高原鼠兔诱导型一氧化氮合酶cDNA克隆及序列分析

高原鼠兔Ochotona curzoniae,世居在青藏高原海拔3000~5000 m的地区,是一种典型的低氧耐受哺乳动物。一氧化氮(NO)作为一种有效的血管舒张因子,在预防低氧诱导的低氧性肺血管收缩反应和肺动脉高压中发挥着重要功能。诱导型一氧化氮合酶(iNOS)是一种催化L-精氨酸合成NO的重要酶,受低氧调控。本研究经RTPCR和cDNA 3’末端快速扩增(3’RACE)方法成功克隆了高原鼠兔iNOS基因cDNA序列,并对其分子特征进行了分析。结果显示:高原鼠兔iNOS cDNA全长为3981 bp,开放阅读框(ORF)为3450 bp,共编码1149个氨基酸残基;预测的蛋白序列与北美鼠兔、兔、人、大鼠、小鼠、狗以及猪的同源性分别为98%、87%、82%、78%、78%、82%和83%;蛋白结构预测结果显示高原鼠兔iNOS具有氧化域、还原域及黄素腺苷酸结合区域等iNOS所具有的典型结构域;基于iNOS的最大似然树和贝叶斯树均支持鼠兔与兔有最近的亲缘关系,与形态或其他分子标记构建的进化关系相符;分子进化分析检测到高原鼠兔iNOS中存在3个正选择位点——32T、33Y和46R,但不同模型的结果表明哺乳动物iNOS基因所受选择以净化选择为主,不支持iNOS在高原鼠兔支系发生适应性进化。该研究为揭示高原鼠兔iNOS的表达特征及其在低氧适应中的作用与调控机制研究奠定了初步基础。     

大鼠诱导型一氧化氮合酶基因转录调控区的克隆与鉴定

采用单特异引物ＰＣＲ克隆法,得到大鼠诱导型一氧化氮合酶（ｉＮＯＳ）基因转录调控区ＤＮＡ片段。核酸序列分析证实,大鼠ｉＮＯＳ基因的５＇－侧翼区含有ＩＦＮ－γ和ＴＮＦ－α应答元件及ＮＦ－ｋＢ结合位点的保守序列。这些保守序列的位置及排列显区别于人和小鼠的ｉＮＯＳ基因。电泳迁移率改变分析（ＥＭＳＡ）表达,ＶＳＭＣ受ＩＬ－１和ＩＦＮ－γ刺激后,细胞核内产生某种可与ｉＮＯＳ基因５＇－侧翼区特异结合的核蛋白因     

神经型一氧化氮合酶的活性调控

一氧化氮是重要的信使分子,在生物体内参与众多生理及病理过程。生物体内存在着复杂的一氧化氮合酶活性调控机制以精确调控一氧化氮的生成。在神经系统中,一氧化氮主要由神经型一氧化氮合酶催化生成。神经型一氧化氮合酶的活性主要受到翻译后水平上钙离子和钙调蛋白的调控,其调控方式包括二聚化、多位点的磷酸化和去磷酸化,以及主要由PDZ结构域介导的蛋白质-蛋白质相互作用。一氧化氮本身对其合酶的活性具有负反馈调控作用。近年来的研究提示,细胞质膜上的脂筏微区在神经性一氧化氮合酶的活性调控中也起到重要的调节作用。     

葡萄白藜芦醇合酶基因的克隆及序列分析

目的:从葡萄中克隆白藜芦醇合酶基因vrs1并对其序列进行生物信息学分析.方法:利用葡萄总RNA为模板,采用RT - PCR技术克隆白藜芦醇合酶基因vrs1并亚克隆进T- Vector.利用生物信息学工具对其核酸和蛋白序列进行分析.结果:测序结果显示其cDNA序列全长为1 257bp,含有一个1 179bp的开放阅读框.生物信息学分析表明葡萄白藜芦醇合酶基因编码392个氨基酸,分子量为42.9kDa,理论等电点为5.97,具有芪合酶家族固有的氨基酸保守结构域,二级结构主要由α-螺旋、无规则卷曲、延伸链和β-转角组成.结论:该基因的克隆、生物信息学分析为进一步研究其功能奠定了基础.     

大豆异黄酮合酶基因的克隆及序列分析

目的:大豆异黄酮是多酚类混合物,有防治肿瘤发生,提高机体免疫力等多种保健功能。异黄酮合酶(isoflavone synthase,IFS)是合成异黄酮的关键酶。本文为了利用异黄酮的特有生物学功能,从大豆中克隆了该基因。方法:采用PCR扩增从大豆[Glycine max(Linn.)Merr.]总RNA中分离了异黄酮合酶基因,并将其克隆到pUCm-T载体并测序。结果:得到全长1583bp的片段。以期用于构建诱导表达基因敲除系统,并用于无性繁殖植物的无标记基因转化。结论:序列分析表明,异黄酮合酶基因(IFS1)含1583个核苷酸,与已报道的序列比较,核苷酸的同源性为92%。     

花生白藜芦醇合酶基因的克隆与生物信息学分析

利用Protparam、iPSORT prediction、ProtScale、SOPMA、Swiss-Modeling和Scan Prosite等生物信息学工具分别对其理化性质、信号肽、疏水性、亲水性、二级结构和三级结构进行分析。以花生粤油45总DNA和总RNA为模板,采用PCR和RT-PCR技术克隆花生白藜芦醇合酶基因的DNA和cDNA序列,并利用SWISS-PROT、DNAMAN等生物信息学工具对其基因和蛋白质序列进行了分析。测序结果显示,该基因的DNA和cDNA序列长度分别为1 498 bp和1 251 bp,cDNA序列具有完整的开放性阅读框,编码389个氨基酸的多肽。该白藜芦醇合酶氨基酸368-378位点上存在芪合酶家族的特征位点GVLFGFGPGLT。同源性分析表明,其碱基序列与已报道的花生白藜芦醇合酶基因的一致性为99%,其氨基酸序列与已报道的花生白藜芦醇合酶氨基酸序列的一致性为100%。     

神经型一氧化氮合酶在生后小鼠肾脏发育中的表达

目的观察生后小鼠肾脏发育不同阶段神经型一氧化氮合酶(nNOS)的表达,以及新生小鼠与成年小鼠肾脏nNOS表达差异,探讨nNOS在小鼠生后肾脏发育中的意义。方法分别取新生(出生小于2h)、生后3、5、7、14、40d昆明小鼠各8只,共6组。用免疫组织化学及免疫印迹方法对小鼠肾脏内nNOS表达进行定性、定量分析。结果新生小鼠生肾区nNOS呈强阳性表达,肾小管也有表达;成年小鼠肾远端小管,特别是致密斑,nNOS呈强阳性表达,集合管及肾小管均有阳性表达;新生小鼠肾脏nNOS含量最多,随后逐渐减少,成年小鼠nNOS含量最低。结论新生小鼠与成年小鼠肾脏nNOS表达部位不同,且表达含量由新生时最高到成年时降至最低。     

查尔酮合酶基因的克隆、全序列分析及在大肠杆菌中的高效表达

类黄酮是植物中的一种重要的次级代谢产物,它与植物的花色形成有关。查尔酮合酶是类黄酮合成途径中的一个关键酶,在植物体内,ＣＨＳ表达量的增加或减少都可能改变花的。从矮牵牛花瓣的ｃＤＮＡ中克隆到了ＣＨＳ－Ａ基因,进行了全序列分析,并与国外已报道的ＣＨＳ－Ａ－序列进行了同源性比较。     

巴西橡胶树鲨烯合酶基因的克隆与序列分析

鲨烯合酶(SQS )是植物甾醇和三萜化合物生物合成途径中的关键酶。以巴西橡胶树为试验材料,提取胶乳总 RNA,利用 RT-PCR 以及 RACE 的方法克隆橡胶树鲨烯合酶 cDNA 编码区片段,并进行序列分析。结果表明：橡胶树鲨烯合酶 cDNA 编码区为1239 bp,编码413个氨基酸,命名为 HbSQS 。荧光定量分析表明鲨烯合酶基因在不同组织里表达水平存在明显差异,且受乙烯调控。     

绞股蓝法呢基焦磷酸合酶基因的克隆及其序列分析

目的:克隆并分析绞股蓝法呢基焦磷酸合酶(FPS)基因的全长序列。方法:参照罗汉果法呢基焦磷酸合酶基因,设计扩增绞股蓝FPS基因的3′RACE引物,采用3'RACE和5'RACE法克隆绞股蓝FPS基因全长cDNA。结果:获得绞股蓝FPS基因全长cDNA序列共1288个核苷酸,包含一个1026核苷酸的开放读框,编码342个氨基酸残基,推断该蛋白的相对分子质量为3.94×104。NCBI Blast结果显示绞股蓝FPS基因编码蛋白的氨基酸序列与已知的植物FPS氨基酸序列的同源性为91%~74%,核酸序列的同源性为88%~78%。结论:克隆了绞股蓝FPS基因全长cDNA序列,为进一步研究绞股蓝FPS基因的表达及三萜皂苷合成通路关键酶分子的进化奠定了基础。     

高原鼢鼠(Myospalax baileyi) 不同地理种群的形态变异

本文采用主成分分析和聚类分析两种方法,分析了高原鼢鼠(Myospalax baileyi)12 个地理种群17 项形态特征的变异。主成分分析结果显示,分析构建的雄性前3 个主成分累积贡献率为78.483% ,而雌性前4 个主成分累积贡献率为79.587% 。对种群间形态差异分析贡献最大的指标为颅全长、基长、后头宽等反映头骨大小性状,以及顶嵴、额嵴最小间距体现的颧弓扩张程度指标。主成分分析结果与聚类分析结果一致,12 个地理种群分化构成两个大的地域性群体:一个由甘肃种群构成的甘肃群体;另一个由四川种群和青海种群构成的混合群体。两个地域性群体实际上反映出两个不同的分化方向:一个方向表现为头骨较小,顶嵴、额嵴相对分开即颧弓扩张程度小,如甘肃群体;另一个则表现为头骨较大,顶嵴、额嵴相对靠拢即颧弓扩张程度大,如混合群体。这种地域群体的形态变异可以解释为,地下洞道系统中环境因子选择作用对高原鼢鼠形态变化产生了重要影响。     

高原鼢鼠线粒体谱系地理学和遗传多样性

高原鼢鼠是一类地下独居啮齿动物,为青藏高原特有种之一。为研究该物种的谱系地理学和遗传多样性,本文测定了采自青藏高原东部3个地理种群8个小种群共37个个体的线粒体D-loop区序列变异。在长度为627bp的序列中,共发现50个变异位点,定义了26种单倍型。该物种的单倍型多样性（Haplotype diversity,H）较高和核苷酸多样性（Nucleotide diversity,πn）较低。谱系分析得到3个稳定的分支,分别与采集的地理种群相吻合：同一地理种群内单倍型之间遗传差异小,而不同地理来源的单倍型之间存在较大区别。距离隔离分析表明高原鼢鼠的遗传分化与地理距离呈正相关。AMOVA分析同样表明地理种群之间存在显著差异：地理种群间变异占遗传变异的80.45%。高原鼢鼠的这种遗传结构特点可能主要是由于第四纪气候变迁、该物种稳定的地下生活环境和有限的迁移能力造成的。     

祁连山东段高原鼢鼠采食洞道气体研究

研究高原鼢鼠（Myospalax baileyi）洞道气体环境对了解其低氧适应机制具有重要作用。本试验在祁连山东段高寒草甸利用土壤原位气体测定仪,对高原鼢鼠采食活动洞道、非活动洞道、地表空气及无洞道土壤内的温度、氧气、二氧化碳、甲烷含量进行了连续12个月的监测。通过One-Way ANOVA检验、重复测量方差分析以及Pearson相关性分析发现,（1）高原鼢鼠活动洞道氧气含量,除10月、11月与非活动洞道无显著性差异外（P>0.05）,均显著小于非活动洞道、地表空气和无洞道土壤（P<0.05）;活动洞道二氧化碳含量,除7月、8月份与非活动洞道无显著性差异外（P>0.05）,均显著大于非活动洞道、地表空气和无洞道土壤（P<0.05）;活动洞道内甲烷含量各月均显著高于地表空气甲烷含量（P<0.05）,与非活动洞道、无洞道土壤的月季差异各异。（2）高原鼢鼠活动洞道内氧气含量的最小值和二氧化碳的最大值均出现在5月和9月,其它处理下氧气最小值和二氧化碳最大值均出现在6-8月;4个处理下甲烷含量最小值在1月与12月出现,最大值出现在5月和9月。（3）月份、处理以及月份和处理间的交互作用均对氧气、二氧化碳、甲烷含量有显著影响（P<0.05）。可见,高原鼢鼠生存在低氧、高二氧化碳和较高甲烷含量的环境中,且洞道内部的气体环境会受季节和高原鼢鼠活动的影响。     

高原鼢鼠和高原鼠兔肺细叶的结构特征

高原鼢鼠和高原鼠兔是青藏高原土著动物,对低氧具有很好的适应性.为了探讨在低氧环境中两者肺细叶结构的适应特征,应用体视学方法测量了肺细叶相关指标.结果发现 :高原鼢鼠和高原鼠兔肺单位面积肺泡数显著高于SD大鼠,单个肺泡面积和弹性纤维/肺实质比显著低于SD大鼠;高原鼢鼠肺泡隔厚度最厚,高原鼠兔最薄,且三种动物具显著差异; 高原鼢鼠和高原鼠兔气-血屏障的算术平均厚度(Ta)和调和平均厚度(Th) 均显著低于SD 大鼠;在三个级别的微血管中,高原鼠兔中膜肌层厚度显著低于高原鼢鼠,两种高原动物均显著低于SD大鼠;高原鼢鼠和高原鼠兔的微血管密度(MVD)显著高于SD大鼠.以上结果表明,高原鼢鼠和高原鼠兔肺细叶结构特征表现出一定趋同,这些特征有利于在低氧条件下提高肺气体扩散容量;但是,肺泡隔厚度和微血管中膜肌层厚度/血管外径比又表现出明显的差异,可能是不同生境造成的[动物学报 54(3):531-539,2008].     

不同季节高原鼢鼠乳酸脱氢酶活力和同工酶谱

目的:探讨高原鼢鼠对洞道低氧高二氧化碳环境的代谢适应机制。方法:用酶活力分析法,分析春季、夏季和秋季高原鼢鼠血清乳酸脱氢酶(LDH)活力、乳酸含量和组织LDH活力,用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析血清和组织LDH同工酶谱。结果:高原鼢鼠血清LDH活力在春夏秋三季具有明显的差异,春季高于夏季,夏季高于秋季,血清乳酸含量表现出同样的变化趋势;春季血清中五种同工酶条带都清晰可见,夏季血清中LDH5和LDH4清晰可见,秋季血清中只能看见LDH5带。骨骼肌、心肌和脑组织LDH活力较高,而且从春季到秋季显著降低;肝、肾和肺组织LDH活力较低,肝组织LDH活力春季显著高于夏季和秋季,夏秋两季之间没有明显差异;肾和肺组织LDH活力在春季与夏季之间没有明显差异,但秋季明显降低。心、肝、肺、肾、脑和肌肉组织LDH同工酶谱,在春夏秋三季都显示出五条带,并表现出明显的组织差异;各组织同工酶含量也有不同程度的季节差异。结论:高原鼢鼠体内糖酵解过程具有明显的季节性变化,从春季到秋季依次降低,这与它们的季节性活动特点和洞道中氧气和二氧化碳的季节性波动有关。     

放牧干扰下高原鼢鼠栖息地选择因素

以祁连山东段高寒草甸栖息的高原鼢鼠(Myospalax baileyi)为研究对象,探讨放牧干扰下高原鼢鼠适合栖息地选择的影响因素,为合理控制草原鼠害和保护生物多样性提供科学依据。在5个不同放牧强度小区中,连续3年监测高原鼢鼠相对种群密度变化,同时获取植被和土壤的变化数据。分析高原鼢鼠相对种群密度、植被(盖度、高度、频度、植被生物量、植被均匀度、丰富度、多样性和地下根系生物量)和土壤(紧实度、容重、水分)之间的关系。中度放牧干扰下,高原鼢鼠相对种群密度最低,不利于对栖息地的选择,轻度、次轻度放牧区的高原鼢鼠相对种群密度高于重度、次重度放牧区的;轻度放牧干扰的草地有利于高原鼢鼠种群数量的增加。高原鼢鼠相对种群密度与土壤紧实度、容重呈显著负相关(R=﹣0.921、﹣0.883,P0.05);与土壤水分呈显著正相关(R=0.879,P0.05);高原鼢鼠相对种群密度与地下根系生物量呈极显著正相关(R=0.982,P0.01),与植被丰富度呈显著正相关(R=0.921,P0.05),与地上植被总盖度呈显著正相关(R=0.909,P0.05),与地上生物量、均匀度、多样性呈不显著正相关(P0.05)。在草地放牧干扰系统中,非生物因素土壤紧实度、水分可能是高原鼢鼠栖息地选择的首要选择因素,食物资源也许是次要选择因素。     

高原鼢鼠肺组织细胞凋亡相关 基因的进化分析及其在不同 海拔条件下的表达模式

高原鼢鼠（Myospalax baileyi）是青藏高原特有的地下鼠,其地下洞道严重缺氧。一般来说,低氧会促进细胞凋亡。为了探讨高原鼢鼠适应低氧环境的分子机制,本文应用生物信息学方法对p53下游凋亡促进基因Pidd、Fas、Bax、Puma、Apaf-1、Scotin、Perp、Igfbp3和凋亡抑制基因Bcl-2的序列和编码的氨基酸序列进行了进化分析,并以SD大鼠（Rattus norvegicus）为对照,研究了这些基因在不同海拔环境条件下（3 300 m和2 260 m）的表达模式。结果表明：（1）高原鼢鼠细胞凋亡基因的序列与以色列鼹鼠（Nannospalax galili）同源性最高;预测的PIDD、PUMA、Apaf-1、IGFBP3和BCL-2编码蛋白结构域与以色列鼹鼠的存在明显的趋同进化位点;SIFT评估发现,高原鼢鼠和以色列鼹鼠与其他物种相比,p53、PIDD、PUMA、Apaf-1和IGFBP3氨基酸序列分别在78、853、157、320和285号位点的变异对其功能有显著影响;（2）在高海拔条件下（3 300 m）,高原鼢鼠肺组织中凋亡促进基因Pidd、Bax、Puma和Apaf-1表达水平显著下降,凋亡抑制基因Bcl-2表达水平显著升高,而在SD大鼠中凋亡促进基因和凋亡抑制基因的表达水平均没有变化;高原鼢鼠中Bcl-2/Bax比值随海拔的升高显著上升,而在SD大鼠中没有变化。以上结果提示,高原鼢鼠p53结构变异可能导致其下游基因表达模式与SD大鼠不同,其中凋亡促进基因Pidd、Bax、Puma和Apaf-1表达水平下降,凋亡抑制基因Bcl-2表达水平上升,从而抑制了细胞在低氧条件下的凋亡;在长期低氧的作用下,高原鼢鼠p53下游基因产物PIDD、PUMA、Apaf-1和IGFBP3产生了影响其功能的变异位点,这可能改变了它们与发挥功能的复合物的结合力,从而抑制了细胞凋亡。因此,通过长期的低氧适应,高原鼢鼠肺组织中与细胞凋亡相关的基因产物结构发生变异,导致其基因表达水平发生变化,从而抑制细胞凋亡,这是高原鼢鼠适应地下低氧洞道生境的分子机制之一。     

常氧条件下高原鼢鼠、甘肃鼢鼠及SD大鼠血液理化特征比较

为探讨不同低氧环境适应动物的血液理化特征,用美国雅培手掌血气分析仪分别测定常氧适应4周的高原鼢鼠(Myospalax baileyi)及甘肃鼢鼠(M.cansus)血液的血气、酸碱及电解质指标,并与SD大鼠(Rattus norvegicus)进行比较。结果显示,常氧适应后,甘肃鼢鼠与高原鼢鼠动脉氧分压(PaO2)、静脉氧分压(PvO2)、动静脉氧分压差(PaO2﹣PvO2)、动脉氧饱和度(SaO2)、静脉氧饱和度(SvO2)及氧利用率均无显著性差异,两种动物静脉血的氧分压和氧饱和度均极显著低于SD大鼠,氧利用率极显著高于SD大鼠;高原鼢鼠与甘肃鼢鼠动、静脉血红蛋白(Hb)及动、静脉红细胞压积(HCT)无显著性差异,血红蛋白含量与SD大鼠无显著性差异,但红细胞压积(HCT)极显著低于SD大鼠;高原鼢鼠和甘肃鼢鼠血液酸碱特征趋于一致,不同于SD大鼠,动静脉pH差(pHa﹣pHv)及动静脉CO2总含量差(TvCO2﹣TaCO2)显著高于SD大鼠,动脉二氧化碳分压(PaCO2)极显著低于SD大鼠,动静脉二氧化碳分压差(PvCO2﹣PaCO2)极显著高于SD大鼠;高原鼢鼠和甘肃鼢鼠血浆中钠离子(Na+)浓度、钾离子(K+)浓度、游离钙离子(iCa2+)浓度及动静脉钠离子浓度差(Na+v﹣Na+a)、钾离子浓度差(K+v﹣K+a)和游离钙离子浓度差(iCa2+v﹣iCa2+a)无显著性差异;高原鼢鼠动脉血钾离子浓度显著低于SD大鼠,钾离子浓度差显著高于SD大鼠;甘肃鼢鼠钾离子浓度差及动、静脉血钙离子浓度显著高于SD大鼠。这些结果说明,低氧适应动物血气、酸碱及电解质特征一致,与地面生活的SD大鼠差异很大,表现出较低的红细胞压积和较高的氧利用率,血液能耐受较宽范围的酸碱变化,维持电解质稳定,保证内环境稳态。     

高原鼢鼠越冬食物选择与营养成分的关系

为了解高原鼢鼠在越冬期的食物选择与营养成分之间的关系,采集了67 个高原鼢鼠的冬季粮仓及环境样方,分析高原鼢鼠对每一种植物的选择指数,将其分成3 种食物类型:喜食、可变和不喜食。通过测定每一种植物的粗蛋白、粗纤维、水溶性糖和粗灰分的含量,比较分析了营养成分含量在3 种食物类型间的差异,及其与各种植物选择指数的相关关系。结果显示,高原鼢鼠储存的食物种类多达67 种,本文选取含量较高且样本量大于5 的39 种植物(占粮仓和样方总生物量的99% 以上其中喜食12 种、可变16 种、不喜食11 种)进行分析。在3 种食物类型之间,粗蛋白、粗纤维和水溶性糖含量均有极显著差异(P < 0. 001),粗灰分含量则无明显差异(P = 0.800)。喜食和可变类型的粗蛋白和水溶性糖含量显著高于不喜食类型(P < 0.01);喜食和可变类型的粗纤维含量则显著低于不喜食类型(P < 0. 01);喜食和可变类型之间这3 个指标差异都不显著(P >0. 05)。Spearman 相关分析显示,粗蛋白(R = 0.547,P < 0.001)和水溶性糖(R = 0.617,P < 0. 001)含量与选择指数显著正相关,粗纤维与选择指数显著负相关(R = - 0. 707,P <0. 001),粗灰分与选择指数则无显著相关关系(R = 0.032,P =0. 846)。结果表明,高原鼢鼠总体上偏好粗蛋白和水溶性糖含量高、粗纤维含量低的植物,对无机盐的含量则不敏感。     

In search of potent and selective inhibitors of neuronal nitric oxide synthase with more simple structures

In certain neurodegenerative diseases damaging levels of nitric oxide (NO) are produced by neuronal nitric oxide synthase (nNOS). It, therefore, is important to develop inhibitors selective for nNOS that do not interfere with other NOS isoforms, especially endothelial NOS (eNOS), which is critical for proper functioning of the cardiovascular system. While we have been successful in developing potent and isoform-selective inhibitors, such as lead compounds 1 and 2, the ease of synthesis and bioavailability have been problematic. Here we describe a new series of compounds including crystal structures of NOS-inhibitor complexes that integrate the advantages of easy synthesis and good biological properties compared to the lead compounds. These results provide the basis for additional structure–activity relationship (SAR) studies to guide further improvement of isozyme selective inhibitors.