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对重组人粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子(rhGM—csF)高效表达克隆pzw.GM的表达产物进行了纯化,并对纯化的人GM—CSF进行了N端氨基酸序列分析。人GM—CSF基因表达产物在大肠杆菌中以不溶性包涵体形式存在,经过超声破菌、包涵体抽提、凝胶过滤层析、复性、离子交换一系列纯化步骤,终产物纯度达99%,按蛋白总量计算回收率达10%,比活性达1×107/mg蛋白质。通过测定纯化人GM—csF的N端l 6个氨基酸序列,与由其DNA序列推导的氮基酸序列完全一致,为大批量重组人GM—CSF的生产创造了条件。 相似文献
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大肠杆菌表达的重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的纯化 总被引:1,自引:0,他引:1
对重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)高效表达克隆pZW.GM的表达产物进行了纯化,并对纯化的GM-CSF进行了N端氨基酸序列分析。人GM-CSF基因表达产物在大肠杆菌中以不溶性包涵体形式存在,经过超声破菌、包涵体抽提、凝胶过滤层析、复性、离子交换一系列化步骤,终产物纯度达99%,按蛋白总量计算回收率达10%,比活性达1×10^7u/mg蛋白质。通过测定纯化人GM-CSF的N端1 相似文献
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目的:建立一种简单、快速复性并同时纯化大肠杆菌表达的重组人粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)的方法。方法:研究rhGM-CSF在疏水色谱(HIC)上的复性和纯化机理,并对固定相和流动相进行选择和优化,包括固定相配基、流动相中盐的种类、流动相pH值、流动相中还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)的比例,以及流动相中尿素的浓度。结果:优化后的固定相为PEG600,流动相中的盐为(NH4)2SO4,流动相pH值为7.0,流动相中添加2.0mol/L尿素、1.8mmol/LGSH和0-3mmol/LGSSG。在优化条件下,HIC可使rhGM-CSF在分离纯化的同时得到复性,比活达1.58×10^7U/mg,纯度为95.7%,质量回收率为56.8%。结论:建立的疏水色谱复性和纯化工艺可简化操作步骤,缩短生产周期。 相似文献
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由基因工程大肠杆菌表达的重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM—CSF)以包涵体的形式存在于细胞中,通过破菌、洗涤获得包涵体.再经过溶解、凝胶过滤、复性、疏水和离子交换柱层析得到了均一的产品,经高压液相和SDSPAGE电泳测定纯度均大于98%,rhGM—CSF的比活为3.2×107IU/mg,纯化获得的rhGM—CSF为一酸性蛋白,等电点约为5.2,NH2-末端前20个氪基酸序列测定结果与文献报道一致。rbGM—CSF的NH2-末端不均一.其中带Met的分子约占59.5%,第一个氨基酸为Ala的分子约占24.6%,为Pfo的分子约占14.6%。纯化过程中蛋白的纯化倍数为3.9,生物活性总得率为69.1%,工艺重复性好,易放大。 相似文献
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目的 :获得具有生物学活性的重组人生长激素 (rhGH)。方法 :PBV -GH/DH5α菌体经超声破菌、反复洗涤后获得包涵体。将包涵体变性、复性 ,用硫酸铵盐析 ,离子交换层析和凝胶层析进行纯化。产物经SDS -PAGE、HPLC、N末端 15个氨基酸序列检测验证。结果 :终产物rhGH纯度达 98.2 % ,比活性大于 3.0IU/mg。分子量为 2 2kDa ,N末端氨基酸序列与DNA序列推导的氨基酸序列完全一致。结论 :从自构建的PBV -GH/DH5α工程菌中获得高纯度、高活性重组人生长激素。其纯化工艺为中试生产提供可靠依据。 相似文献
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通过小试研究对重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)的复性条件,如氧化剂和还原剂比例、操作方法、时间和蛋白浓度,进行了优化选择,并在此基础上进行了中试放大试验的验证.试验结果表明,采用优化后的复性方法复性液中rhG-CSF的效价可达到1.8×107U/ml以上,比活性达到0.9×108/mg以上. 相似文献
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人GM—CSF cDNA的克隆和在大肠杆菌中的表达 总被引:3,自引:0,他引:3
从诱导的人胚肺细胞HFL株中提取总RNA.经RT-PCR反应获取了人GM-CSFcDNA,DNA序列测定表明其顺序与文献报道完全一致。为了获得高效表达,应用PCR改造了人GM-CSF的cDNA5’端核苷酸序列,并将改造的人GM-CSF基因插入含T7启动子的质粒pET-11d构建成表达质粒pETC-5,将此质粒转化大肠杆菌株BL21(DE3)得到表达菌株BLEC4。表达菌株用0.5mol/LIPTG诱导2小时后,产生大量重组蛋白并形成包涵体。SDS—PAGE电泳图谱扫描结果表明,rhGM-CSF产量占菌体总蛋白量的16%。ELISA和TF-1细胞培养测定表明,初步纯化和复性的rhGM-CSF具有天然的hGM-CSF生物活性。 相似文献
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本文对重组人白细胞介素4高效表达克隆pBV220/hIL-4a的表达产物进行了纯化,升对纯化的人IL-4进行了N端氨基酸序列分析。人IL-4基因表达产物在大肠杆菌中以不溶性包涵体形式存在,经过超声破菌、包涵体抽提、复性浓缩、离子交換和凝胶过滤层析一系列纯化步骤,终产物纯度达98%以上,按蛋白总量计算回收率为14%,比活性达2×10~6单位/mg蛋白。通过测定纯化人IL-4的N端16个氮基酸序列,与由其DNA序列推导的氨基酸序列完全一致。本文为重组人IL-4的批量生产奠定了基础。 相似文献
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重组人GM—CSF基因在昆虫细胞中的表达 总被引:1,自引:0,他引:1
利用苜蓿夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)带β-Galactosidase基因标记的非融合蛋白基因转移载体pBlueBac将人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)基因成功地插入病毒AcNPV的基因组中.hGM-CSF基因在感染重组病毒的草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)培养细胞Sf9中得到表达,感染后的Sf9细胞培养液能刺激人骨髓细胞在体外形成典型的集落,表达水平可达2.7×1055CFU/ml。以hGM-CSF单抗所作的WesternBlotting表明,表达的hGM-CSF对是3种糖基化程度不同的产物,分子量分别约为15kd,18kd和20kd。 相似文献
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TransgenicResearch 2 0 0 2年 1 0月 1 1卷 5期 5 2 1~ 5 31页报道 :种子不仅是高等植物延续生命的重要材料 ,也是人类食物、药品和工业原料的重要来源。近年来已将不同来源包括人类、细菌和病毒的可利用的基因序列表达于植物 ,也试图利用转基因种子蛋白来生产药物。已知人粒细胞 巨噬细胞集落刺激因子 (GM CSF)在调节白血细胞 (粒细胞和单核细胞 )的生成和功能中可发挥重要作用 ,在抗感染中具有重要的临床意义。还发现GM CSF在化疗、骨髓移植、抗癌和抗艾中也具有多种临床应用。因此 ,目前已有一些国家将重组GM CSF用于临床治疗… 相似文献
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人重组GM—CSF/HSA—D3嵌合蛋白(GM—HSA)在大肠杆菌中的表达及其产… 总被引:1,自引:0,他引:1
将人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和人血清白蛋白第三功能区(HSA-D3)的基因串联后,在E.coli中获高效表达,表达量占菌体蛋白的32.6%。利用TF-1体外细胞活性测定表明,GM-HSA的活性单位为1.04×10^6U/mg,虽然其比活性低于GM-CSF,但比后者具有更高的体外热稳定性和储藏稳定性。 相似文献
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重组人MCAF/GM—CSF融合蛋白表达及其生物学活性研究 总被引:2,自引:0,他引:2
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利用PCR反应、DNA测序、基因重组等技术,构建了两个表达人粒细胞集落刺激因子cDNA的重组质粒pED-GCSF和pEF-GCSF,两质粒分别转染COS7细胞作瞬时表达,转染CHO-dhfr-细胞作稳定表达。结果两质粒在COS7细胞和CHO细胞均获得了表达,pED-GCSF转染COS7细胞48h、72h的表达量分别为5.2×104pg/ml和2.3×105pg/ml,pEF-GCSF转染COS7细胞后48h、72h的表达量分别为2.8×105pg/ml和1.4×105pg/ml。转染CHO-dhfr-细胞,随着加入的氨甲喋呤(MTX)浓度升高,CHO-dhfr+克隆数减少,但平均每个克隆的rhG-CSF表达量升高,在0.5μmol/L MTX下最高表达rhG-CSF细胞株的量是4.46μg/ml/3d。且表达的rhG-CSF注射小鼠腹腔可提高小鼠外周血白细胞的数量。 相似文献
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重组人肝刺激物在原核细胞中的表达与纯化 总被引:3,自引:0,他引:3
利用基因重组技术 ,构建成人肝刺激因子 (hHSS)和谷胱甘肽转移酶 (GST)融合表达载体 ,转化大肠杆菌BL 2 1(DE3 ) ,以His·Tag亲和层析纯化表达产物 ,FactorXa切割分离hHSS单体 ,并检测其生物学活性。结果显示 ,在pET 4 2a表达体系中hHSS以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在 ,GST hHSS表达量占菌体可溶性蛋白的3 0 % ;FactorXa切割GST与hHSS之间肽腱 ,得到 3 3和 15kD两条蛋白带 ,经Western杂交证实 3 3kD条带为GST ,而 15kD条带的分子量与hHSS基因序列推测蛋白结果相符。经His·Tag再次纯化可获得hHSS单体 ,初步证实重组hHSS具有促进肝癌细胞增殖活性 相似文献