藻红蓝蛋白β亚基体内重组及其色谱分析

藻胆蛋白是蓝藻中的捕光蛋白,其生物合成的重要一步是藻胆色素与脱辅基蛋白的连接.大多数藻胆色素的正确连接都需要结合位点专一和对色素的构象有选择性的裂合酶来催化完成,但是这方面的报道不是很多.藻红蓝蛋白由两个亚基组成,β亚基(简称β-PEC)含171个氨基酸残基及两个辅基色素藻蓝胆素(简称PCB),分别在Cys-84和Cys-155位以硫醚键共价相连.通过同源性分析获得的由编号为alr0617基因编码的蛋白为藻红蓝蛋白β亚基(β-PEC)中的Cys-84与PCB的连接的催化酶.为了研究层理鞭枝藻藻红蓝蛋白(PEC)β亚基(β-PEC)中藻蓝胆素(PCB)与脱辅基蛋白的连接机制,通过体内重组方式得到色素蛋白PCB-PecB(C155I),分析表明该色素蛋白与β-PEC的吸收光谱和荧光光谱一致.酸性尿素变性实验证明得到的色素蛋白中的藻蓝胆素PCB没有被破坏.使用胃蛋白酶对天然藻红蓝色素蛋白和重组藻红蓝色素蛋白进行相同条件的水解并得到各自的色素肽,高效液相色谱分析表明这两种色素肽相同,由此证明了编号为alr0617基因编码的蛋白质能催化PCB与PecB(C155I)正确共价偶联.     

藻蓝蛋白裂合酶CpeS半胱氨酸的定点突变及功能研究

藻蓝蛋白β亚基(简称β-CPC)中有2个色素结合位点(Cys-84和Cys-155)分别以硫醚键与藻蓝胆素(PCB)连接[1,2].     

藻红蓝蛋白裂合异构酶对几种脱辅基藻胆蛋白的催化作用

PecE/PecF是层理鞭枝藻藻红蓝蛋白α亚基(α-PEC)生物合成的裂合异构酶。以4种脱辅基藻胆蛋白为底物,初步研究了PecE/PecF对底物蛋白的催化专一性。结果表明,PecE/PecF可催化藻蓝胆素(PCB)与高度同源的层理鞭枝藻不同亚种的α-PEC脱辅基蛋白的体外重组,也可催化经128位Trp定点突变到Phe而得到的α-PEC脱辅基蛋白的体外重组,但PecE/PecF对PCB与藻蓝蛋白α亚基(α-CPC)脱辅基蛋白的体外重组无催化作用。A-PEC脱辅基蛋白的重组不受表面活性剂Triton X-100的影响,而Triton X-100可改进PCB与α-CPC脱辅基蛋白的重组。     

鱼腥藻PCC7120基因a115292和alr0647的初步研究

通过BLAST软件分别对藻胆蛋白裂合酶（biliprotein lyase）编码基因cpcS和cpcT进行同源搜索分析,在鱼腥藻（Anabaena）PCC7120中获取了同源基因all5292和alt0647。同源分析发现,这两个基因所编码氨基酸序列与其相对应的裂合酶氨基酸序列相似程度分别达到53．4％和61．4％。随后,对这两个基因进行了初步研究。结果显示：All5292和Alr0647无论单独还是共同表达均没有裂合酶催化藻蓝胆素PCB结合到藻蓝蛋白（phycocyanin）或藻红蓝蛋白（phycoerythrocyanin）β亚基上的功能。通过在不同生理条件下对鱼腥藻PCC7120的培养,还对这两个基因的调控表达进行了初步的探索。结果表明：all5292和alr0647的表达与氮源的缺乏与否有联系,在氮胁迫条件下两个基因均进行了转录而在氮源充足的情况下则没有表达。     

鱼腥藻PCC7120基因all5292和alr0647的初步研究

通过BLAST软件分别对藻胆蛋白裂合酶(biliprotein lyase)编码基因cpcS和cpcT进行同源搜索分析,在鱼腥藻(Anabaena)PCC7120中获取了同源基因all5292和alt0647.同源分析发现,这两个基因所编码氨基酸序列与其相对应的裂合酶氨基酸序列相似程度分别达到53.4%和61.4%.随后,对这两个基因进行了初步研究.结果显示:All5292和Air0647无论单独还是共同表达均没有裂合酶催化藻蓝胆素PCB结合到藻蓝蛋白(phycocyanin)或藻红蓝蛋白(phycoerythrocyanin)B亚基上的功能.通过在不同生理条件下对鱼腥藻PCC7120的培养,还对这两个基因的调控表达进行了初步的探索.结果表明:all5292和alt0647的表达与氮源的缺乏与否有联系,在氮胁迫条件下两个基因均进行了转录而在氮源充足的情况下则没有表达.     

鱼腥藻PCC7120藻红蓝蛋白α亚基体内重组研究

为了研究藻红蓝蛋白α亚基的生物合成途径,通过构建相容的4种重组质粒pETDuetp-ecA、pCOLADuet-pecE、pCDFDuetp-ecF和pACYCDuet-ho1-pcyA,将裂合酶基因pecE和pecF、血红素氧化酶基因ho1、藻蓝胆素合成酶基因pcyA和脱辅基藻红蓝蛋白α亚基基因pecA共同转入大肠杆菌BL21(DE3),通过色素蛋白锌电泳和光谱检测表明产生了生物活性的PecA-PCB。结果表明生成的色素藻胆蛋白具有藻红蓝蛋白α-亚基所特有的光谱性质和可逆光致变色性质。而在裂合酶基因pecE和pecF不转入大肠杆菌的情况下,大肠杆菌内只有0.1%的PecA-PCB产生。以上研究对藻胆蛋白生物构建具有重要意义。     

鱼腥藻PCC7120藻蓝蛋白α亚基体内重组研究

为了研究藻蓝蛋白α亚基的生物合成途径,通过构建相容的3种重组质粒pETDuet-cpcA、pCOLADuet-cpcE-cpcF和pACYCDuet-ho1-pcyA,将裂合酶基因cpcE和cpcF、血红素氧化酶基因ho1、藻蓝胆素合成酶基因pcyA和脱辅基藻蓝蛋白α亚基基因cpcA共同转入大肠杆菌BL21(DE3)。通过色素蛋白锌电泳和光谱检测表明产生了生物活性的CpcA-PCB。成功实现了大肠杆菌内藻蓝蛋白α亚基84位半胱氨酸残基与PCB的连接。而在裂合酶基因cpcE和cpcF不转入大肠杆菌的情况下,大肠杆菌内只有0.2%的CpcA-PCB产生。以上研究为进一步在大肠杆菌内合成天然的藻蓝蛋白奠定了基础。     

鱼腥藻PCC7120藻蓝蛋白α亚基体内重组研究

为了研究藻蓝蛋白α亚基的生物合成途径,通过构建相容的3种重组质粒pETDuet-cpcA、pCOLADuet-cpcE-cpcF和pACYCDuet-ho1-pcyA,将裂合酶基因cpcE和cpcF、血红素氧化酶基因ho1、藻蓝胆素合成酶基因pcyA和脱辅基藻蓝蛋白α亚基基因cpcA共同转入大肠杆菌BL21(DE3)。通过色素蛋白锌电泳和光谱检测表明产生了生物活性的CpcA-PCB。成功实现了大肠杆菌内藻蓝蛋白α亚基84位半胱氨酸残基与PCB的连接。而在裂合酶基因cpcE和cpcF不转入大肠杆菌的情况下,大肠杆菌内只有0.2%的CpcA-PCB产生。以上研究为进一步在大肠杆菌内合成天然的藻蓝蛋白奠定了基础。     

鱼腥藻PCC7120基因all5292和alr0647的初步研究

通过BLAST软件分别对藻胆蛋白裂合酶(biliprotein lyase)编码基因cpcS和cpcT进行同源搜索分析,在鱼腥藻(Anabaena)PCC7120中获取了同源基因all5292和alr0647。同源分析发现,这两个基因所编码氨基酸序列与其相对应的裂合酶氨基酸序列相似程度分别达到53.4%和61.4%。随后,对这两个基因进行了初步研究。结果显示:All5292和Alr0647无论单独还是共同表达均没有裂合酶催化藻蓝胆素PCB结合到藻蓝蛋白(phycocyanin)或藻红蓝蛋白(phycoerythrocyanin)β亚基上的功能。通过在不同生理条件下对鱼腥藻PCC7120的培养,还对这两个基因的调控表达进行了初步的探索。结果表明:all5292和alr0647的表达与氮源的缺乏与否有联系,在氮胁迫条件下两个基因均进行了转录而在氮源充足的情况下则没有表达。     

抗人AFP单链抗体与藻胆蛋白融合蛋白的构建、表达与活性分析

目的:构建多基因表达载体,在大肠杆菌中同时表达AFP单链抗体(scFv)和蓝藻别藻蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白(apcA)组成的融合蛋白(scFv-apcA)、藻胆蛋白裂合酶(cpcS)及藻红蛋白生物合成酶(Ho1和pebS),获得共价结合藻红胆素的融合蛋白(scFv-apcA-PEB)。方法:利用融合PCR将scFv和apcA基因连接起来,形成scFv-apcA融合基因,并将该融合基因与cpcS克隆到表达载体pCDFDuet-1中;将Ho1和pebS基因克隆到表达载体pRSFDuet-1中。将两种载体共转化到大肠杆菌中,IPTG诱导重组蛋白表达,经亲和层析获得重组蛋白,通过光谱学分析和抗体竞争性抑制法,测定重组蛋白的生物学活性。结果:成功表达融合蛋白scFv-apcA-PEB,分子质量约为45kDa,与理论值相符,其最大吸收峰为549.5nm,最大荧光发射峰为560nm,竞争抑制ELISA法初步鉴定活性,竞争抑制率达到48%。结论:利用大肠杆菌表达系统,获得了同时具有荧光特性和免疫学活性的重组蛋白。     

Synechococcus sp. Strain WH8102藻红蛋白裂合酶 CpeY、CpeZ的克隆、表达及功能研究

通过蛋白质序列相似性分析,在Synechococcus sp. strain WH8102里面找到了与Fremyella diplosiphon的藻红蛋白裂合酶编码基因cpeY、cpeZ同源的基因SYNW2013、SYNW2012,分别命名为cpeY-Syn、cpeZ-Syn。通过分子克隆技术,将其构建在不同的表达载体上。通过大肠杆菌体内表达系统,藻红胆素(PEB)在CpeY-Syn和CpeZ-Syn的共同催化下,共价连接到藻红蛋白α亚基脱辅助基蛋白CpeA上,生成色素蛋白PEB-CpeA。实验也表明,在缺少CpeY-Syn的情况下,不能产生色素蛋白,而在缺少CpeZ-Syn的情况下,色素蛋白产率有所降低。与CpcE/F催化藻蓝蛋白α亚基共价连接藻蓝胆素(PCB)一样,CpeY/Z-Syn专一性的催化藻红蛋白α亚基与PEB的连接,它们属于同一类的蛋白家族。     

别藻蓝蛋白的聚集态研究

为了研究鱼腥藻PCC7120（Anabaena sp．PCC7120）中别藻蓝蛋白（APC）α和β亚基（α-APC和β-APC）中藻蓝胆素（PCB）与脱辅基蛋白的生物合成,并在蓝藻体外对这两种色素蛋白PCB—ApcA和PCB-ApcB合成时聚集过程进行分析,通过多种组合的质粒在大肠杆菌体内共同表达进行重组。色素蛋白的吸收和荧光光谱以及Zn电泳表明,在大肠杆菌体内同时得到色素蛋白PCB—ApcA和PCB—ApcB,并且体内重组色素蛋白的细胞荧光光谱显示,色素蛋白以三聚体的形式存在,而破碎细胞后所得上清液所显示的光谱特征为单聚体的特征。     

藻蓝蛋白裂合酶CpeS色氨酸定点诱变及体内重组功能研究

为了研究藻蓝蛋白β亚基Cys-84裂合酶CpeS结构与功能的关系以及色氨酸残基对于该酶功能的影响,构建了藻蓝蛋白β亚基Cys-84裂合酶CpeS的两个色氨酸突变体,分别为CpeS（W14I）和CpeS（W75S）。通过体内重组检测酶活性的变化,研究色氨酸残基的突变对裂合酶催化活性的影响。重组结果显示：突变体CpeS（W14I）的催化活性几乎完全丧失,为野生型的8％;突变体CpeS（W75S）的催化活性为野生型的76％。由此推测,第14位色氨酸可能是CpeS酶活性的必需氨基酸,其所处的位置可能是裂合酶CpeS的活性位点。     

优化培养基增加层理鞭枝藻藻胆蛋白产量

藻胆蛋白(phycobiliprotein)是蓝藻和红藻藻胆体的组成部分,是光合作用集光复合体的组成部分,一般由α和β亚基构成,每个亚基含1～4个辅基色素,从而使藻胆蛋白具有特定的光谱吸收性质。根据这些吸收光谱性质,可以将藻胆蛋白分为:别藻蓝蛋白(APC)、藻蓝蛋白(PC)和藻红蛋白(PE)等,在某些缺乏PE而有异形胞的蓝藻中存在充当PE天线捕光功能的藻红蓝蛋白(PEC)〔1〕。藻胆蛋白可用于天然食用色素、化妆品色素和制药行业,还可作为免疫检测、荧光显微技术和流式细胞荧光测定法技术方面的荧光探针。特别是本工作研究的层理鞭枝藻(简称M.laminosu…     

藻红蓝蛋白α-亚基脱辅基蛋白与藻蓝胆素的重组

利用在大肠杆菌中表达的藻红蓝蛋白α－亚基脱辅基蛋白与藻蓝胆素PCB重组,吸收光谱、荧光光谱和高效可逆光化学性质分析表明,藻红蓝蛋白α－亚基脱辅基蛋白与藻蓝胆素直接重组,生成的胆素蛋白中辅基色素仍为藻蓝胆素;而藻红蓝蛋白α-亚基脱辅基蛋白与藻蓝胆素在藻红蓝蛋白α－亚基重组酶（pecE和pecF基因的表达产物）催化下重组,生成的胆素蛋白中辅基色素转变为藻紫胆素,并具有高效可逆光化学特性。     

层理鞭枝藻藻红蓝蛋白E基因片段的克隆与表达

藻胆蛋白(Phycobiliprotein)是存在于蓝藻、红藻和隐藻中的一类捕光色素蛋白,可分为藻红蛋白(简称PE),藻蓝蛋白(简称PC),别藻蓝蛋白(简称APC)和藻红蓝蛋白(简称PEC).藻胆蛋白连有发色团辅基色素-藻胆色素(Phycobilins),藻胆色素分四类:藻蓝胆素(简称PCB),藻红胆素(简称PEB),藻尿胆素(简称PUB)和藻紫胆素(简称PVB)1.       

集胞藻6803藻胆体别藻蓝蛋白多克隆抗体的制备

藻胆体是蓝藻细胞主要的捕光天线色素超分子复合体,主要由核心体和外围的杆两部分组成,核心体主要由别藻蓝蛋白组装而成,参与光能向光合作用反应中心的传递.该研究通过PCR扩增出集胞藻6803别藻蓝蛋白α亚基(ApcA)编码基因apcA,构建表达质粒pET-32a(+)-apcA,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS菌株中;通过IPTG诱导表达重组蛋白,并利用组氨酸标签将可溶性目的蛋白进行亲和纯化后,免疫日本大耳白兔,从而获得多克隆抗体.间接ELISA法揭示ApcA抗体效价可高达1∶1 025 000;蛋白免疫印迹确定该抗体具有高度特异性.表明该研究成功制备了集胞藻6803藻胆体别藻蓝蛋白多克隆抗体,为进一步研究藻胆体的核心体在光能传递过程中所承担的重要生理角色奠定了生化基础.     

层理鞭枝藻藻蓝蛋白E和F基因的克隆及序列分析

克隆并测定了层理鞭枝藻藻蓝蛋白E和F基因全序列,通过将其氨基酸序列与其他蓝藻的相应序列进行比较,表明层理鞭枝藻中cpcE,cpcF所编码的蛋白质是层理鞭枝藻中α-CPC生命合成的连接酶。     

藻胆蛋白研究

藻胆蛋白是大量出现于红藻 (Ｒｈｏｄｏｐｈｙ ｔａ)、蓝绿藻 (Ｃｙａｎｏｐｈｙｔａ)和隐藻 (Ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｔａ)中的捕光色素蛋白 ,主要包括藻红蛋白、藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白三种。藻胆蛋白把捕获的光能高效地传递给叶绿素 ,从而使海藻的光合作用得以发生[1] 。细菌、藻类和高等植物的光合作用的共同特征是具有很多“天线分子” ,这些“天线分子”吸收光能并通过非放射性过程将激发能传递到含有叶绿素的“反应中心” ,在红藻、蓝绿藻和隐藻中 ,藻胆蛋白就充当这种“天线分子”的角色。因此 ,最初的藻胆蛋白研究主要集中在探讨其光合作…