离子交换法纯化α-淀粉酶抑制剂

采用离子交换法,利用弱碱性阴离子交换树脂D315吸附小麦粉初提液中的α-淀粉酶抑制剂,对其静态吸附以及洗杂洗脱条件进行研究。通过对静态吸附条件的摸索,得出静态下的最佳工艺条件:上样料液的蛋白质量浓度ρ0=2.5~3.5 mg/mL、pH=8.5~9.5、温度t=30℃、转速150 r/min。最佳洗脱条件:0.1 mol/L NaCl洗杂,0.5mol/L NaCl洗脱。在该条件下,α-淀粉酶抑制剂纯化倍数为4.25倍,收率为64.58%。     

环境因子对转基因鱼腥藻培养的影响

摇瓶中对转TNF-α基因鱼腥藻7120（Anabaenasp.PCC7120,pDC-TNF)混合培养条件进行了研究,在含蔗糖9g/L,NaNO32.25g/L的BG-11培养基混合培养时,得到最适培养条件接种量5%,光照强度为1000Lux,光/暗周期（光照时间/黑暗时间）12h/12h,温度25-30℃,自然初始pH值,100mL摇瓶装液量40mL,转基因鱼腥藻15d生物量可达到3g/L以上,可溶性蛋白含量接近30%,TNF表达水平大于22%,与自养相比,生物量增加82.06%,表达水平提高38.79%,证明混合营养型培养是转rhTNF-α基因鱼腥藻7120实现高密度,高表达培养的途径。     

生防细菌ML-3抗菌蛋白发酵条件的优化及其防治应用

明确菌株ML-3抗菌蛋白对马铃薯早疫病的防效效果,为马铃薯早疫病生物防治提供参考依据。本研究采用硫酸铵分级沉淀、琼脂扩散法、正交试验、田间试验以及16S rDNA系统进化分析相结合的方法对菌株ML-3产抗菌蛋白的较优碳源、氮源、发酵条件、最佳硫酸铵沉淀浓度、抑菌稳定性、马铃薯早疫病田间防效和分类地位进行了研究。结果表明:该菌株产生的抗菌蛋白最佳发酵液配方为2%马铃薯、1%蛋白胨和0.5%NaCl,最佳发酵条件为:初始pH值7.0、温度30℃、装液量400 mL/500 mL、接种量5 mL、发酵48 h;抗菌蛋白在温度≤60℃、pH值5-8和紫外照射36 h内具有良好稳定性,而且对K~+、Fe~(2+)、Zn~(2+)、Na~+稳定性较好;马铃薯早疫病防治的田间用药浓度为≥10 mg/L;使用16S rDNA序列可将该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌沙漠亚种(Bacillus subtilis subsp.inaquosorum)。说明菌株ML-3抗菌蛋白在防治马铃薯早疫病和生物农药开发中应用潜力明显。     

ＴＮＦ—α基因在鱼腥藻７１２０中的表达及其产物的亲和层纯化

用转入ＴＮＦ－α基因并稳定有达了４年多的丝状体蓝藻－鱼腥藻７１２０（Anabaena sp.PCC7120),研究比较了在培养液中氨源（NaNO3)和碳源（NaAc)对转基因灌生长和ＴＮＦ－α基因的不同影响,氨源能稳定外源蛋白的表达,而碳源则影响细胞壁的合成。通过比较不同的破碎细胞的方法,发现超声破碎得到的可溶性总蛋白含量和ＴＮＦ－α含量均要比冻融法高出１倍左右,经过细胸破碎、硫酸铵分级沉淀、常压离子交换液相色析后,除去杂蛋白及大量容易堵柱的糖类等物质,最后通过亲和柱层析,分离出了纯的目标蛋白－重组肿瘤坏死因子（ＴＮＦ－α）。经凝胶电泳鉴定为单一的谱带,分子量为１７kD。     

蚯蚓谷胱甘肽转硫酶分离纯化的初步研究

本研究利用闪提技术,通过连续两次硫酸铵沉淀与柱层析的方法从蚯蚓中提取了谷胱甘肽转硫酶(GST),对提取条件和GST性质进行了初步探究。结果表明,GST的提取条件为:p H值7.0,闪提时间30 s,料液比1∶8,连续两次硫酸铵沉淀选取最佳饱和度分别为40%和80%。提取的GST比活力达到了1.236 U/mg Pr,纯化倍数达到了14倍,收率17.7%。利用SDS-PAGE电泳,得到GST亚基分子量约为25 k Da,GST分子量约为50 k Da。GST保持稳定的p H和温度的范围分别为p H 5.0~9.0和温度0~40℃。     

疏水相互作用层析分离重组人干扰素α2b

目的采用疏水相互作用层析分离重组人干扰素α2b,去除干扰素样品中的二聚体,得到高纯度的干扰素用于进一步的研究。方法首先采用阳离子交换层析纯化复性重组人干扰素α2b,去除了大部分的杂蛋白,然后采用疏水相互作用层析纯化重组人干扰素α2b,去除复性过程中产生的错误折叠体和二聚体,并考察盐浓度、pH值、流速和洗脱液中尿素对疏水相互作用层析纯化效果的影响。结果硫酸铵初始浓度1.2 mol/L、缓冲液pH值6.0、流速2.5 mL/min、洗脱液中添加尿素浓度为2 mol/L时疏水相互作用层析纯化效果最佳。最终得到的重组人干扰素α2b非还原型SDS-PAGE电泳均呈单一条带。结论确定了疏水层析纯化重组人干扰素α2b的最优条件,成功提取到具有高活性、高纯度的重组人干扰素α2b纯品。     

相思豆毒蛋白的提取及毒理作用研究

目的:探索相思豆毒蛋白的最佳提取条件、蛋白含量、等电点及对动物的毒理作用. 方法:经pH 7.2磷酸缓冲液提取、浓度为30%、50%硫酸铵分级沉淀及甘油透析处理,从去壳相 思豆种子中提取得到相思豆毒蛋白,福林酚法测定蛋白含量,等电聚焦法测定相思豆毒蛋白等电点,小白鼠和家兔灌胃实验研究其毒理作用.结果:从去壳相思豆中 分离提取得到相思豆毒蛋白;相思豆毒蛋白的等电点为6.10和6.24.动物实验表明该毒蛋白对小白鼠、家兔具 有毒性.结论:磷酸缓冲液法是相思豆毒蛋白适宜的提取途径,相思豆毒蛋白对动物具有毒性.     

聚乙二醇沉淀联用双水相萃取法纯化蛋清溶菌酶的研究

研究以聚乙二醇(Polyethylene Glycol,PEG)沉淀法联用PEG-硫酸铵双水相萃取体系纯化蛋清溶菌酶的工艺。结果表明,向预处理的鸡蛋清液中加PEG 4000至质量分数为16%时,可选择性沉淀除去蛋清中98.1%的杂蛋白,随后向上清液中加硫酸铵溶液至其质量分数为4.32%,可以构建PEG-硫酸铵双水相体系,分离上相即得高纯度溶菌酶。该法所得产物中96.34%为溶菌酶,其余为PEG 4000,不含有其它杂蛋白,溶菌酶总回收率达70.2%,比活为25 000 U/mg。该法简便易行,易于放大,每毫克精制溶菌酶中仅残留36.6μg PEG 4000,生物安全性较高。     

白蜡虫卵蛋白酶解工艺的研究

本项目对白蜡虫(Ericerus pela)卵蛋白的酶解工艺进行了研究。通过正交试验确定木瓜蛋白酶为适宜的水解用酶,最佳用量为1.5%;酶解条件为酶解温度50℃,酶解pH值9.0,酶解时间24 h,原料与水比例为1∶20;试验结果还表明原料在酶解前经过预处理,蛋白水解率可提高20.7%,预处理条件为原料在20倍的1 mol/L盐酸溶液中,80℃恒温加热30 min;在确定的最佳条件下对白蜡虫卵进行预处理和酶解,蛋白水解率可达58.4%。     

尼泊尔酸模根中活性蛋白--凝集素特性初探

经实验得知尼泊酸模根中除含有其传统有效成分大黄素外,还具有活性蛋白--凝集素,能使3%兔红血球发生凝集反应;该活性蛋白在pH 8.0,0.05 mol/L Tris-HCl (1M NaCl)的缓冲液中血凝活性最强;经80%饱和度硫酸铵分级沉淀,沉淀中凝集素含量最高.     

絮凝法预处理透明质酸发酵液的研究

目的:提高透明质酸的纯度。方法:研究了絮凝预处理发酵液对醇沉法提取透明质酸的影响,并通过正交试验对预处理条件进行了优化。结果:明矾可作为最佳絮凝剂,正交实验最佳絮凝条件为:絮凝剂添加量1 000mg/L、絮凝温度30℃、絮凝转速60r/min、絮凝时间20min。在该条件下处理的HA发酵液相对于未经过处理的对照组,菌体去除率可提高42.6%,蛋白去除率可提高5.9%。     

超声波及脱蛋白处理对猴头菌子实体多糖提取效果的影响

本研究以猴头菌子实体为供试材料,在采用水提醇沉法进行多糖提取的过程中,系统研究了超声波和脱蛋白处理两个关键工艺环节对多糖提取效果的影响。研究结果表明：采用超声波辅助处理可提高猴头菌多糖提取率,降低多糖的纯度,使部分由蒸馏水洗脱获得的HEFP-α组分与全部0.1mol/L NaCl洗脱获得的HEFP-β组分经Sephacryl-S400洗脱后的曲线的小峰面积增加,也使主峰处的吸光值出现偏移。3种脱蛋白方法中,复合法对蛋白的除去效率最高,但多糖的保留率最低;亚铁氰化钾-乙酸锌法操作简便且蛋白除去率与多糖保留率均较高,但会使HEFP-β-2组分的含量和回收率降低;Sevage法蛋白脱除效率最低,多糖组分的保留率相对较高,且柱洗脱后发现经Sephacryl-S400凝胶柱分离后获得的主峰整体峰值较高,该方法较为适合多糖活性组分未知时的蛋白脱除。这一研究结果将会为该类大型真菌子实体的大分子生物活性物质的提取以及相关产品的开发提供重要的参考依据。     

碳氮源对转基因鱼腥藻Anabaena sp.PCC7120培养的影响

对碳源、氮源种类和用量对转rhTNF-α基因鱼腥藻7120（Anabaena sp.PCC7120）培养的影响进行了研究,发现最适碳源为蔗糖,最适氮源为NaNO3,最佳用量分别为9g/L和2．25g/L,此时生物量远高于自养方式,达2．52g/L,比相同条件下在BG－11培养基培养高71．66％,ATNF－α表达量为16％－22％,生物活性为10^5U/mg。     

应用痘苗病毒载体在动物细胞中高效表达人α-瘤坏死因子cDNA及其特性的研究

构建了含不同长度的人α-肿瘤坏死因子(hTNF-a)cDNA的两种重组痘苗病毒。hTNF-α cDNA插入痘苗病毒(天坛株)的tk区,在11k启动子的控制下,表达量可达1.6×10~7U/L,如果缩短hTNF-α cDNA起始密码子ATG与启动子之间距离并去除3′端非编码区,可使hTNF-α的表达量提高3倍。表达产物的细胞毒活性可被抗hTNF-α单克隆抗体所中和,免疫沉淀产物的SDS-PAGE有一特异性17kD的蛋白条带;同时,在细胞毒活性相同的前提下,哺乳动物细胞表达的hTNF-α的抗病毒活性高于大肠杆菌表达的hTNF-α。     

牦牛肝蛋白分离纯化及其抗氧化活性研究(英文)

新鲜牦牛肝匀浆、磷酸缓冲液抽提、硫酸铵分级沉淀,并采用响应面法对提取条件进行优化。在最佳提取条件下提取的粗蛋白经DEAE-52离子交换层析和Sephadex G-200凝胶柱洗脱得到7种不同的蛋白。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对各蛋白的分析结果,各蛋白均成单一条带表明纯化效果较好,其分子量分布在97.2 KD-116 KD之间。采用化学发光法对其在体外抗氧化活性研究,主要包括超氧阴离子自由基、羟自由基、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基的清除实验,结果表明几种蛋白均具有抗氧化作用,尤其蛋白5和蛋白1作用较为突出,在250 mg/L浓度时,对超氧阴离子的清除率为82.91%和72.92%。上述结果为牦牛肝作为抗氧化保健食品或功能食品的研究和开发提供了依据。     

耐有机溶剂果糖苷酶的胞外表达、纯化和结晶

【目的】克隆表达一种Arthrobacter arilaitensis NJEM01来源的耐有机溶剂β-呋喃果糖苷酶(β-FFase),纯化并进行结晶条件的研究。【方法】构建pelB信号肽与β-FFase融合表达质粒pET22b-pelB-bff,将其导入Escherichia coli BL21(DE3)中诱导表达,硫酸铵沉淀、DEAE阴离子交换色谱两步纯化重组蛋白,采用坐滴式气相扩散法对β-FFase进行结晶条件筛选和优化。【结果】构建重组质粒pET22b-pelB-bff,通过优化诱导表达条件,IPTG浓度0.1 mmol/L,诱导温度30 °C,诱导时间10 h,比活力高达108 U/mg,实现了果糖苷酶的胞外可溶性表达,纯化获得达到结晶纯度的β-FFase。结晶条件初筛和优化后获得可培养β-FFase晶体的条件为0.15 mol/L氯化钙,0.1 mol/L HEPES pH 6.7,26%聚乙二醇400。晶体衍射分辨率可以达到2.1 ?。【结论】高糖苷合成能力β-FFase表达纯化体系的构建和结晶条件的初步研究,为从结构生物学角度进一步研究果糖苷酶结构与功能的关系,定向进化提高糖苷酶转糖基活性奠定了基础。     

番石榴中结合多酚碱水解与酸水解法提取工艺优化的比较

以红心番石榴果肉的冻干粉末为实验材料,先提取游离多酚,剩下的残渣分别采用酸水解和碱水解法提取结合多酚。两种方法在单因素实验基础上,选择浓度、温度、时间这3个影响因素进行响应面设计。采用Design Expert 8.0.6.1软件进行响应面试验设计及数据分析,结果表明温度对结合多酚的得率影响显著,而且酸水解比碱水解获得的结合多酚多。最终确定为:碱水解最佳提取条件:Na OH浓度为7.24 mol/L,温度98.22℃,时间24.88 h,此条件下结合多酚得率为1.238%;酸水解最佳提取条件:HCl浓度为4.05 mol/L,温度94.87℃,时间29.95 h,此条件下结合多酚得率为2.002%。     

Rhodococcus ruber CGMCC3090腈水合酶纯化、酶学性质及结晶研究

Rhodococcus ruber CGMCC309菌株为酰胺酶及腈水解酶双重缺陷菌株,研究表明该菌能产宽泛底物特异性的腈水合酶。对该菌株产生的新型腈水合酶(NHase-3090)进行纯化和结晶,并研究了其酶学性质。采用疏水、离子交换及凝胶过滤3种层析方法,使该酶纯化倍数达到17.14,得率高达26.2%。电泳分析表明,全酶分子量为105 kDa,由α(24.3 k Da)和β(28.0k Da)2个亚基组成,并构成α2β2四聚体。酶的最适p H和温度分别为7.5和30℃。该酶明显受不同金属离子影响。动力学研究表明,Km为178.8 m M;Vmax为209.1μmol/L·min·mg。研究发现3种金属离子Zn~(2+),CO~(2+)和Cd~(2+)有利于酶蛋白结晶。结晶最佳条件是:采用112-34#试剂(0.05mol/L水合硫酸镉、0.1mol/L HEPS和1.0mol/L三水醋酸钠),蛋白质浓度为15 mg/ml,结晶温度为16℃,p H为7.5,结晶时间为30 d。腈水合酶蛋白单晶经X射线衍射,分辨率达到了3.7。该腈水合酶的纯化和结晶为进一步深入研究其结构和功能奠定了基础。     

黑米蛋白提取工艺的优化

以黑米为原料,研究黑米蛋白提取工艺的优化。采用"碱提酸沉"法,研究了提取液pH值、温度、搅拌速度、料液比、提取时间、及粒径大小等对黑米蛋白提取率的影响。在单因素试验的基础上,以L9(34)正交实验法优化黑米蛋白提取工艺。结果表明:各因素对黑米蛋白提取率的影响顺序依次为:pH值粒径料液比转速。本实验中,黑米蛋白提取的最佳工艺条件为:提取液p H 12.5、温度28℃、搅拌转速800 rpm、料液比1∶10 g/m L、提取时间为1 h、酸沉淀时间为1 h、粒径大小为能通过100目筛。优化后黑米水溶性蛋白提取率提高到96.77%,纯度为97.75%。     

猪圆环病毒2型病毒样颗粒的高效组装技术研究*

目的:探索猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒(VLPs)的高效组装技术,提高VLPs的稳定性。方法:利用大肠杆菌表达PCV2 Cap蛋白自组装为VLPs,分析不同离子强度下VLPs的稳定性。利用切向流技术添加尿素,降低pH,可使VLPs解组装,利用硫酸铵分级沉淀、阴离子交换层析纯化获得Cap蛋白,去除尿素,提高离子强度和pH,实现VLPs的高效再组装。结果:PCV2 Cap蛋白自组装VLPs在150mmol/L NaCl下稳定性较差,而在500mmol/L NaCl下可提高VLPs的稳定性,但仍较易发生聚集,核酸含量均较高。在150mmol/L NaCl、300mmol/L尿素和pH 5.5的缓冲体系条件下,能够使VLPs解组装。经25%~50%饱和硫酸铵(V/V)分级沉淀粗纯,阴离子交换层析500mmol/L NaCl下洗脱获得精纯Cap蛋白,蛋白质纯度≥95%,并能够有效去除核酸。通过切向流技术去除体系中的尿素,并将NaCl浓度提高至1mol/L、pH提高至8.0,改变蛋白质表面静电荷分布,实现VLPs的高效、均一再组装,组装效率≥99%,回收率为65.85%,并明显提高VLPs的稳定性,能够稳定保存6个月以上。结论:利用硫酸铵分级沉淀、阴离子交换层析纯化获得Cap蛋白,去除尿素,提高离子强度和pH,实现VLPs的高效再组装。