肝癌组织及细胞系总RNA抽提逆转及基因克隆方法的改进与比较

本文建立了高效肝组织及细胞总RNA抽提、反转录以进行基因克隆和实时定量PCR（q-RT-PCR）的方法。 比较了2种反转录酶(M-MLV和SuperScriptII)、2种cDNA合成引物(Oligo dT和random 6 primer)对总RNA反转录效率的影响,与4种DNA聚合酶（Taq聚合酶、Pfu聚合酶、LA taq聚合酶、Prime Star聚合酶）进行长片段基因克隆的能力及效率;同时,该研究比较了不同质量总RNA对有效进行q-RT-PCR与长片段分子克隆的影响。新建立的RNA提取方法使得RNA完整性和均一性提高。RNA的完整性及均一性对长片段cDNA的克隆至关重要。部分降解的组织RNA及细胞RNA仅适合于q-RT-PCR检测mRNA的表达水平,而不适合于cDNA的克隆。     

利用Taq DNA聚合酶反转录cDNA第一链的研究

应用Taq DNA聚合酶(Thermus aquaticus DNA polymerase)直接对RNA进行反转录成cDNA第一链,然后用特异引物进行PCR扩增,结果表明,反转录达到AMV逆转录酶的效果,且可能得到比AMV逆转录酶更完整的cDNA第一链。     

植物RNA聚合酶Ⅳ调控DNA甲基化和发育的研究进展

DNA甲基化是一类稳定可遗传的表观遗传修饰,在调控基因表达、沉默转座子和维持基因组稳定性等方面发挥重要作用。植物中,DNA从头甲基化通过RNA指导的DNA甲基化(RNA-directedDNAmethylation,RdDM)途径建立。植物特有的DNA依赖的RNA聚合酶Ⅳ(DNA-dependent RNA polymerase Ⅳ, Pol Ⅳ)是RdDM途径核心蛋白,转录产生非编码RNA,通过RdDM途径引导从头建立DNA甲基化,进而调控植物基因表达和生长发育。Pol Ⅳ行使功能受多个蛋白调控：组蛋白阅读器SHH1 (SAWADEE homeodomain homolog 1)识别H3K9甲基化引导Pol Ⅳ到基因组特定位点;染色质重塑因子CLSY (CLASSY)蛋白家族协助Pol Ⅳ识别靶位点;RNA依赖的RNA聚合酶2 (RNA-dependent RNA polymerase 2, RDR2)将Pol Ⅳ转录产生的单链RNA转换成双链RNA。本文总结了Pol Ⅳ及其调控蛋白调控植物DNA甲基化和发育的研究进展,以期为DNA甲基化研究和农作物育种提供参考。     

乙型肝炎病毒聚合酶基因B区和C区序列的异质性

乙型肝炎病毒(HBV)聚合酶基因编码约816个氨基酸的多蛋白,其氨基端为末端蛋白,羧基端为RNA酶H,后者上游紧邻反转录酶/DNA聚合酶.通过计算机模拟分析将HBV聚合酶基因分为假想的A到E共5个区段.     

RNA聚合酶监视的DNA修复机制

生物体在正常生命过程中面临内/外因来源的DNA损伤,DNA损伤不仅影响基因正确复制,也阻碍其正常转录.为避免DNA损伤带来的灾难性后果,生物体进化出一整套修复机制,以保证复制和转录的正确性、基因组的完整性和遗传的稳定性.本文重点综述了RNA聚合酶监视(RNA polymerase-surveilled,RNAP-S)的DNA修复机制.首先从RNA聚合酶(RNA polymerase,RNAP)的结构出发介绍了RNAP对DNA损伤的感知机制;其次讨论了滞留RNAP的回溯、与其模板DNA的解离以及后续修复机制的启动,真核细胞科凯恩综合征B蛋白(Cockayne syndrome protein B,CSB)及其泛素化和8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶1 (8-oxoguanine DNA glycosylase1,OGG1)介导的RNAP-S修复;最后探讨了RNAP-S损伤修复的生物学意义并展望其前景.     

转录 反转录

有机体的遗传信息一般都编码在由缠绕成双螺旋的两条长链所组成的脱氧核糖核酸(DNA)分子上,由四个码编成,这四个码是不同的化学单位,叫做碱基。在正常细胞中要合成某种蛋白质,遗传信息是以DNA为模板,根据碱基互补的原则合成与它对应的单链分子核糖核酸(RNA),然后再从RNA链译成特定的蛋白质分子。即由DNA→RNA→蛋白质。由DNA→RNA称为“转录”,由RNA→蛋白质称为“翻译”。反转录是遗传信息以RNA为模板合成DNA,即同上述信息的转移从DNA→RNA这一经典过程相反,因此称“反转录”。例如,在RNA肉瘤病毒进入机体后,通过依赖于病毒RNA的DNA多聚酶,以病毒RNA为模板合成DNA,然后再以DNA     

大肠杆菌中依赖于DNA的RNA聚合酶的提取

在细菌和其他动植物细胞中都普遍存在着一种以DNA作为模板,利用四种核糖核苷三磷酸作为底物来合成RNA的酶,这种酶叫做依赖于DNA的RNA聚合酶[E.C.2.7.7.6]。从细菌中提取这种酶的方法不少,但以Cham-berlin和Berg以及Burgess的方法使用最为普遍。我们主要参照Burgess氏的方法以大肠杆菌K12(E.coli K 12)中提取RNA聚合酶,并稍加改变。     

高等植物线粒体DNA的制备方法

自从六十年代发现线粒体DNA(mtDNA)以来,mtDNA在遗传上的功能引起了广泛的重视。由于线粒体具有自已的基因组,能够自我复制,又能编码一些酶,比如生物氧化链上的一部分酶的亚基就是由线粒体基因编码的,可以推测生物的某些性状的表达可能与mt-DNA有关;另外由于实现线粒体基因组的复制与表达所需的许多酶又是由核基因编码的(如DNA聚合酶,RNA聚合酶、DNA连接酶等),可以推测     

真核DNA聚合酶ε

真核DNA聚合酶ε(DNA polymerase ε, DNAP ε)从1970年发现至今已进行了较为深入的研究,但目前该酶确切功能尚不清楚.该文介绍DNAP ε各个亚基的结构与功能,以及与其相互作用的蛋白质,并介绍DNAP ε可能具有的功能,包括DNAPε在非催化方面的功能.DNAP ε(尤其是最大亚基的C端结构域)可能作为一种“桥梁“或“中继站“,为多种重要蛋白质发挥作用提供一个平台.     

DNA复制和表达过程中的“水”

遗传信息的传递和表达主要指DNA复制、RNA转录和蛋白质翻译,属小分子单体物聚合成大分子物的过程。以文献、资料为依据,发现主要由DNA聚合酶、DNA连接酶和RNA聚合酶参与的DNA新链合成过程,由RNA聚合酶催化的RNA链延伸过程,以及由氨酰-tRNA酶、转肽酶等参与的肽链形成过程中均没有水的形成。     

枯草芽孢杆菌全长引物酶的溶液结构研究（英文）

在细菌DNA复制中,Dna G引物酶合成RNA引物,然后合成的引物通过DNA聚合酶进行延伸. Dna G引物酶由3个结构域组成,N端锌结合结构域(zinc-binding domain,ZBD)、RNA聚合酶结构域(RNA polymerase domain,RPD)和C端解旋酶结合结构域(helicase binding domain,HBD).在合成引物的过程中,引物酶的3个结构域协同作用,缺一不可.尽管引物酶3个结构域的结构均已有研究报道,但到目前为止,引物酶的全长结构尚不清楚.我们在上海光源利用小角X射线散射技术研究了枯草芽孢杆菌全长引物酶的溶液结构,首次构建了全长引物酶结构模型.我们发现,枯草芽孢杆菌引物酶在溶液中处于伸展状态,且ZBD和HBD结构域相对于RPD结构域呈现出连续的构象变化.本文研究表明Dna G引物酶中的结构域重排可能有助于其在DNA复制中发挥功能.     

抗菌素在生化研究过程中的应用

一、前言抗菌素作用机理的研究和分子生物学的发展是相辅相成的。分子生物学的发展为从分子水平上研究抗菌素的药理学提供了研究方法,从而把这门科学由细胞水平导向了分子水平,形成了分子药理学;抗菌素又为分子生物学的研究提供了良好的工具。例如Temin发现反转录酶,或RNA指导的DNA多聚酶,主要就是利用了放线菌素D。     

枯草芽孢杆菌全长引物酶的溶液结构研究

在细菌DNA复制中,DnaG引物酶合成RNA引物,然后合成的引物通过DNA聚合酶进行延伸. DnaG引物酶由3个结构域组成,N端锌结合结构域（zinc-binding domain,ZBD）、RNA聚合酶结构域（RNA polymerase domain,RPD）和C端解旋酶结合结构域（helicase binding domain,HBD）. 在合成引物的过程中,引物酶的3个结构域协同作用,缺一不可. 尽管引物酶3个结构域的结构均已有研究报道,但到目前为止,引物酶的全长结构尚不清楚. 我们在上海光源利用小角X射线散射技术研究了枯草芽孢杆菌全长引物酶的溶液结构,首次构建了全长引物酶结构模型. 我们发现,枯草芽孢杆菌引物酶在溶液中处于伸展状态,且ZBD和HBD结构域相对于RPD结构域呈现出连续的构象变化. 本文研究表明DnaG引物酶中的结构域重排可能有助于其在DNA复制中发挥功能.     

体外培养的红白血病细胞中Friend病毒合成的研究

Friend 白血病毒(FLV)是有双层套膜的C 型 RNA 肿瘤病毒,由受感染的细胞芽生。成熟的病毒颗粒呈圆形,直经约100毫微米,电子密度深的拟核含 RNA 和蛋白质,RNA 单链,约占病毒的1%。成熟的小鼠白血病病毒有类似鸟类髓细胞白血病病毒基因组的结构,两个35S 亚单位约为3×10~6道尔顿,RNA 分子量为10—12×10~6道尔顿。这类 RNA 肿瘤病毒(Oncorna 病毒)都含有反转录酶,它的合成受病毒基因组中 pol 基因的控制。基因组     

兔子宫内膜细胞DNA指导的RNA聚合酶Ⅱ的分离及其特性研究

从兔子宫内膜细胞分离了DNA指导的RNA聚合酶Ⅱ,建立了以兔子宫内膜细胞DNA为模板,以四种核苷三磷酸为底物的转录系统。观察了几种底物,各种离子,放线菌素D,RNase等因素对聚合酶Ⅱ转录活力的影响;研究了不同的离子浓度、酸碱度、反应时间、酶含量、模板DNA量及肝素、亚精胺对转录活力的影响。     

昆虫杆状病毒的增强子(Enhancer)

人们早已发现,许多真核细胞DNA、动物病毒DNA和RNA肿瘤病毒基因组具有一种基因调控序列,能增加它所连接基因的转录效率,这种核苷酸序列称之为增强子或激活子(Enhancer或Activator)。最近,美国科学家Guarino和Summers等人首次发现昆虫杆状病毒苜蓿尺蠖丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus,AcNPV)基因组中有散在分布的增强子序列。它们是一种特殊方式的核苷酸重复序列,可大大增加病毒延迟早期基因(Delayed-Early Gene)的转录效     

中国科学院上海细胞生物学研究所1987年招考硕士研究生试卷(续)

3.在反馈抑制中,代谢的最终产物通常抑制合成代谢途径中(1)第一酶的基因(2)最后一个酶的基囚或(3)中间的酶的基因表达。 4.如果已知一个DNA分子的(A十T)/(G十C)的比例为1,你能否说出这是一个(1).双链,或(幼单链DNA分子,或(3)需要更多的信息。 5.在细菌中已发现了三种DNA聚合酶、三者都参与DNA的复制,进一步的研究成果表明(1) DNA聚合酶I,或(2) DNA聚合酶兀,或(3) DNA聚合酶皿。实际上是一个DNA的修复酶。 6.线粒体中的功能蛋白是完全由(1)线粒体的基因组编码的,(2)核内基因组编码的(3)还是由两者共同编码的。.真核细胞RNA聚合…     

随机聚合酶链反应检测未知病毒方法学的建立

目的 探索并建立一种用于快速检测未知病毒的分子生物学方法。 方法 分别以乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）为假定的未知DNA、RNA病毒,验证随机聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）检测未知病毒的可行性。分离HBV、HCV的阳性血清,去除宿主DNA后,提取病毒核酸。锚定随机引物经Klenow酶处理（模板为DNA）或反转录酶作用（模板为RNA）退火至模板,随后用锚定特异引物对模板进行非特异性扩增。扩增产物经纯化后克隆、测序,最后与BLAST进行比对。结果 经BLAST比对证实,插入序列中有HBV和HCV的基因组片段,在病毒拷贝数为1&;#61620;106拷贝/ml时,被检测克隆的阳性率约为15%。目前我们利用本法能达到的检测低限大致为1&;#61620;104拷贝/ml。 结论 成功建立了一种基于随机PCR的未知病毒检测方法,其优点在于不依赖病毒的细胞培养及其核酸序列信息。此种方法的建立为快速诊断不明原因疾病和新发传染病病原体提供了新的思路。     

玉米雄性不育的基因表达与调控 Ⅰ.克隆化玉米线粒体DNA的离体转录

我们用克隆化的玉米线粒体DNA(mtDNA)为转录模板,以玉米RNA聚合酶B为转录酶建立起一个无细胞离体转录系统。这是首次用克隆化DNA为模板,以植物RNA聚合酶B建立起的无细胞离体转录系统。     

高等真核生物RNA聚合酶B免疫方法研究

在真核生物中,关于依赖于DNA的RNA聚合酶(依赖于DNA的RNA聚合酶A、B、C,以下统简称为A酶、B酶、C酶)免疫特性的研究对于了解酶的结构、功能、在细胞中的分布以及在生物进化过程中的变化都具有重要意义。在A酶、C酶以及低等真核生物的B酶的研究中都有不少成功的报道。然而,也有许多作