分枝杆菌质粒的研究进展

分枝杆菌质粒的研究进展张天民（武汉冶金医学高等专科学校,武汉４３００８０）质粒（ｐｌａｓｍｉｄ）为细菌胞浆中独立于染色体外的遗传单位,它能自主复制。质粒以环状双链ＤＮＡ形式存在,分子链末端以共价键与各自的另一粘末端相结合,呈闭合环或共价闭合环（ｃｏｖ...     

结核分枝杆菌Rv1884基因真核表达质粒的构建及表达

目的:构建结核分枝杆菌Rv1884基因真核表达载体。方法:PCR扩增Rv1884基因,测序正确后克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-);经酶切鉴定正确的重组质粒酶以阳离子聚合物转染P815细胞后,以RT-PCR方法检测mRNA的表达,以间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达。结果:构建了重组质粒pcDNA-Rv1884;RT-PCR结果证明Rv1884可在P815细胞中转录;用间接免疫荧光检测,表达有Rv1884蛋白的细胞着染。结论:构建了结核分枝杆菌Rv1884基因的真核表达载体pcDNA-Rv1884,Rv1884基因可以在P815细胞中表达。     

大肠杆菌质粒的快速提取

质粒的提取是生物学中的常规技术之一 ,但常规法提取质粒十分复杂 ,繁琐并且费时。国外公司的试剂盒大大简化了此过程。但价格使国内大多数实验室难以承受。我们利用自制的玻璃粉提取质粒 ,大大简化了提取过程 ,同时相对于进口试剂盒而言 ,实验成本也大大降低     

碱裂解提取质粒DNA的改进

碱裂解提取质粒DNA是分子生物学实验中常用的方法,但通常方法所提取的质粒往往含有大量的RNA和其他杂质.本文适时加入较高浓度的RNA酶和适当延长冰浴时间,结果得到了几乎没有RNA和其他杂质的高纯质粒DNA,不仅达到了分子生物学实验要求,而且可用作抗原检测抗dsDNA抗体.该法操作简单、经济、实用.     

结核分枝杆菌核酸疫苗的构建及其小鼠免疫效果观察

将结核杆菌ＥＳＡＴ－６和ＭＰＴ－６４的编码基因分别插入真核表达载体ＪＷ４３０３构建重组质粒,用重组擀凿对４周龄的ＢＡＬＢ／Ｃ和Ｆ１代小鼠进行肌肉和皮内地末次免疫后１０天采血交分离血清,进行ＥＬＩＳＡ检测。结果表明,小鼠能产生较强的体液免疫,特异性ＩｇＧ平均水平分别为参考血清的２．２０倍３．１９倍,且对两种品系小鼠进行的相同途径的免疫,其抗体水平差异不显著,而不同途径的重组质粒免疫,抗体水平略有差异     

碳裂解提取质粒DNA的改进

碱裂解提取质粒DNA是分子生物学实验中常用的方法,但通常方法所提取的质粒往往含有大量的RNA和其他杂质,本文适时加入较高浓度的RNA和适当延长冰浴时间,结果得到了几乎没有RNA和其他杂质的高纯质粒DNA,不仅达到了分子生物学实验要求,而且可用作抗原检测抗dsDNA抗体,该法揉作简单,经济,实用。     

质粒提取

这里所介绍的方法已成功地用来提取不同菌株中的各种质粒。一般来说,质粒愈小,效果愈好。因为随着质粒分子量的增加,其性质就愈来愈接近宿主DNA的性质。对于大于25kb的质粒分子,用此方法分离是非常困难的,而且得率较低。然而,通常用于克隆的所有质粒相对来说是较小的,因而此方法可获得良好的结果。     

碱裂解法提取质粒DNA的研究

对质粒DNA及其结构、形态和功能进行了综述 ,介绍了碱裂解法提取质粒DNA的基本步骤 ,并对其提取过程中的注意事项进行了剖析 ,分析比较了不同提取方法的优点     

溃疡分枝杆菌、溃疡分枝杆菌素与溃疡分枝杆菌毒素

1948年,MacCALLUM在澳大利亚东南沿海维多利亚一个儿童的腿部溃疡中分离到一种新的分枝杆菌,并称之为溃疡分枝杆菌（Mycobacterium ulcerans）,并证明是这种溃疡的病原菌。这种由溃疡分枝杆菌引起的皮肤感染主要存在于热带、亚热带地区,尤以西非地区更盛,具有地方性流行,现在通常称谓Bumli溃疡,中国也有发现,世界卫生组织（WHO）已组建全球Buruli溃疡行动委员会,开展对该病的防治研究,现已认为溃疡分枝杆菌感染（Bundi溃疡）是一种新发的感染病。     

一种快速提取大质粒的方法

本文介绍一种快速提取大质粒的方法。应用该方法,对含有pTA1,R68.45,RP(?)Tn501,pUB307,RP_4,pJRD215和pTr30质粒的多能硫杆菌(Thiabacillus versius)、氧化硫硫杆菌(Thiobacillus thiooxidans)和大肠杆菌(Escherichia coli)进行了质粒提取。结果表明,该方法提取的质粒条带清晰,分辨率高,而且重复性好。     

一种提取质粒DNA的改良方法

本文详细介绍了一种改良碱裂解法提取质粒ＤＮＡ的方法,该法采用ＮＨ４Ａｃ代替苯酚和氯份的抽提过程,得率高,质量好,完全达到了分子生物学常规实验的要求,如酶切、连接、转化大肠杆菌、ＰＣＲ等,甚至用于序列测定和植物遗传转化,该法重复性好,操作简单、实用．     

大肠杆菌-分枝杆菌分泌型穿梭表达质粒pBCG-SP-HSP65的构建及人结核杆菌HSP65的表达

用PCR技术从Bacillus Calmetteguérin(BCG)基因组中扩增出抗原85B(Ag85B)的信号肽(SP)DNA序列,从pCMVMTHSP65质粒中扩增出人结核杆菌HSP65全长基因。利用DNA重组技术将以上两个片段插入质粒pBCG2100的人结核杆菌HSP70启动子下游,构建成分泌型原核穿梭表达质粒(pBCGSPHSP65)。酶切鉴定、PCR和测序分析结果均表明分泌型原核穿梭表达质粒pBCGSPHSP65构建成功。利用电穿孔将该质粒转入耻垢分枝杆菌(Mycobacterial smegmatis, MS)中,用卡那霉素筛选出阳性重组子。经热诱导后用SDS-PAGE观察到在耻垢分枝杆菌中65kD蛋白占总蛋白的20%,而在重组耻垢分枝杆菌表达的65kD蛋白占菌体总蛋白的34.46%,占裂解物上清总蛋白的68.56%,表明重组的HSP65基因能在耻垢分枝杆菌中高效表达,表达的蛋白大部分以可溶状态存在。通过Westernblot证实分泌的该蛋白能与结核杆菌HSP65的抗体特异性结合,说明该重组蛋白具有HSP65的生物学活性。     

直接用酚和氯仿快速提取质粒

质粒的提取是分子克隆技术中最关键的步骤之一,在对大量样品的抽提和筛选时工作量很大。提取质粒的方法很多,有碱裂解法、煮沸法等「１」,所用试剂较多,耗时较长,这些方法均要用酚和氯仿抽提以去除菌体蛋白,以免影响酶切分析。Ｂｉｊｉ,Ｔ,Ｋｕｒｉｅｎ等（１９９４）提出用乙醇溶菌法快速提取质粒,作者试验多次结果均不理想,经过改进直接用酚和氯仿溶解菌体来快速提取持粒,得到了满意的结果。用该法提取质粒ＤＮＡ,产量     

芘降解质粒提取方法的研究

采用碱裂解法、化学改良方法、CTAB法、酚氯法等4种方法提取从泉州红树林沉积物中筛选出多环芳烃降解菌群YL的质粒,并分别转化至大肠杆菌感受态细胞,然后采用富集筛选的手段,最终确立最佳方案得到一组质粒转化菌群.该转化菌群可以利用芘作为其生长的惟一碳源和能源,并能在21 d内将50 mg·L-1的芘降解85.69%.而受体菌E.coli DH5α的芘降解率仅为2.006%.由此可以证明,降解质粒已成功转化进宿主细胞,并发挥降解作用.YL的质粒含有降解芘的基因.     

用异丙醇沉淀法快速提取质粒DNA

质粒 (plasmid)是 1种染色体外的稳定遗传因子 ,大小在 1～ 2 0 0 kb之间 ,具有双链闭合环状的 DNA分子 ,主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。它可将有用的外源基因通过基因工程的手段送入细胞中进行繁殖和表达 ,是分子生物学实验中常用的工具。制备质粒 DNA的方法有许多 ,但大多需要苯酚、氯仿抽提以除去蛋白 ,而饱和酚的配制及氯仿等有机溶剂的挥发性气味给以学生为主体的教学实验带来了诸多不便。我们经过实验 ,提出了一种快速提取质粒的方法 ,该方法避免了上述不便并可提取足够量的较纯的质粒 ,在限制性内切酶酶切、DNA转接中可以…     

乳酸菌天然质粒提取方法的优化

将前人报道的乳酸菌质粒提取方法与大肠杆菌质粒提取方法相结合,对常用试剂盒质粒提取方法进行改进,建立了一种快速、安全、高效的乳酸菌质粒提取方法。提取过程中,溶菌酶最佳浓度为20mg/ml,最佳处理时间为30min,同时避免了毒性物质溴化乙锭的使用。多次实验结果表明,采用改进后的方法可明显提高乳酸菌天然质粒的提取效果。且重复性好,为下一步乳酸菌的分子改良奠定了基础。     

碱裂解法提取细菌质粒DNA的改良

碱裂解法是目前最为广泛应用的细菌质粒DNA的提取方法。但该法提取DNA所需时间较长,通常需要2h以上。为了快速提取质粒DNA,对常规碱裂法中溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、RNA酶A及无水乙醇的反应时间由原来的5min,5min,10min,30min,10min分别缩短至5s,1min,5s,10min,5min。这种改良方法极大地缩短了DNA的提取时间,可在30min内完成整个DNA的制备,且制备的DNA可直接应用于进一步的酶切,连接及PCR等各种分子生物学分析。     

苏云金芽胞杆菌内生质粒提取方法的改进

改进了苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）内生质粒提取技术,提取了Bt库斯塔克亚种、以色利亚种和一株对鳞翅目害虫有活性的野生菌株的质粒,利用琼脂糖凝胶电泳分析了质粒图谱,进一步检测了质粒的浓度与纯度。实验结果表明,该方法与传统技术相比,操作简单、耗时短,提取的质粒纯度高、条带清晰,染色体DNA污染较少。为Bt杀虫基因克隆、质粒特性分析等研究创造了有利条件。     

大肠杆菌质粒DNA提取方法的优化

目的:简化操作流程,缩短提取时间,降低试验对操作者的危害。方法:该方法去除酚、氯仿等有害试剂,采用LiCl沉淀去除质粒制备物中小片段核酸(包括DNA和RNA);工程菌生长至对数期时通过加入氯霉素后不仅方便质粒DNA的提取过程中蛋白质的去除,而且可使质粒的拷贝数进一步增加,提高质粒DNA产量的目的。结果:实验改进方法所提取的质粒DNA产量高于常规方法,达到20μg/mL。结论:改进方法提取的质粒DNA,其下游的内切酶消化,PCR、重组质粒鉴定、转化大肠杆菌等实验的结果和重复性都令人满意,完全可用于一般的分子生物学研究。     

农杆菌质粒DNA提取方法的优化

目的：为了减化操作过程,减少药品对操作人员有直接或间接危害,提高农杆菌质粒DNA的产率和实验结果的稳定性。方法：对常规碱裂解法进行了改动,改进的方法通过加大菌液的收集量,利用LiCl沉淀RNA,简化操作流程和严格反映环境条件,并且在操作过程中去除了酚、氯仿等对人体有害的试剂。结果：提取时间缩短,结果稳定,产率在1．5μg／μL以下。结论：用这种方法提取的质粒可以满足大多数分子生物学常规实验如DNA的酶切、PCR鉴定的要求。