多聚核苷酸的合成与研究 Ⅳ.用改进的二酯法化学合成d-pCpCpCpA

用改进的二酯法化学合成了几个脱氧寡核苷酸片段(d-_pC_pC,d-_pC_pC_pC,d-_pC_pC_pC_pA)。改进的主要之点是:(1)全部脱去保护基后柱分离,以克服在柱分离时寡核苷酸的保护基引起的亲脂性;(2)对所需的寡核苷酸片段重上适当的保护基,以作下一步的合成之用,于是避免了原先二酯法的操作中保护基的不希望有的丢失。用改进二酯法获得的寡核苷酸,产率和纯度得到提高和改善。虽然此改进目前仅用来合成寡核苷酸短片段,但可能提供用3′-5′磷酸二酯键方式连接两天然DNA短片段的途径。     

多聚核苷酸的合成与研究 Ⅱ.六脱氧核糖核苷酸的化学合成与抽提分离

用均三甲基苯磺酰氯(MS)作缩合剂,合成了二个六脱氧核糖核苷酸(d-_(MMT_r)G~(Bz)_pA~(Bz)_pC~(An)_pG~(Bz)_pA~(Bz)_pG~(Bz)和d-(MMT_r)T_pC~(An)_pG~(Bz)_pA~(Bz)_pA~(Bz)_pC~(An)),脱去保护基后经双向同系层析测定核苷酸排列顺序,完全符合实验设计要求(d-GpApCpGpApG和d.TpCpGpApApC)。上述二个带保护基的六脱氧核糖核苷酸合成的每一步,都是采用溶剂抽提方法分离的,大大简化了分离的步骤和缩短了分离的时间,便于脱氧寡核苷酸的大量制备。此法也适用于其他带保护基寡核苷酸的制备,不论其三苯甲基衍生物基团在5’端或3’端(例如如d-_pG~(Bz)_pA~(Bz)_(-ODMT_r))。     

多核苷酸的合成与研究——Ⅴ.一种由3′端向5′端延伸的脱氧寡核苷酸的化学合成与抽提分离的新方法

化学合成特定顺序的DNA片段,目前除广泛采用三酯方法外,对二酯方法的合成与分离也作了不少的研究。为了用抽提法制备5′端带磷的片段,有些实验室曾采用三苯甲基苯硫乙醇、三苯甲基对胺基苯酚及三苯基苯胺等来保护5′端磷酸基,但这些磷酸上的保护基脱落条件比较复杂,产物回收也不够理想,抽提分离的片段长度一般在二核苷二磷酸。本文则用DMT选择性地保护5′核苷酸的3′羟基,抽提制备了脱氧二核苷二磷酸dpG~(BZ)pA~(BZ)-ODMT和脱氧四核苷四磷酸dpC~(An)pG~(Bz)pG~(BZ)pA~(Bz)-ODMT片段。     

多聚核苷酸的合成与研究 Ⅱ.六脱氧核糖核苷酸的化学合成与抽提分离

用均三甲基苯磺酰氯(M8)作缩合剂,合成了二个六脱氧核糖核苷酸(d-_(MMTr)G_p~(Bz)A_p~(Bz)C_p~(An)G_p~(Bz)A_p~(Bz)G_p~(Bz)和d-_(MMTr)C_p~(An)G_p~(Bz)A_p~(Bz)A_p~(Bz)C_p~(An))*,脱去保护基后经双向同系层析测定核苷酸排列顺序,完全符合实验设计要求(d-G_pA_pC_pG_pA_pG和d-T_pC_pG_pA_pA_pC)。上述二个带保护基的六脱氧核糖核苷酸合成的每一步,都是采用溶剂抽提方法分离的,大大简化了分离的步骤和缩短了分离的时间,便于脱氧寡核苷酸的大量制备。此法也适用于其他带保护基寡核苷酸的制备,不论其三苯甲基衍生物基团在5′端或3′端(例如d-_pG_p~(Bz)A_(ODMTr)~(Bz))。     

限制性核酸内切酶BamH1的识别顺序 dG_pG_pA_pT_pC_pC 的化学合成

本文报道用硅胶柱层析分离二酯法合成产物的新方法及限制性核酸内切酶BamH 1接头dG_pG_pA_pT_pC_pC 的化学合成。其合成路线是:(1)以溶剂抽提法制备MMTrG_p~(Bz)G_p~(Bz)A~(Bz)-OH,其3'-OH 以磷酸氰乙酯和MSCl 反应磷酸化得到MMTrG_p~(Bz)G_p~(Bz)A_p~(Bz)(Ⅰ);(2)用硅胶分离法制备MMTrT_pC_p~(An)C~(An)-OAC,脱去5'-MMTr 保护基后得HO-T_pC_p~(An)-OAC(Ⅱ);(3)Ⅰ与Ⅱ缩合,脱去保护基后制得dG_pG_pA_pT_pC_pC(图2)。硅胶层析法与抽提法比较,前者有较高的分离效力和速度,并且产品中所含色素较少。硅胶层析法和3'-OH 磷酸化方法的应用,加快了DNA 短片段的合成。     

限制性核酸内切酶BamH1真的识别顺序dG_pG_pA_pT_pC_pC的化学合成

本文报道用硅胶柱层析分离二酯法合成产物的新方法及限制性核酸内切酶BamH1接头dG_pG_pA_pT_pC_pC的化学合成。其合成路线是:(1)以溶剂抽提法制备MMTrG_p~(Bz)G_p~(Bz)A~(Bz)-OH,其3'-OH以磷酸氰乙酯和MSCl反应磷酸化得到MMTrG_p~(Bz)G_p~(Bz)A_p~(Bz)(Ⅰ);(2)用硅胶分离法制备MMTrT_pC_p~(An)C~(An)-OAC,脱去5'-MMTr保护基后得HO-T_pC_p~(An)C~(An)-OAC(Ⅱ);(3)Ⅰ与Ⅱ缩合,脱去保护基后制得dG_pG_pA_pT_pC_pC(图2)。硅胶层析法与抽提法比较,前者有较高的分离效力和速度,并且产品中所含色素较少。硅胶层析法和3'-OH磷酸化方法的应用,加快了DNA短片段的合成。     

人绒毛膜促性腺激素β链(β-HCG)羧端基因片段人工合成和表达的研究——Ⅰ.用改进的三酯法化学合成脱氧十二核苷十一磷酸dCCACAATGATAG

本文报道改进的三酯法的建立,并用此法化学合成了脱氧十二核苷酸dCCACAATGAT-AG。其改进之点包括:(1)采用较稳定的保护基,如以对甲氧三苯甲基(MMT)保护核苷的5′羟基,以苯甲酰基保护鸟核苷碱基上的氨基;(2)以3′和5′羟基都不保护的核苷或片段作中间体,它们容易制备,也容易从产物中分离除去;(3)采用高效和稳定的均三甲基苯磺酰硝基三唑为缩合剂;(4)以7M尿素中性(pH7.5)和酸性(pH3.5)阴离子交换柱层析结合使用,分离纯化得到较纯的完全脱去保护基的最终产物,避免了高压液相柱层析的应用。     

脑啡肽基因的合成——Ⅰ.d-GATCCTAGA的合成

本文报道了脑啡肽基因下链二十六核苷酸中九核苷酸d-GATCCTAGA的合成。合成系采用改良的三酯法,即先合成和三个片段,然后由脱去5'-Dmt基后依次同和向5'端延伸缩合得到产物和是通过和分别同过量的d-T缩合,然后再用对氯苯磷酰双三唑对产物的3'-OH进行磷酰化得到。则是由同反应得到。在所有的缩合反应中,都采用2,4,6-三甲基苯磺酰硝基咪唑为缩合剂,缩合产物都以硅胶短柱层析分离纯化。除保护的九核苷酸未进行硅胶柱层析纯化之外,各中间片段经硅胶柱层析纯化后的收率都在75%以上。合成的全保护九核苷酸用浓氨水和80%醋酸相继脱去全部保护基后,以DEAE-葡聚糖凝胶A-25柱层析(含7M尿素)分离纯化,经去盐后得到d-GATCCTAGA,收率31.7%。产物的5'-OH用~(32)P标记后,同系层析均一,蛇毒磷酸二酯酶部分酶解后,作电泳-同系层析双向图谱,证明核苷酸排列顺序正确。     

脑啡肽基因的合成——Ⅱ.d-GGAAACCA的合成

本文报道了脑啡肽基因下链26核苷酸中八核苷酸片段d-GGAAACCA(10～17)的合成。合成系采用改良的三酯法,先合成和,再用对氯苯基磷酰二氯在1,2,4-三氮唑存在下磷酰化得到和,然后由bzAobz开始,依次同和缩合得到。在所有的缩合反应中,缩合剂均采用2,4,6-三甲基苯磺酰硝基咪唑。所得的全保护八核苷酸用浓氨水和80%醋酸脱去保护基后再经DEAE-葡聚糖凝胶A-25(7M尿素)柱层析分离纯化并去盐后,即得到d-GGAAACCA。产物经5'-~(32)P标记后,同系层析均一,蛇毒磷酸二酯酶部分酶解后的电泳-同系层析双向图谱能够得到预期的核苷酸排列顺序。     

酵母丙氨酸转移核糖核酸分子中一个十三核苷酸片段(顺序23～35)CpGpCpm_2~2GpCpUpCpCpCpUpUpIpGp的合成

以CpGpCpm_2~2G、CpUpCpC、CpUpUpI和Gp为原料,采用T_4RNA ligase催化连接的方法,通过用3′-端带有起保护怍用的磷酸单酯的寡核苷酸作供体(途径A)以及除最后一步外各步都用3′-端是自由OH基的寡核苷酸作供体(途径B)的两种途径,都合成了酵母丙氨酸转移核糖核酸分子中一个十三核苷酸片段(顺序23～35)CpGpCpm_2~2GpCpUpCpCpCpUpUpIpGp。产率较高。产物的连接点、末端和序列都经过严格鉴定。研究表明,位于受体分子3′-端的稀有嘌呤核苷m_2~2G对T_4RNA ligase催化的连接反应没有不利影响,并再次证实,在用3′-端是自由OH基的寡核苷酸作供体进行T_4RNA ligase催化的连接反应时,为了得到高的产率,避免或降低同时产生供体分子的自聚和环化,并不一定需要受体分子大大过量。用本法合成的CpGpCpm_2~2GpCpUpCpCpCpUpUpIpGp已用于酵母丙氨酸转移核糖核酸5′-端半分子和全分子的合成中。     

用改良三酯法合成富集d-A的脱氧十一核苷酸d-AAACCACCATA

本文报道用改良三酯法合成富集d-A的脱氧十一核苷酸片段d-AAACCACCATA。以TPSCl+Te(1:4)为缩合剂进行片段缩合,反应在1～2小时内即可达到完全。Dmt基的脱除采用ZnBr_2/硝基甲烷溶液,几乎没有发现脱嘌呤副反应。最终的合成产物经核苷酸顺序分析证明具有正确的排列顺序。     

多聚核苷酸的合成与研究 Ⅰ.十脱氧核糖核苷酸的化学合成

用片段缩合的方法,化学合成了十脱氧核糖核苷酸 d-_(MMT_r)G~(Bz)_pA~(Bz)_pC~(An)_pG~(Bz)_pA~(Bz)_pG~(Bz)_pT_pC~(An)_pC~(An)_pG~(Bz)。各中间片段及最终产物在脱除全部保护基后,均能定量地为桔青霉磷酸二酯酶酶解,并得到预期的碱基比例。将三苯甲基-纤维素柱运用于带MMTr基片段反应混合液的分离,能使情况简化,为进一步在DEAE-纤维素柱上分离纯化创造有利条件。     

多聚核苷酸的合成与研究 Ⅰ.十脱氧核糖核苷酸的化学合成

用片段缩合的方法,化学合成了十脱氧核糖核苷酸d-_(MMTr)G_p~(Bz)A_p~(Bz)C_p~(An)G_p~(Bz)A_p~(Bz)G_p~(Bz)T_p~(Bz)C_p~(An)C_p~(An)G~(Bz*)。各中间片段及最终产物在脱除全部保护基后,均能定量地为桔青霉磷酸二酯酶酶解,并得到预期的碱基比例。将三苯甲基一纤维素柱运用于带MMTr基片段反应混合液的分离,能使情况简化,为进一步在DEAE-纤维素柱上分离纯化创造有利条件。     

多核苷酸合成的研究 Ⅴ.酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-端半分子反密码区GpCpm~1Ipψ的合成

本文报道用化学方法合成酵母丙氨酸转移核糖核酸3’-端半分子反密码区中的GpCpm~1IpΨ四核苷三磷酸片段。合成路线是由_(Ho)Ψ~(Bz)(OBz)_2开始,采用逐个伸长的方式,依次同保护单核苷酸_(MMT)m~1I(OBz)-p,_(MMT)C~(Bz)(OBz)-p和_(iBu)G~(iBu)(OiBu)-p缩合得到全酰化的保护四核苷三磷酸,最后用NH_3/甲醇溶液脱去全部酰基保护基并经柱层析分离纯化得GpCpm~1IpΨ。所用缩合剂均为DCC。纯化后的GpCpm~1IpΨ层析电泳鉴定均一,碱解和酶解得到预期的核苷酸组成比例。     

生物素标记寡核苷酸探针探测扩增的病理性突变珠蛋白基因

用末端转移酶催化生物素核苷酸底物(Biotin-ll-dUTP)共价连接在合成的寡核苷酸3’羟基末端,从而合成了两种寡核苷酸探针(β~T_(41-42)及β~A_(41-42))。用它们分别与克隆化扩增的正常和突变的β—珠蛋白基因片段杂变。结果表明该探针都具有与~(32)P探针相似的特异性,其杂交的灵敏度为2—3pg(特异序列)。进而将探测HbS基因的正常和异常两种寡核苷酸19聚体(β~A_6和β~S_6)用~(32)P和生物素分别标记;将HbS杂合子病人的白细胞DNA经聚合酶链反应(PCR)法扩增,并以含正常β—珠蛋白基因的DNA片段作对照,与两种探针分别进行斑点杂交。所得结果完全一致;Hbs杂合子DNA对正常和异常探针都显出杂交信号,而正常DNA只与β~A探针显杂交信号。     

鄂西大蓟根的化学成分的研究

本题对菊科蓟属植物鄂西大蓟根Cirsium henryi的化学成分进行系统研究。采用硅胶柱色谱法分离了五个单体成分并以光谱分析法鉴定它们的结构:乙酰丁香酸(p-Hydroxycinnamic acid,1),原儿茶酸(protocate-chuic acid,2),香草酸(vanillic acid,3),二羟丙基软脂酸酯(2,3-dihydroxypropyl hexadecanoate,4)和胡萝卜苷(glucoraphenin,5)。这些化合物均为首次从该植物中分离得到。     

多核苷酸合成的研究 ⅩⅣ.EcoRI接头片段脱氧八核苷七磷酸的合成

本文采用化学方法和化学与酶促相结合的方法分别合成了自身互补的EcoRI接头片段脱氧八核苷酸d-GpGpApApTpTpCpC。化学方法使用二酯法(4 4)的路线,各中间片段和最终产物用DEAE-葡聚糖凝胶A-25柱层析纯化。酶促合成是用化学合成的两个片段d-GGAA和d-TTCC,借RNA连接酶连接成脱氧八核苷酸。两种方法合成的八核苷酸都能被限制性内切酶EcoRI识别并水解得到预期的产物,同时双向指纹图谱分析证明合成的产物具有正确的核苷酸排列顺序。     

多核苷酸合成的研究——ⅩⅣ.EcoRI 接头片段脱氧八核苷七磷酸的合成

本文采用化学方法和化学与酶促相结合的方法分别合成了自身互补的EcoRI 接头片段脱氧八核苷酸d-GpGpApApTpTpCpC。化学方法使用二酯法(4 4)的路线,各中间片段和最终产物用DEAE-葡聚糖凝胶A-25柱层析纯化。酶促合成是用化学合成的两个片段d-GGAA和d-TTCC,借RNA 连接酶连接成脱氧八核苷酸。两种方法合成的八核苷酸都能被限制性内切酶EcoRI 识别并水解得到预期的产物,同时双向指纹图谱分析证明合成的产物具有正确的核苷酸排列顺序。     

虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ的化学合成及其结构与生理活性分析

应用芴甲氧羰基(Fmoc)固相方法化学合成了虎纹捕鸟蛛毒素-I,合成采用Fmoc氨基酸五氟苯酯,各侧链保护措施如下:羧基和酚羟基用叔丁基(tBu)保护,赖氨酸和组氨酸侧链用叔丁氧羰基(Boc)保护,精氨酸胍基用4-甲氧-2,3,6-三甲基苯磺酰基(Mtr)保护,半胱氨酸巯基用三苯甲基(Trt)保护.固相载体为需活化的乙二胺-聚乙二醇-聚苯乙烯(EDA-PEG-PS)树脂.合成产物(肽树脂)用苯甲硫醚-乙二硫醇-苯甲醚-三氟乙酸系统一步裂解以及去除侧链保护基,然后用二硫苏糖醇(DTT)还原,再通过氧化型和还原型谷胱甘肽系统促使其形成正确的二硫键配对.对HPLC分离纯化得到的合成产物,进行了氨基酸组成、肽谱、氨基酸顺序以及一维核磁共振谱分析.分析结果表明合成毒素具有与天然毒素相同的化学结构和空间构象.生理实验结果表明,其生物学活性与天然Huwentoxin-I也相同.     

噬菌体T4诱导的核糖核酸(RNA)连接酶的分离和纯化

本文介绍了一种可以同时提取多核苷酸激酶(利用硫酸链霉素沉淀部分)DNA连接酶(DE一52柱层析峰I)和RNA连接酶(DE-52柱层析峰III)的方法。RNA连接酶的分离纯化步骤,除粗酶提取与DEAE纤维素柱层析两步与DNA连接酶的分离纯化方法一样外,以后只要再经过羟基磷灰石柱层析,葡聚糖凝胶(sc曲adex-G 100)过滤,和单链DNA琼酯糖凝胶亲和层析三步就可以达到纯化的目的。最终酶浓度达到每毫升24,800交换单位,即500个标准连接单位。用’H标记的聚腺苷酸作底物测不出Rnase杂酶活力,而且成功地应用于核糖十二核苷酸和十六核苷酸的定向合成。此外还做了一些初步的连接试验,表明RNA连接酶对受体寡核苷酸中戊糖是核糖还是脱氧核糖有较明显的专一性,对受体寡核苷酸的组成和顺序有一定的选择性。5'-脱氧胸腺嘧啶寡核苷酸d(pT)。也是个相当好的供体。