对多种病原体免疫的重组牛痘病毒

<正>使用标记挽救(Marker rescue)技术将外源性牛痘病毒非活性亚基因片段引入感染性的后代病毒的能力提示:这些程序的引伸意义可能允许外来遗传物质插入牛痘病毒体。这种情况最初是在编码胸腺嘧啶核苷激酶中插入并表达单纯疱疹病毒DNA序列的事实证明的。这种生产针对异种病原体重组活疫苗是一种具有潜力的遗传学手段,乃是牛痘病毒表达外来基因的有价值的用途之一。已经叙述的牛痘病毒重组体的例子有:表     

牛痘病毒对发展新疫苗的作用

<正> 重组DNA技术、肽化学和免疫学的进展为开发新疫苗提供了有力的工具。而完成这些工作还依赖于体液免疫和细胞免疫靶子的鉴别及它们在保护机体中所起作用的评价。由于牛痘病毒可以作为载体表达外源基因,对有效靶抗原的测定具有重要作用。牛痘病毒基因表达水平的提高使得在哺乳类细胞中繁殖牛痘病毒而制备蛋白亚单位疫苗成为可能。能否用重组牛痘病毒作为一种活疫苗,即象消灭天花所使用的牛痘疫苗那样应用,仍是目前争论的焦点。 重组牛痘病毒构建 牛痘病毒基因组约为20万碱基对,具有单一调控序列的病毒编码转录系统,无RNA     

表达尼帕病毒G囊膜糖蛋白重组牛痘病毒的研究

采用牛痘病毒WR株,构建了表达哺乳动物密码子优化的NiV G蛋白基因的重组病毒rWR-NiV-G。Westernblot证实大小为66kDa的重组G蛋白在rWR-NiV-G感染的Hela细胞中获得表达;采用兔抗NiV高免血清间接免疫荧光检测重组痘病毒表达G蛋白显示出良好的特异免疫反应原性。rWR-NiV-G感染NiV敏感的BHK细胞系,并与NiV融合蛋白F共同表达,可形成强烈细胞融合现象。rWR-NiV-G感染免疫BALB/c小鼠,可诱导显著的NiV G蛋白特异体液免疫反应。以原核表达NiV G蛋白片段为包被抗原,间接ELISA检测rWR-NiV-G感染免疫小鼠血清中的G蛋白特异抗体,具有良好的敏感性和特异性。同时,rWR-NiV-G感染免疫小鼠血清中的G蛋白特异抗体可有效中和NiV囊膜蛋白F和G介导的伪型VSV重组病毒侵入NiV易感宿主细胞的感染性。结果表明,重组牛痘病毒表达的NiV G蛋白有良好的免疫原性和生物学活性功能,为进一步深入研究NiV G蛋白生物学功能、免疫原性及重组活载体疫苗研究奠定了重要基础。     

用杆状病毒为载体在昆虫细胞中表达马立克病病毒pp38基因

鸡马立克病病毒(MDV)38kd磷蛋白(pp38)基因中包括起始密码子和终止密码子的完整编码序列被整合进杆状病毒AcNPV的转移载体质粒pVL1392,用所得的含pp38基因的重组转移载体质粒pVLpp38I与野生型杆状病毒AcNPV的DNA共转染昆虫传代细胞系Sf9细胞后,用荧光抗体法以抗MDV单克隆抗体H_(19)筛选到能表达MDVpp38的重组杆状病毒克隆BP38 I。免疫印迹试验表明,在重组病毒BP38 I感染的Sf9细胞溶解物中,可表现一条分子量约为35—36kd的为单克隆抗体H_(19)识别的MDV特异性蛋白带。     

尼帕病毒F糖蛋白在重组牛痘病毒中的表达及鉴定

尼帕病毒(NiV)F蛋白在病毒侵入细胞和诱导中和抗体等方面具有重要作用。通过over-lapping PCR合成密码子优化的F蛋白基因构建了表达NiV F蛋白的重组牛痘病毒(WR株)rWR-NiV-F。利用兔抗NiV血清为检测抗体,通过间接免疫荧光(IFA)检测到了F蛋白在重组病毒感染细胞中的表达。SDS-PAGE和Western blot检测证明重组蛋白F0被裂解为F1和F2。以rWR-NiV-F感染瞬时转染共表达NiV受体结合囊膜糖蛋白G的BHK细胞,可诱导细胞膜融合及合包体形成,证明该重组病毒表达F蛋白保持良好的抗原性及生物学活性,为NiV诊断及重组活载体疫苗研究奠定了重要基础。     

登革2型病毒衣壳蛋白在哺乳动物细胞中的表达与鉴定

从构建的重组质粒pLEX—C中高保真PCR获得编码登革2型病毒43株C基／E／（D2C）DNA片段,通过基因重组的方法将其克隆入真核表达载体pcDNA6／V5-His获得了重组真核表达载体pc／D2C。经电穿孔的方法转染BHK21细胞后,分别通过RT—PCR、免疫荧光和western印迹鉴定表达的蛋白。结果重组蛋白在BHK21细胞中获得表达,表达的蛋自主要存在于胞浆中,并具有较好的抗原性,能够被抗登革病毒衣壳蛋白单克隆抗体特异识别。此研究为深入了解登革病毒衣壳蛋白在病毒复制及组装过程中的生物学功能奠定了基础。     

可分泌性GLP-1重组慢病毒的构建

目的:为了探讨使用基因治疗在体内分泌表达胰高血糖素样肽-1(GLP-1)方法治疗糖尿病的可行性,构建可分泌表达GLP-1的重组慢病毒.方法:1.将已构建成功的NT4-GLP-1融合基因插入慢病毒包装质粒pLenti6V5D-TOPO中,构建pLenti6V5D-TOPO/NT4-GLP-1重组慢病毒包装质粒.2.用慢病毒包装辅助质粒plp1、plp2、plp/VSVG,及重组慢病毒包装质粒pLenti6V5D-TOPO/NT4-GLP-1,四质粒磷酸钙共沉淀法转染80%融合的293细胞系,包装慢病毒.3.通过免疫组化法染色确定重组慢病毒效应.结果:重组质粒经BamHI和XhoI联合酶切,10g/L琼脂糖凝胶电泳可见在342bp处有一目的片段.该值与NT4-GLP-1融合基因片段的大小一致,说明NT4-GIP-1融合基因已经成功重组于慢病毒包装质粒pLenti6V5D-TOPO内.免疫组化结果显示,实验组细胞内出现大量棕黄色颗粒,阳性细胞达到70%以上,对照组中没有阳性细胞,所以说明NT4-GLP-1重组慢病毒在细胞中可以正确地分泌表达GLP-1.结论:NT4-GLP-1重组慢病毒包装质粒构建正确,病毒包装成功.     

猴B病毒被膜糖蛋白gC的原核表达及诊断价值评价

目的:原核表达猴B病毒糖蛋白gC胞外区片段,评价其在猴B病毒血清学检测中的特异性和敏感性,为猴B病毒检测奠定基础。方法:利用PCR方法扩增gC胞外区基因片段,同时合成该片段的优化密码子序列,将其插入表达载体pET-28b(+)形成重组质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3)并进行诱导表达;纯化蛋白先以Western印迹进行验证,再以ELISA方法和标准阳性、阴性血清评价其诊断价值。结果:直接从病毒DNA模板上获得的基因片段未能表达,而优化后的基因片段表达水平较高,表达蛋白的相对分子质量约为48×103,为包涵体形式,占菌体总蛋白的30%左右;Western印迹显示,重组蛋白能与猴B病毒阳性血清和His单克隆抗体发生免疫反应;34份标准阳性血清和25份阴性血清的ELISA检测结果显示,重组蛋白的敏感性和特异性分别为94.1%(32/34)和100%(25/25)。结论:利用原核表达系统制备的gC胞外区重组蛋白,可作为猴B病毒血清学检测抗原,其特异性和敏感性都较好。     

产生牛痘病毒外壳蛋白的重组体

东京大学医科学研究所、森永乳业、日本大学、岐阜大学、国立预防卫生研究所的共同研究小组建立了使用昆虫细胞培养物生产牛痘病毒外壳蛋白的重组株,正在探讨重组蛋白的精制法、精制的抗原可应用于凝集法的试验用抗原.这项成果在农艺化学大会上发表. 使用的病毒蛋白cDNA是医科研和东燃公司共同克隆的基因之一,大小为1.6kb.牛痘病毒具有6种外壳蛋白,建立的重组株仅能生产其中的一种.感染了病毒的牛血液中有大量抗这种蛋白的抗体,所以在野外易用的凝集法诊断时是有用的蛋白.把cDNA导入苜宿银纹     

登革3型病毒prM-E基因重组质粒DNA的构建和真核表达

构建登革 3型病毒 prM E基因的真核表达重组质粒 ,并进行体外表达 ,为登革DNA疫苗的研究奠定基础。用RT -PCR法获得 prM -E基因片段 ,然后将其克隆到真核表达载体中。用电穿孔法将重组质粒DNA转入BHK细胞 ,通过免疫荧光法检测外源基因在真核细胞中的表达。结果 ,通过酶切和序列测定证实了构建的重组质粒DNA含序列正确的 prM- E基因。用免疫荧光法检测到转染了重组质粒DNA的BHK细胞的胞浆中有登革 3型病毒特异蛋白的表达。说明含有登革 3型病毒prM -E基因的真核表达重组质粒可以在BHK细胞中表达 ,该结果为观察该重组质粒的免疫原性奠定了基础。     

登革2型病毒43株prM基因片段在痘苗中的克隆与表达

利用RT-PCR技术获得登革2型病毒中国分离株(D_2-43)的prM基因片段。扩增产物经酚:氯仿抽提纯化之后,直接插入pT_7BlueT载体中,经DNA序列分析证明了所扩增片段序列的正确性。构建了痘苗病毒载体PJSA1175/prM,外源基因受痘苗病毒启动子P_(7.5K)的调控。脂质转染(Lipofection)法获得D_2-43株prM蛋白的重组病毒。荧光检测显示,重组痘苗病毒表达的prM蛋白分布于细胞表面。间接ELISA测定其滴度为1:4。     

黄地老虎颗粒体病毒DNA片段在枯草芽孢杆菌中的克隆和启动氯霉素抗性基因表达

黄地老虎颗粒体病毒(Agrotis segetum granulosis virus简称AsGv)DNA和pPL603质粒DNA,用限制性核酸内切酶EcoR I酶切后,再用T4连接酶连接,转化枯草芽孢杆菌BRl51感受态细胞。然后在loμg／m1氯霉素的sPBY选择平皿上筛选,得到了抗氯霉素的转化子。经过琼脂糖凝胶电泳检测,转化于中的重组质粒比原载体pPL603质粒分子量大。由于重组质粒上的抗性表达水平可达250μg／m1氯霉素,比pPL603质粒抗性表达水平(5μg／m1)提高50倍。所以重组质粒携带了有启动作用的DNA片段。启动功能片段的分子量,经琼脂糖凝胶电泳测定约为O．9kb。除进行DNA—DNA分子杂交确证外,并用重组质粒pAsGVPl5进行了第二次转化、抗性水平测定和分子量分析。     

麦迪霉素4"-O-丙酰基转移酶(mpt)基因结构的研究

对含有麦迪霉素4"-O-丙酰基转移酶(mpt)基因的BamHI-BamHI 8.0kb的DNA片段进行限制性酶切分析,绘制出了含有21个酶切位点的限制性酶切图谱。以含有碳霉素异戊酰基转移酶基因(CarE)的2.4kb DNA片段为探针,经Southern blot分子杂交,将mpt定位于一个EcoRI-EcoRI-Pstl 3.0kb的DNA片段上,将该片段克隆至大肠杆菌/链霉菌穿梭质粒载体pWHM3上,获得重组质粒pWFPE。含有pWFPE的螺旋霉素产生菌产二素链霉菌(S.ambofaciens)及变铅青链霉菌(J.lividans)TK24均可将内源产生的或外源加入的螺旋霉素酰化为4"-O-丙酰螺旋霉素。对EcoRI-EcoRI-PstI 3.0kbDNA片段上mpt基因进行序列分析,在该片段上有一个开放阅读框架,它以ATG为起始密码子,以TGA为终止密码子,与其序列对应的编码产物含有388个氨基酸。Mpt基因的G+C mol％为68.0,密码子第三位上G+C mol％为91.5。Mpt基因编码的氨基酸序列与CarE基因编码的氨基酸序列的相同性为67.6％,相似性为86.4％。在起始密码子上游6bp处存在…     

汉滩病毒A9株M基因片段在重组痘苗病毒中的表达及鉴定

为发展国产化肾综合征出血热（ＨＦＲＳ）病毒基因工程疫苗,选择了汉滩病毒Ａ９株Ｍ基因片段为目的基因,构建转染质粒ｐＪＳＢＡ９Ｍ。以携带Ｌａｃ基因的重组病毒为亲本,使表达载体ｐＪＳＢ－Ａ９Ｍ上的Ｍ片段与痘苗病毒内的Ｌａｃ基因重组,将Ｌａｃ置换成Ａ９Ｍ片段。用蓝白斑法筛选重组痘苗病毒,经ＰＣＲ扩增证实Ａ９Ｍ片段重组入痘苗病毒基因组内。重组痘苗病毒感染的Ｖｅｒｏ Ｅ６细胞,用抗糖蛋白单克隆抗体（ＨＣＯ２、     

疫苗

881180感染性重组病毒,含有所述猫白血病病毒疫苗及其生产方法〔专,英〕/Nunbe-rg,J .H.…1 European Patent Appl.EP 0216564.Pub.01 .04 .87.Appl.US.774040,filed 09.09.86〔译自CBA,1957, (6),2576〕 含有一个嵌合猫白血病病毒(FeLV)外壳基因的感染性重组病毒可用作猫白血病疫苗。用病毒DNA和一个插人性载体转染易感的哺乳动物细胞来制备病毒。该载体带有由在细胞内具活性的启动子、翻译起始密码子和为FeLV病毒外壳蛋白编码的一个DNA片段组成的嵌合基因。编码蛋白的DNA受控干启动子。用这种感染性重组病毒和一个衍生载体或…     

表达甲型肝炎病毒抗原的重组痘苗病毒(VMS11 HAV25)的免疫原性

甲型肝炎(甲肝)病毒基因全部开放读码框架cDNA重组于痘苗病毒天坛株DNA的HindⅢM片段,获得了重组痘苗病毒VMS11HAV25。用10~7PFU或10~8PFU病毒量皮内免疫家兔,能诱生甲肝病毒抗体,其滴度与免疫剂量、免疫次数及间隔有关。组织培养中和试验表明,该抗体具有中和甲肝病毒的能力。VMS11HAV25的免疫效果似优于本实验室已报道的另一株甲肝病毒基因重组于TK区的重组痘苗病毒Re41。     

棉铃虫核多角体病毒lef—3基因的序列分析

在棉铃虫核多角体病毒 (HelicoverpaarmigeraSingle nucleocapsidNucleopolyhedrovirus ,HaSNPV)基因组中发现了lef 3基因 ,该基因位于病毒基因组的BamHⅠ F片段上 ,全长 114 0bp ,编码 379个氨基酸 ,预计蛋白质分子量为 4 4kD ,启动子区具有TATAbox ,位于起始密码子ATG上游 4 0～ 4 3nt处 ,在终止密码子下游具典型的 poly(A)终止信号AATAAA。并且在它的氨基酸序列的N -端也具有一个类似SSB保守序列的基元结构     

病毒ki-ras表达质粒的构建

用重组DNA技术构建了病毒ki-ras表达质粒,用Eco R Ⅰ和Bam H Ⅰ酶解pUC-9DNA,小牛肠碱性磷酸酶脱磷酸,病毒ki-ras编码基因来源于Hi-Hi-3质粒DNA的Sat Ⅱ和Eco R Ⅰ酶切的0.6kb片段,用连接酶和DNA聚合酶Klenow片段将两个片段连接,转化大肠杆菌JM103,免疫筛选表达质粒,从156个转化克隆中得到两株表达质粒,其中一株pKras83的p21蛋白表达量为细菌总蛋白量的10％。     

异源多角体蛋白对家蚕核型多角体病毒粒子的包装

利用PCR方法从AcMNPV基因组DNA中分离出多角体蛋白基因 ,将该扩增片段克隆到转移载体pBacPAK8中 ,得到重组转移载体pOAc。将该质粒DNA与线性化的Bm BacPAK6病毒基因组DNA共传染BmN细胞 ,得到了能形成多角体且不产生蓝色空斑的重组病毒hp BmNPV。纯化该重组病毒的多角体颗粒 ,并对多角体蛋白、病毒核酸及多角体病毒颗粒进行分析 ,发现AcMNPV的多角体蛋白能在家蚕细胞中大量表达且能在细胞内识别家蚕核型多角体病毒并组装成多角体颗粒 ;病毒基因组DNA因部分交换 ,其酶切行为发生了相应的变化 ;电镜观察发现经AcMNPV多角体蛋白包装的家蚕核型多角体病毒的多角体颗粒大小为1 2 μm～ 2 9μm ,明显小于野生型家蚕核型多角体病毒的多角体颗粒     

痘苗病毒天坛株全基因组结构特点的分析

通过我国痘苗病毒天坛株(疫苗株)全基因组核苷酸序列的测定,对痘苗病毒基因组的一级结构进行了详细的分析,发现天坛株全基因组由189274个碱基对和碱基组成,与其它痘苗病毒株相比,在病毒基因组旁侧区限制性内切酶Hind Ⅲ-C,B及中央区Hind Ⅲ-A片段出现多个DNA片段的缺失和新的DNA片段的插入,这些片段中编码的某些多肽目前已知与病毒的生物学性状有关,对阐明痘苗病毒疫苗株与非疫苗株毒力上的差别及正痘病毒属成员的致病机理等方面的研究提供了线索.除此之外,有关病毒启动子、开放读码框架的分布特点、G+C含量及密码子使用频率等基因组结构特点的分析,也为研究基因表达的调控机制和利用该病毒作为载体进行基因工程重组疫苗的开发奠定了基础.