毕赤酵母分泌表达JEV prME蛋白及其形成病毒样颗粒的免疫原性鉴定

应用毕赤酵母分泌表达日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)prME蛋白,鉴定其表达效果与免疫原性,以期为JEV亚单位疫苗的研制奠定基础。RT-PCR扩增JEV SA14-14-2株prME基因,将其连接到毕赤酵母表达载体pPICZa-A,分别获得pPICZa-prME和携带JEV Cap蛋白C末端19个Aa信号肽的pPICZa-SprME质粒。表达载体用PmeⅠ酶切线性化,通过电转化转入毕赤酵母X33并诱导发酵培养。利用SDS-PAGE和Western blotting鉴定酵母发酵上清中目的蛋白的表达情况。利用GE蛋白层析纯化柱纯化目的蛋白,利用电镜观察纯化前后的目的蛋白,将不同剂量纯化后的prME蛋白与弗氏佐剂混合以及定量纯化后的prME蛋白与不同剂量的核酸佐剂混合分别免疫4周龄小鼠,定期采血,ELISA检测被免小鼠血清的抗体水平,空斑减少试验测定抗体中和效价。SDS-PAGE结果表明毕赤酵母可以分泌表达完整的prME蛋白,目的蛋白在70–100 kDa之间;Western blotting结果显示分泌表达的prME蛋白具有良好的反应原性,进一步证明prME蛋白在酵母X33中以整体的形式分泌表达,没有发生水解切割。纯化目的蛋白,根据洗脱时间和体积表明其分子量大于1×10~6 Da,因此推断prME蛋白可能形成多聚化的颗粒。电镜观察发现直径30–50 nm的病毒样颗粒(Virus like particles,VLPs)。免疫试验结果表明,纯化后的重组蛋白10–15μg/只接种小鼠在3周后抗体达到高峰值,之后逐渐下降,免疫7周后小鼠血清仍可检测到JEV抗体。将prME VLPs以10μg/只的剂量与不同剂量的核酸佐剂配伍后接种小鼠,ELISA检测结果表明核酸佐剂可明显增强JEV prME VLPs免疫应答,免疫4周后小鼠血清的中和抗体效价为1∶80–1∶160。上述结果表明毕赤酵母表达JEV prME虽不能发生水解切割,但仍可形成VLP并诱导免疫小鼠产生较高水平中和抗体。     

携带FMDV前导蛋白基因逆转录病毒载体的构建及其在牛肾细胞中的表达

以口蹄疫病毒株OA/58 RNA为模板, 反转录并扩增目的cDNA。通过分子克隆技术将前导蛋白编码序列Lab与逆转录病毒载体pBPSTR1连接, 将构建正确的重组载体命名为pBPSTR1-Lab。通过分别利用不同浓度的嘌呤霉素和四环素来确定最佳筛选浓度和最佳调控浓度, 结果显示嘌呤霉素的最佳筛选浓度为3 mg/mL, 四环素的最佳调控浓度为1 mg/mL。利用pBPSTR1-Lab和包装质粒pVSV-G双质粒瞬时转染Gp2-293包装细胞来获得重组逆转录病毒。利用重组逆转录病毒来感染牛肾细胞, 并连续筛选12天来获得阳性克隆。通过除去四环素来诱导目的基因在牛肾细胞中表达, 发现牛肾细胞病变死亡。经过PCR和蛋白质免疫印迹证实稳定表达前导蛋白的牛肾细胞系已经建立, 为今后研究前导蛋白致病机理提供了平台。     

携带FMDV前导蛋白基因逆转录病毒载体的构建及其在牛肾细胞中的表达

以口蹄疫病毒株OA/58 RNA为模板, 反转录并扩增目的cDNA。通过分子克隆技术将前导蛋白编码序列Lab与逆转录病毒载体pBPSTR1连接, 将构建正确的重组载体命名为pBPSTR1-Lab。通过分别利用不同浓度的嘌呤霉素和四环素来确定最佳筛选浓度和最佳调控浓度, 结果显示嘌呤霉素的最佳筛选浓度为3 mg/mL, 四环素的最佳调控浓度为1 mg/mL。利用pBPSTR1-Lab和包装质粒pVSV-G双质粒瞬时转染Gp2-293包装细胞来获得重组逆转录病毒。利用重组逆转录病毒来感染牛肾细胞, 并连续筛选12天来获得阳性克隆。通过除去四环素来诱导目的基因在牛肾细胞中表达, 发现牛肾细胞病变死亡。经过PCR和蛋白质免疫印迹证实稳定表达前导蛋白的牛肾细胞系已经建立, 为今后研究前导蛋白致病机理提供了平台。     

昆虫杆状病毒系统表达外源蛋白的糖基化

昆虫表达系统作为一类应用广泛的真核表达系统 ,具有与多数高等真核生物相类似的翻译后修饰的过程。但其生产的重组糖蛋白一般仅具有高甘露糖或寡甘露糖型糖链 ,难以生成复杂构型糖链成为该系统的缺陷之一。综述了目前昆虫杆状病毒系统表达外源蛋白的糖基化研究进展。     

用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统高效表达绿色荧光蛋白标记的HBVe抗原

通过基因工程操作,使乙型肝炎病毒ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）基因与绿色荧光蛋白基因（ＧＦＰ）融合,用新型Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ杆状病毒表达系统在昆虫细胞中高效表达了ＨＢｅＡｇ－ＧＦＰ双功能融合蛋白。经ＥＬＩＳＡ法和荧光显微镜观察证实,表达产物既能发射易于检测的绿色荧光,又具有ＨＢＶ的ｅ抗原活性,为免疫诊断新方法的建立进行了有益的探索     

用Bac-to-Bac杆状病毒系统表达人生长激素

利用Bac to Bac杆状病毒载体表达系统将人生长激素 (humangrowthhormone ,hGH)基因cDNA克隆至转移载体pFastBac1中 ,得到pFastBac hGH ,再将其转化进入含穿梭载体Bacmid的受体菌DH10Bac中 ,发生转座作用 ,得到含hGH基因的重组穿梭载体rBacmid hGH .纯化DNA ,直接转染培养的昆虫细胞Sf9,得到重组病毒rAcV Bac hGH .经酶切PCR及Southern杂交鉴定 ,hGH基因正确地插入病毒基因组的多角体蛋白基因启动子下 ,SDS PAGE测得产物蛋白分子量为 2 2kD左右 .用免疫化学发光法测得转染上清中hGH表达水平可达 18μg ml ,与用传统的BEVS表达hGH相比 ,转染上清中hGH表达水平提高 4 0 0倍以上     

转基因枸杞表达HIV-1壳体蛋白病毒样颗粒疫苗表达载体的构建

利用PCR技术扩增出人免疫缺陷病毒HIV-1MA₄-CA融合基因,将其克隆到pGEM-T载体中,测定其核苷酸序列,并推导其氨基酸序列。该基因全长为450bp,与已发表的HIV-1的全序列基因(AF324493)完全同源,编码一个含150个氨基酸残基的蛋白质。将该基因与分泌型表达载体pCAMBIA1305.2连接,同时将水稻中富含甘氨酸蛋白的信号肽序列(GRP)引入MA₄-CA融合基因,构建了含MA₄-CA基因的植物分泌表达载体pCAMBIA1305.2-MA₄-CA。     

杆状病毒表达系统——有效的VLP构建工具

杆状病毒表达系统是以杆状病毒为外源基因载体,昆虫细胞或活体昆虫为受体的真核表达系统。相对于其他表达系统,杆状病毒表达系统具有特殊的优势:杆状病毒基因组作为表达载体可以容纳更多外源基因;杆状病毒极晚期启动子能有效调控外源蛋白的表达;昆虫细胞作为受体能够对外源蛋白进行加工修饰;杆状病毒通常只感染节肢动物,不会对人畜构成危害。因此,该系统越来越受到人们的重视,并已应用于亚单位疫苗的研发与生产,特别其对于构建病毒样颗粒,即由一种或多种病毒结构蛋白自行装配而成且不含病毒基因组的蛋白颗粒,具有不可比拟的优势。对此做详细评述并展望病毒样颗粒疫苗的发展趋势。     

杆状病毒表达载体系统

杆状病毒表达载体系统是近年来发展起来的较高效的表达外源基因系统。由于多角体病毒中多角体蛋白基因的非必需性、高表达性、重组病毒的易鉴定等特性,以及多角体蛋白基因的强启动子使其特别适于基因工程中作为表达载体,借助于转移载体可将外源目的基因转移到野生型AcMNPV中,在一个被转移载体和野生型AcMNPV共转染的细胞内,可以通过同源重组完成目的基因的转移。应用不同的转移载体可表达出融合及非融合蛋白质。经该系统表达的重组蛋白质具有生物学活性,其中大部分进行翻译后剪接产生与天然蛋白质相似的重组蛋白质。这些产物的抗原性,免疫原性和功能都与天然蛋白质非常相似。目前,应用该系统已成功地表达了许多酶、生长因子、病毒抗原包括病毒的外壳蛋白等有生物活性的蛋白质。本文对如何最大限度表达外源基因及该表达系统的发展前景作了讨论。     

杆状病毒表达系统研究进展

介绍了杆状病毒表达系统的构建策略,载体发展情况及其表达外源基因的影响因素.杆状病毒表达系统在基因工程、药物开发、疫苗生产等方面发挥了越来越重要的作用,其表达效率高,表达产物与天然产物有相似的结构和活性,且对人畜无害,为当今基因工程研究中最有发展前途的表达系统.     

逆转录病毒表达系统及其在外源蛋白高效表达中的应用

逆转录病毒表达系统是一种新的重组蛋白高效表达系统,它由逆转录病毒载体,包膜蛋白载体和包装细胞系构成,在基因治疗和生物制药领域都有很大的应用潜力。逆转录病毒和宿主细胞基因组的重组倾向于发生在转录活性区;口炎疱疹病毒-G蛋白 (vesicular stomatitis virus G, VSV-G)能有效扩大逆转录病毒感染宿主细胞的范围、提高逆转录病毒的感染效率;用高滴度的重组病毒感染细胞,经过简单的筛选即可获得高表达细胞株。本文对逆转录病毒表达系统的组成、感染的特点和机制及其应用前景作了概述。     

杆状病毒表达系统的发展

杆状病毒是近年来被广泛用于高效表达外源蛋白的载体系统,本文就杆状病毒表达系统的生物学特性、转染载体、重组病毒的筛选、基因表达调控及其发展应用等方面作一概述。     

杆状病毒表达EV71病毒样颗粒的装配、制备纯化与鉴定

将EV71P1和3CD基因片段克隆入同一杆状病毒穿梭质粒Bacmid中,构建出重组杆状病毒表达质粒Bac-mid-P1-3CD;脂质体介导其转染Sf9昆虫细胞获得共表达P1和3CD的重组杆状病毒(AcMNPV-P1-3CD)。用IFA和Western-blot法对表达产物进行鉴定和分析。电镜结果显示P1经3CD切割装配成了大小约为27nm的类球形颗粒(即EV71VLPs)。进一步分析影响杆状病毒表达系统的因素以对表达条件进行优化,结果显示MOI值和时间均可影响目的蛋白的表达,其中时间是主要因素。选择优化后条件利用无血清培养基对贴壁Sf9细胞在多层细胞培养器中进行VLPs的大量表达,密度梯度离心法纯化,SDS-PAGE结果可见三条大小约为39kD、34kD和26kD的VP1、VP0和VP3特异性条带。纯化后EV71VLPs颗粒结构完好,为下一步EV71蛋白结构的基础研究和基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

携带HSV-1TK基因的逆转录病毒载体构建及在HeLa细胞中的表达

目的:构建携带单纯疱疹病毒脱氧胸腺嘧啶激酶基因(herpes simplex virus thymidine kinase,HSV-TK)的逆转录病毒,用于宫颈癌的治疗研究。方法:用限制性内切酶从质粒pcDNA3.1/HA-myc-His(-)Z-TK切下HSV-1TK cDNA序列,亚克隆入逆转录病毒载体pLXSN得到重组质粒pLXSN-TK,鉴定正确的阳性重组质粒经PA317细胞包装,G418筛选,在NIH3T3细胞进行病毒滴度测定。然后用病毒感染人宫颈癌细胞HeLa。PCR、RT-PCR和Western blotting方法检测HSV-1TK基因在HeLa中的整合和表达情况。结果:重组质粒pLXSN-TK经PA317细胞包装后收获病毒上清,感染HeLa细胞,检测发现HSV-1TK基因整合到细胞基因组DNA中,并且能有效的转录和翻译。结论:成功构建了逆转录病毒pLXSN-TK,该病毒能有效感染HeLa细胞,并使携带的治疗基因HSV-1TK在细胞中表达,为今后HSV-1TK基因治疗宫颈癌的研究奠定基础。     

昆虫杆状病毒表达系统研究进展

本文概括了昆虫杆状病毒的生物学、基因组结构和调控方面取得的进展,并对该载体系统的构建及外源基因的表达等研究作了评述。     

GST融合蛋白在杆状病毒系统中表达的可溶性研究

将构建好的可表达ＧＳＴ融合蛋白的重组病毒ＡｃＭＮＰＶ－ＯＣＣ＾－－ＧＳＴ－６ｘＨｉｓ－Ｅｔｐ２８感染Ｓｆ９细胞,一定时间后取感染了病毒的细胞裂解物上清液进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,结果显示５３ｋＤａ的融合蛋白（ＧＳＴ－６ｘＨｉｓ－Ｅｔｐ２８）呈不溶状态。在原有裂解液的基础上,加固体十二烷基肌氨酸钠致终浓度１．５％,并将Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００的比例由１％提高到２％。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果显示至少有１／     

GST融合蛋白在杆状病毒系统中表达的可溶性研究

将构建好的可表达GST融合蛋白的重组病毒AcMNPV-OCC--GST-6xHis-Etp28感染Sf9细胞,一定时间后取感染了病毒的细胞裂解物上清液进行SDS-PAGE分析,结果显示53kDa的融合蛋白(GST-6xHis-Etp28)呈不溶状态.在原有裂解液的基础上,加固体十二烷基肌氨酸钠至终浓度1.5%,并将Triton X-100的比例由1%提高到2%.SDS-PAGE结果显示至少有1/3的GST-6xHis-Etp28处于溶解状态,可溶性GST-6xHis-Etp28经亲合层析,53kDa的目标蛋白得到纯化.     

用Bac—to—Bac杆状病毒表达系统高效表达绿色荧光蛋白标记的HBVe抗原

通过基因工程操作,使乙型肝炎病毒ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）基因与绿色荧光蛋白基因（ＧＦＰ）融合,用新型Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ杆状病毒表达系统在昆虫细胞中高效表达了ＨＢｅＡｇ－ＧＦＰ双功能融合蛋白。经ＥＬＩＳＡ法和荧光显微镜观察证实,表达产物既能发射易于检测的绿色荧光,又具有ＨＢＶ的ｅ抗原活性,为免疫诊断新方法的建立进行了有益的探索。     

基于HPV16E7蛋白CTLs抗原肽的病毒样颗粒治疗性疫苗的构建

目的:构建呈递HPV16 E7 CTLs抗原表位的病毒样颗粒,并初步评价病毒样颗粒作为治疗性疫苗载体的潜能。方法:根据文献选择有效的HPV16 E7 CTLs表位,合成其正负链寡核苷酸序列,并通过退火形成双链DNA片段。将片段克隆于表达乙肝核心抗原的重组质粒p Thio His AHBc Ag,使抗原肽得以呈现于病毒样颗粒。重组菌经IPTG诱导后经SDS-PAGE鉴定目的蛋白表达。菌体破碎后经硫酸铵盐析法和蔗糖密度梯度离心进行纯化,并经高效液相凝胶过滤色谱和电镜鉴定病毒样颗粒的存在。制备的病毒样颗粒免疫接种了TC-1细胞的肿瘤模型小鼠,检测小鼠肿瘤大小。此外,在体外以抗原肽刺激脾细胞,以ELISA检测IFN-γ表达水平。结果:构建的三个重组表达质粒经酶切鉴定及测序分析证实构建正确。表达的重组蛋白大小与预期相符,并形成了病毒样颗粒。免疫小鼠后显示了抑制肿瘤增长的一定作用趋势。此外,抗原肽体外刺激促进了疫苗免疫小鼠脾细胞IFN-γ的表达,显示疫苗引起机体产生E7特异性的细胞免疫应答。结论:HBc Ag VLPs是有潜能的治疗性疫苗载体。