大量RNA的新技术。这是应用噬菌体Qβ的RNA复制酶,在含有少量RNA模板的体系中产生大量的RNA产物的新方法,在其中应用了RNA重组体以维持QβRNA复制酶的严格特异性。     

重组RNA技术的诞生

重组RNA技术,是美国哥伦比亚大学癌症研究所Kramer、Mills和Mide三人合作发明的。1984年初,哥伦比亚大学科技发展办公室已为该项技术申请专利。重组RNA技术的诞生意味着分子生物学在继重组DNA技术之后,又进入一个新的发展阶段。过去,人们只能在试管中利用DNA模板,RNA多聚酶及其辅因子很困难地转录出少量RNA,应用重组RNA技术,用100毫微克的RNA模板在一小时内就能复制出一毫克的RNA。重组RNA技术的关键所在是Qβ复制酶,它是1965年从被Qβ细菌病毒感染的寄主细胞中发现的一种RNA复制酶。当QβRNA侵入寄主细胞,能编码三种蛋白质:外壳蛋白、     

TMV复制酶基因靶向的RNA干涉载体构建

以TMV复制酶基因作为RNAi的靶向序列,应用RT－PCR法获得目的DNA序列。依据RNAi机制,以酶切后连接的方法将目的DNA序列正向、反向锚定连接到pUCCRNAi载体质粒,构建含目的序列反向重复结构的RNA干涉中间载体;反向重复结构酶切后插入含超强启动子的pC2300-35s-OCS表达载体,重组的表达载体质粒经冻融法转化到只含辅助质粒的根癌农杆菌中,完成双元载体系统的构建。每步的重组子经特异引物PCR验证和酶切验证有相应的特异条带存在,且测序鉴定序列正确。确认成功构建了TMV复制酶基因靶向的RNAi双元载体,为RNAi技术在植物病毒病害防治中的应用奠定基础。     

β分泌酶RNA干扰质粒的构建与鉴定

选择人、小鼠和大鼠的BACEI基因的共有序列为干扰的靶标,设计4对干扰片段连接至带有GFP和U6 RNA聚合酶启动子的PRNATU6．1载体．将构建好的质粒转染HEK293T细胞,通过RT-PCR和Western blotting的方法分别在RNA和蛋白水平上来检测BACEI和Aβ,以鉴定其干扰效率,并通过夹心ELISA的方法进一步在过表达蛋白APP和BACE1的HEK293T细胞体系中验证干扰质粒对Aβ1-42生成的影响．RT-PCR和Western blotting结果提示β分泌酶的siRNA能干扰BACE1和Aβ RNA和蛋白水平表达,效率分别达到90％和80％．Westem blotting和ELISA结果提示,β分泌酶的siRNA也降低Aβ1-42生成．     

RNA催化剂与酶

1982年,美国学者塞奇(T·R·Cech)等发表“具有催化功能的RNA”论文,对传统     

RNA 干扰技术抑制病毒复制的研究进展

RNA干扰是指dsRNA抑制细胞内同源基因表达的现象,RNA干扰现象自发现以来在短短的几年里,已成功地用于不同种属的生物研究。dsRNA不仅参与内源基因表达调控,而且能够抑制宿主内病原微生物基因的表达,参与构筑生物体的防御机制。近年来,运用RNAi技术在哺乳动物中的研究不断深入,尤其是抑制病毒复制的研究成果令人欣喜,这为人类动物抗病毒治疗提供了新的思路。     

Qβ RNA 复制酶中亚基的共表达对β亚基溶解性的影响

在体外RNA和蛋白质合成及自复制系统的研究中,Qβ RNA复制酶作为以RNA为模板的RNA聚合酶,是比较重要的应用酶种之一。该酶由4个亚基组成,其中只有 β亚基是由病毒基因编码,而其他3个亚基都是宿主蛋白。利用普通表达载体合成Qβ复制酶时,得到的β亚基几乎都是不溶性蛋白,从而影响了Qβ复制酶的活性和产率。为尝试提高β亚基的溶解性,构建含有β亚基基因的表达质粒pBAD 33rep,同时利用pET21a(+)为表达载体表达其他3个亚基进行共表达研究。不同亚基组合的共表达结果通过SDSPAGE分析表明,当β亚基与EFTuTs亚基共表达时,溶解度有一定的提高,而且可溶性部分也具有复制酶活性。通过调节共表达诱导物浓度,相对增强可溶性β亚基的表达,可溶性Qβ复制酶酶量得到相应的提高。     

DNA复制、修复与重组

在一些大肠杆菌株系中,RecET是一种噬菌体衍生出的简单而有效的重组系统,它能通过单链退火启动同源重组。一种称作RecE的5’-3’外切核酸酶可以对生成的DNA末端进行再切割,在切口处造成一个3’－单链末端,而重组酶RecT在此末端加载以单链DNA（ssDNA）互补链。     

RNA病毒的复制途径

ＲＮＡ病毒的复制途径聂剑初（北京师范大学生物学系１００８７５）ＤＮＡ病毒在其基因组复制和表达过程中利用许多的宿主蛋白质。ＲＮＡ病毒的复制则面临一个特殊的问题,即未受侵染的宿主细胞没有按照ＲＮＡ模板的指令合成ＲＮＡ的酶。因此,ＲＮＡ病毒必须含有合成这类...     

质粒复制与反义RNA的调控机制

质粒作为基因克隆和表达载体在基因工程和分子生物学研究中被广泛地应用。质粒自身的性质,如复制,质粒不亲和性的分子基础,传代中的分配机制和接合转移诸方面的研究也在深入地开展。这些研究为进一步完善质粒载体的改造提供了理论基础。     

酶促RNA

阻止活体基因表达的反义RNA已普遍成为当今生物技术公司最热门的研究领域之一。然而,却面临着许多技术障碍.一旦反义RNA位于细胞内部就被酶所破坏,这意味着RNA不具有重复使用性.解决此问题的诸多办法是化学改变反义物质以阻止上述降解发生,或者控制其过量投入.但是,澳大利亚联邦科学与工业研究组织(CSIRO)的研究人员设计出了另一种不同方法.他们试图遗传加工微生物以获得一些RNA片段,在RNA合成蛋白之前切断人们希望“静止”的基因的RNA.     

重组酶聚合酶扩增技术研究进展

重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)技术是一种新兴的核酸恒温扩增技术,具有灵敏度高、特异性强、反应快速等特点。利用RPA技术可以对核酸拷贝数进行绝对定量并且可以同时检测多个靶标核酸序列,结合侧流层析试纸条或荧光信号监测装置等简易实验设备即可直接观察检测结果。就RPA技术的原理、发展、技术特点及其近年来在体外诊断、病原检测等领域的研究进展作一综述,旨在为该技术的深入研究和应用提供参考。