东北红豆杉细胞两液相培养中紫杉醇释放行为研究

在东北红豆杉细胞悬浮培养中,分别研究了稀土化合物(硫酸铈铵)、有机溶剂(油酸和邻苯二甲酸二丁脂)和稀土化合物与有机溶剂的协同作用对紫杉醇释放的影响。在此基础上深入研究了在东北红豆杉细胞两液相培养中,紫杉醇释放率随不同的有机溶剂(烷烃、有机酸、醇和脂)、有机溶剂的体积分数、有机溶剂的加入时间和有机溶剂相毒性的变化规律。结果表明分别加入稀土化合物和有机溶剂都明显促进紫杉醇的释放,特别是有机溶剂更显著促进紫杉醇的释放。但在东北红豆杉细胞两液相培养中,稀土化合物加入不能进一步促进紫杉醇的释放。因此两液相培养中有机溶剂本身就是很好的产物释放剂。紫杉醇的释放率由对照组的40%提高到75%以上。     

真菌诱导子对悬浮培养南方红豆杉细胞态势及紫杉醇合成的影响

在南方红豆杉细胞悬浮培养过程中,研究了在指数生长期的末期加入真菌诱导子(尖孢镰刀菌的胞壁组分粗提物)对细胞态势及紫杉醇合成的影响。结果表明,真菌诱导子能在短期内激发细胞的防御性应答反应而产生氧迸发,细胞的氧化还原态势发生了明显的变化,培养基发生碱化现象,表征酶含量的蛋白质含量明显提高,SOD、POD、CAT的活力出现波动性变化,并具有一定的时序性。同时,南方红豆杉悬浮培养体系中产次生代谢途径中重要的酶PAL的活力得到提高,紫杉醇的合成被加强,产量得到了显著提高,达到了对照组的5倍左右。     

补料培养与溶氧控制联合应用对红豆杉细胞培养的影响

为进一步提高红豆杉 (Taxuschinensis (Pilg.)Rehd .)细胞培养过程中紫杉醇的产量 ,采用细胞悬浮培养方法研究了补料培养与溶氧控制联合应用对紫杉醇产量的影响。 5L反应器中补料培养研究表明 ,培养过程中第 16天添加含 2 0g/L蔗糖的补料培养液有利于细胞的生长及紫杉醇的合成。 2 0L反应器中补料培养的研究结果表明 :2 0 %饱和度培养时紫杉醇含量最高 (0 .98mg/gDW) ,但 4 0 %～ 6 0 %溶氧饱和度能提高紫杉醇的产量。进一步研究表明 ,细胞在 6 0 %溶氧饱和度培养 2 0d后转入 2 0 %溶氧饱和度继续培养 12d ,能显著提高紫杉醇产量。补料培养与溶氧控制联合应用时 ,2 0L反应器中红豆杉细胞培养紫杉醇产量可达 18.7mg/L。     

补料培养与溶氧控制联合应用对红豆杉细胞培养的影响

为进一步提高红豆杉(Taxus chinensis (Pilg.) Rehd.)细胞培养过程中紫杉醇的产量,采用细胞悬浮培养方法研究了补料培养与溶氧控制联合应用对紫杉醇产量的影响.5 L反应器中补料培养研究表明,培养过程中第16天添加含20 g/L蔗糖的补料培养液有利于细胞的生长及紫杉醇的合成.20 L反应器中补料培养的研究结果表明:20%饱和度培养时紫杉醇含量最高(0.98 mg/g DW),但40%～60%溶氧饱和度能提高紫杉醇的产量.进一步研究表明,细胞在60%溶氧饱和度培养20 d后转入20%溶氧饱和度继续培养12 d,能显著提高紫杉醇产量.补料培养与溶氧控制联合应用时,20 L反应器中红豆杉细胞培养紫杉醇产量可达18.7 mg/L.     

植物细胞工程技术生产紫杉醇研究进展

紫杉醇是一种二萜类生物碱,主要从红豆杉树皮中分离提取。目前采用植物细胞工程技术是提高紫杉醇产率、保护稀缺资源红豆杉、解决紫杉醇药源紧缺的一种最有效方法。该文对近十年来国内外有关采用植物细胞工程技术生产紫杉醇的研究进展,包括红豆杉细胞系的建立、悬浮培养条件的研究、生物反应器培养以及紫杉醇合成代谢调控方面的最新研究进展进行综述。并重点论述了前体、诱导子和代谢支路抑制剂对红豆杉细胞悬浮培养生产紫杉醇的影响,为植物细胞工程技术生产紫杉醇提供借鉴和参考。     

条件培养液对红豆杉细胞Paclitaxel生产的促进作用

在两步法红豆杉（Taxus chinensis)细胞悬浮培养体系的生产阶段,加入从生长阶段悬浮培养物中制得的条件培养液（conditioned Medium,CM)既能促进细胞的生长,又能提高紫杉醇（paclitaxel)的产率,解决了生产培养时,细胞生长受抑制的问题,特别是,取自生长12天的细胞悬浮培养物的CM按体积分数为25％添加到新鲜生产培养基中时,可使细胞紫杉醇最高产量达28．5mg/L,细胞干重达32．3g/L,分别是对照的2．4倍和2．2倍,对CM中的蔗糖,果糖,NO3－和PO4－3等的含量的进行了分析。     

果糖和前体物质对紫杉醇生物合成的影响

研究了果糖和几种前体物质对东北红豆杉生产紫杉醇的影响,结果表明,在第12d加入6g/L果糖可以使紫杉醇产量增加63.89％,在糖协同的作用下,加入前体（0.05mmol/L乙酸钠,0.05mmol/L苯丙氨酸,0.1mmol/L苯甲酸钠）可显著提高紫杉醇的合成,同对照相比,含量分别增加49.36%、13.18%和64.26%,在第15d向培养基中加入0.05 mmol/L乙酸钠、0.1mmol/L苯甲酸钠、1mmol/L苯丙氨酸和6g/L果糖则使紫杉醇含量提高181.89％。     

影响南方红豆杉细胞生长及紫杉醇含量的因素

研究了影响南方红豆杉细胞生长及紫杉醇含量的稀土和氮源.结果表明 ,较低浓度(1×10-5 mol/L)的稀土元素对南方红豆杉细胞的生长及紫杉醇的合成有一定促进作用,较高浓度(1×10-4 mol/L)的稀土元素则起抑制作用.3种稀土中以使用10-5 mol/L的镱效果最好.当NH+4/NO-3质量浓度比例为2/25以及总氮源浓度为27 mmol/L时,细胞的生长率和紫杉醇的含量达到最大.     

培养基成分对南方红豆杉细胞生长的影响

紫杉醇是 70年代发现的一种非常有发展前途的抗癌新药。通过红豆杉细胞培养技术获得紫杉醇是一条很有工业化生产前景 ,可大量提供紫杉醇的途径。本文采用二相培养技术 ,初步探讨了不同的基本培养基、不同浓度蔗糖 ,以及氨基酸对细胞生长的影响。实验材料为本室继代培养的南方红豆杉 (Ｔａｘｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓｖａｒ ｍａｉｒｅｉ)Ｚ3细胞株。获得如下结果 :1 Ｂ5、ＳＨ、ＴＡ[张宗勤等 西北植物学报 ,1998,18(4 ) :488～ 492 ]、ＭＳ 4种培养基中 ,Ｂ5的盐类组合 (大量元素、微量元素、维生素 )对细胞的生长最为有利。在 40ｄ生长期…     

几种促进剂的添加时间对中国红豆杉细胞悬浮培养紫杉醇合成的影响

采用正交实验检测中国红豆杉[Taxus chinensis(Pilger)Rehd.]细胞悬浮培养中水杨酸、硝酸银、氨基酸前体、D-果糖和硫酸镧的添加时间对细胞生长和紫杉醇(taxol)积累的影响.这些促进剂的添加时间对中国红豆杉细胞悬浮培养的生长没有明显的影响,但能明显促进紫杉醇的合成,当在细胞培养的第14 d添加1.67 mg/L硝酸银,第18 d添加0.1 mg/L水杨酸,第21 d添加氨基酸前体,第21 d添加10 g/L D-果糖和2 mg/L硫酸镧时对紫杉醇的促进作用最明显,在此最优组合处理时紫杉醇含量达到10.05 mg/L,相对于最差组合处理时紫杉醇含量仅有1.77 mg/L,紫杉醇含量提高5.7倍,这些因素的添加时间对紫杉醇合成的相互作用达不到显著水平.     

前体、诱导子及抑制剂对细胞培养生产紫杉醇的调节作用

研究了前体、诱导子和抑制剂对中国红豆杉细胞培养生产紫杉醇的影响。结果表明 ,它们之间的协同作用对提高紫杉醇的产量有显著影响。其中向培养基中加入 30mg/L 3 甲基 2 丁烯 1 醇 ,2mmol/L苯甲酸钠 ,10mg/L氯化氯胆碱 (CCC) ,10 0 μmol/L茉莉酸甲酯 (MJ) ,0 1mmol/L丝氨酸 (Ser)可以使紫杉醇含量增加 1141 1%。     

叶面施肥对南方红豆杉针叶中紫杉醇和10-DAB含量的影响

人工栽培红豆杉已成为目前解决紫杉醇市场需求的主要途径,如何提高人工栽培的红豆杉中紫杉醇及其化学半合成前体10-脱酰基巴卡丁Ⅲ(10-DAB)的含量是一个十分关键的问题.对人工栽培南方红豆杉叶面喷施不同浓度的N、K、Ca、Mg 肥和自行配置的稀土混合肥(含La、Ce、Sm),连续4次跟踪采样,超高效液相色谱(UPLC)测定样品中紫杉醇和10-DAB的含量.结果表明,叶面喷施不同浓度的N元素均引起红豆杉针叶中紫杉醇和10-DAB含量的降低;喷施K元素,前期引起10-DAB含量的增加但随之降低,紫杉醇的含量则持续降低;喷施不同浓度的Ca、Mg提高了红豆杉中紫杉醇和10-DAB的含量,其作用可持续一段时间;自行配置的稀土混合肥明显地提高了紫杉醇和10-DAB的含量且其持续作用时间较长,紫杉醇和10-DAB的含量分别最高可达0.261mg g-1和0.641mg g-1.     

美丽镰刀菌培养液对东北红豆杉悬浮细胞防御反应及紫杉醇合成的影响

美丽镰刀(Fusarium mairei)是一分离自南方红豆杉(Taxus chinensis var.mairei)的产紫杉醇内生真菌,用B5培养基培养6 d,去菌尘幺后制得美丽镰刀菌培养液,并从中提取其胞外多糖.研究了4%(V/V)美丽镰刀菌培养液及4%(W/V)胞外多糖两种处理,对东北红豆杉(T.cuspidata)悬浮细胞防御反应及紫杉醇合成的影响.结果表明:两种处理均能诱导东北红豆杉细胞的防御反应.但美丽镰刀菌培养液的影响明显大于胞外多特(P<0.05).另外,两种处理均可促进东北红豆杉细胞紫杉醇的合成与释放.美丽镰刀菌培养液处理得到的紫杉醇与其释放率分别是对照的2.5倍8.8倍,而胞外多糖处理得到的紫杉醇与其释放率则分别是对照的1.5倍与3倍.     

南方红豆杉毛状根诱导体系的建立及毛状根中 紫杉醇的分离纯化研究

目的:研究发根农杆菌对南方红豆杉转化的转化体系和毛状根中紫杉醇的提取纯化工艺;方法:采用发根农杆菌对南方红豆杉不同外植体进行诱导,并对影响毛状根转化的因素进行分析。采用超临界CO2流体萃取法、硅胶柱色谱法以及高效液相法对毛状根中的紫杉醇进行分离提纯;结果:成功构建了南方红豆杉毛状根诱导体系。其中农杆菌的种类、外植体类型、预培养和共培养时间、培养基中激素浓度均影响毛状根的转化率。毛状根经高压纸电泳检测显示表达冠瘿碱。毛状根中紫杉醇经超临界CO2法提取及硅胶柱色谱法分离提纯,采用高效液相法分析显示其纯度可达到98%。结论:发根农杆菌诱导南方红豆杉产生的毛状根中可产生紫杉醇,可作为紫杉醇的主要来源。     

内生真菌培养液对东北红豆杉细胞生长及紫杉醇合成的影响

产紫杉醇的内生真菌(Fusarium mairei)先培养在B5液体培养基中, 然后制备成内生真菌培养液。在东北红豆杉(Taxus cuspidata)细胞悬浮培养的不同阶段(5、10和15天), 用不同剂量的内生真菌培养液(2、4和6 mL)分别进行处理。结果表明,在用4 mL内生真菌培养液处理的植物细胞中可获得最高的紫杉醇产量(5.88 mg.L-1)与释放率(67%), 分别是对照的1.9 倍与5.6 倍。添加时间方面, 在植物细胞培养周期的第5天添加4 mL内生真菌培养液, 可获得最佳效果, 紫杉醇产量与释放率分别为6.1 mg.L-1与75%, 分别是对照的2倍与6.8倍。与其它诱导子相比, 4 mL内生真菌培养液不仅可提高紫杉醇的释放率, 而且不会引起东北红豆杉细胞膜的明显伤害, 说明内生真菌发酵液激活了紫杉醇主动运输过程中的相关酶类。     

高产紫杉醇菌株发酵条件优化

目的:优化WY2菌株发酵条件,提高紫杉醇的产量,为后续研究奠定基础。方法:采用不同的培养基、初始pH、温度、摇床转速、培养时间对曼地亚红豆杉内生真菌进行组合优化培养,测定其对紫杉醇产量的影响。通过正交试验,进一步探究前体物质对紫杉醇产量的影响。结果:使用YES发酵培养基,初始pH值为6.0,培养温度为30℃,摇床转速200r/min为最佳培养条件。当向培养基中加入20mg/l的苯丙氨酸、10mg/l的乙酸铵、5mg/l的络氨酸、20mg/l的甘氨酸时,紫杉醇产量显著提高,达到547μg/l,比初始产量高337%。结论:按照优化后的培养条件,添加合适的前体物质,能够显著提高紫杉醇的产量,满足更大的医药需求。     

茉莉酸甲酯对中国红豆杉胚性细胞紫杉醇生物合成的影响

紫杉醇(taxol)是一种复杂的二萜类生物碱,最初是从红豆杉类(Taxus)植物的树皮中分离出来的。紫杉醇作为具有广谱抗肿瘤活性的药物而得到广泛的临床应用,成为当今世界上有效的抗癌药物之一,但其天然资源十分稀少,解决其药源问题就显得非常重要。目前,普遍认为采用红豆杉细胞悬浮培养生产紫杉醇是很有希望的途径之一。而提高红豆杉细胞生长速率以及细胞中紫杉醇的含量是实现细胞悬浮培养生产紫杉醇的两个关键因素,笔者研究了茉莉酸甲酯(methyl-jasmonate,简称MJ)在红豆杉细胞培养中的代谢调节作用。茉莉酸甲酯是茉莉属(Jasminum)中的素馨花…     

联合调控对中国红豆杉细胞关键酶基因表达的影响

红豆杉悬浮培养细胞可以持续提供抗癌药物紫杉醇及一些紫杉烷类。在中国红豆杉悬浮培养细胞中,云南紫杉烷C(Tc)是主要的紫杉烷。为了更理性地调控紫杉醇或有用紫杉烷的生产,有必要深入了解其生物合成过程。采用实时定量PCR(Real-time Quantitative PCR,即RQPCR)技术考察经调控后紫杉醇及紫杉烷代谢中关键酶基因—TASY,T5αH,TDAT,T10βH,TαH,T14βH表达水平的变化。在细胞培养的第7天和12天,分别以100μmol/L2,3-二羟丙基茉莉酸(DHPJA)诱导,同时在细胞培养第7天进行20g/L蔗糖饲喂、100g/LXAD-7HP的原位吸附。该联合调控处理使得细胞培养第30天时,Tc产量高达1517±37mg/L,是对照处理的11.1倍,是DHPJA重复诱导联合蔗糖饲喂处理的1.7倍。RQ-PCR结果显示:DHPJA的加入可使6个基因表达水平显著提高,但在12小时后快速下降,需补充DHPJA以再次提高基因表达水平。吸附剂同时引入会延缓基因表达水平的提高速度,但却能维持基因表达处于一个较高的水平,表现为在细胞培养中后期,基因表达水平将显著高于无吸附剂的调控体系。与13α-羟化相对应的TαH基因有所不同,吸附剂的存在更显著地抑制其表达,但仍有维持表达的功能。     

云南红豆杉细胞的悬浮培养

在云南红豆杉细胞悬浮培养中,适宜的培养基为B5,接种量为0．5～0．8g干重细胞／100ml培养基,2,4－D浓度为1．0mg／L;培养细胞的生长周期约30d;培养基中较高浓度的蔗糖（40g／L）可提高紫杉醇含量;添加的椰子汁（CM）、酪蛋白氨基酸（C）和水解乳蛋白（LH）3种有机添加剂均能提高培养细胞中紫杉醇的含量,但只有CM和CA能促进细胞的生长。于B5培养基中添加不同浓度的NH4NO3对培养细胞无明显影响。     

聚乙二醇对东北红豆杉培养细胞的生长及紫杉醇生产的影响

在改良的B5培养基中加入不同浓度的聚乙二醇对东北红豆杉培养细胞进行摇瓶培养,通过不同时期取样并测定细胞鲜,干重及用HPLC测定紫杉醇的含量,发现聚乙二醇对东北红豆杉培养细胞的生长及紫杉醇生产均有明显的促进作用,聚乙二醇为10g/L时,对细胞生长最为有利,细胞培养16d可达到最大生物量,其平均鲜重为28．73g/瓶,增重3．8倍,平均干重为2．14g/瓶,增重3．1倍,聚乙二醇为20g/L,对紫杉醇的生产最有利;细胞培养25d时,培养基中紫杉醇的含量达到最高水平,其含量为2350ug/L,是不加聚乙二醇的11倍。