美洲商陆一种抗真菌蛋白的cDNA克隆及序列分析

根据美洲商陆种子中一种抗真菌蛋白ＰＡＦＰ的Ｎ端部分氨基酸顺序,设计,合成一条５‘端寡核苷酸引物,通过３’－ＲＡＣＥ技术从种子总ＲＮＡ扩增出一约３５０ｂｐ的ｃＤＮＡ片段,成功地克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体系统中。序列分析该,ｃＤＮＡ含有１１４ｂｐ的编码区,由此推导的３８个氨基酸序列有３６个与ＰＡＦＰ的序列相同,仅在第３５,３６位氨基酸分别由Ｃｙｓ,Ｌｙｓ代了后者的Ｇｌｎ和Ｉｌｅ。     

美洲商陆抗病毒蛋白-Ⅱ基因的克隆和表达

根据报道的cDNA序列,用RT-PCR的方法从美洲商陆夏季的叶片中克隆美洲商陆抗病毒蛋白-Ⅱ(pokeweedantiviralproteinⅡ,PAP-Ⅱ)基因。将PAP-Ⅱ基因克隆至表达载体pET-28a( )并在大肠杆菌中表达,SDS-PAGE电泳分析结果表明,PAP-Ⅱ蛋白在BL21(DE3)菌中获得表达,表达产物以不溶性包涵体形式存在,经过溶解包涵体、复性和BBSTNTA树脂柱亲和层析纯化,获得高纯度的PAP-Ⅱ蛋白。用非放射性基于ELISA方法检测经过复性纯化后PAP-Ⅱ蛋白和蓖麻毒素A链(RTA)在体外对HIV-1整合酶有较强的抑制活性,其IC50分别约为303μg/mL,220μg/mL。用MTT法分析PAP-Ⅱ蛋白的生物学活性,复性纯化后蛋白对HEP-G2和Hela细胞有细胞毒作用,IC50分别为93μg/mL,102μg/mL,说明了PAP-Ⅱ蛋白能抑制肿瘤细胞的生长。构建的PAP-Ⅱ表达系统所表达的蛋白经复性后具有生物学活性,为进一步研究PAP-Ⅱ的抗HIV-1机制和抗肿瘤作用奠定了基础。     

美洲商陆抗病毒蛋白研究进展

美洲商陆抗病毒蛋白（pokeweed antiviral proteins,PAP)是一类具多种生物功能和活性的蛋白,本在阐述了该类蛋白的生化等特性的同时,综述了该类蛋白在抗植物病毒,抗动物病毒以及用作免疫毒素等方面的研究进展。     

美洲商陆抗病毒蛋白的研究

美洲商陆抗病毒蛋白(pokeweed antiviral proteins.PAP)是一种具有多种生物功能活性的蛋白质,其在广谱抗病毒方面有重要的应用价值。综述美洲商陆抗病毒蛋白的分子结构与功能,抗病毒的分子机理及其在植物基因工程中的应用。     

美洲商陆核基因组抗病毒蛋白基因的克隆及序列分析

通过ＰＣＲ扩增,从美洲商陆（Ｐｈｙｔｏｌａｃａａｍｅｒｉｃａｎａ）核基因组中克隆了商陆抗病毒蛋白基因,序列分析表明,该基因含８８５个核苷酸,与已报道的序列比较,核苷酸同源性为９９３％。     

美洲商陆核基因组抗病毒蛋白基因的克隆及序列分析

通过ＰＣＲ扩增,从美洲商陆（Ｐｈｙｔｏｌａｃａａｍｅｒｉｃａｎａ）核基因组中克隆了商陆抗病毒蛋白基因,序列分析表明,该基因含８８５个核苷酸,与已报道的序列比较,核苷酸同源性为９９．３％。     

几种破除美洲商陆种子休眠的方法

选取饱满籽粒的美洲商陆(Phytolacca americana L.)种子,用以下方法破除种子休眠:(1)98%H2SO4浸种20、40、60min;先用98%H2SO4浸泡40min,再分别用100、200、300、400mg·L-1的赤霉素(GA3)浸种60min。(2)用去离     

美洲商陆PaENO基因克隆及其表达分析

烯醇化酶(enolase,ENO)作为糖酵解途径的一个酶,还能够参与植物生长发育以及应对非生物胁迫。该研究以镉超富集植物——美洲商陆(Phytolacca americana L.)为材料,根据美洲商陆转录组数据,设计特异性引物,从叶片中克隆PaENO基因,并进行序列分析、原核表达与纯化、表达模式分析以及抗镉实验,为深入研究PaENO蛋白的酶活性质以及PaENO基因在美洲商陆应对镉胁迫过程的功能机制奠定基础。结果表明：(1)成功克隆获得PaENO基因(GenBank登录号为JN656932.1),该基因开放阅读框为1 335 bp,编码444个氨基酸。(2)多序列比对分析显示,PaENO蛋白与冰叶日中花的ENO蛋白序列一致性最高,为93.47%;系统进化分析表明,PaENO与冰叶日中花、甜菜、菠菜的亲缘关系较近,处于同一进化分支。(3)RT PCR结果显示,PaENO基因在美洲商陆叶中表达量最高为根的2.5倍,茎中表达量最低,仅为根的1/5;Cd胁迫后PaENO基因表达水平显著升高,并于2 h时PaENO基因表达量迅速升高至Cd胁迫前(0 h时)的9.54倍,Cd胁迫12 h、24 h时降低到0 h时的 3.12倍和2.89倍,说明PaENO基因参与了美洲商陆应对Cd胁迫的响应。(4)通过成功构建原核表达载体pET28a PaENO并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后,在50 kD左右出现目的条带,然后用超声破碎大肠杆菌细胞,离心后分别取上清和沉淀,SDS PAGE检测发现,PaENO在上清和沉淀中都有表达,而且在上清中的表达量较高;使用Ni亲和层析试剂盒纯化PaENO蛋白,获得了纯化的PaENO蛋白;镉抗性实验结果初步证实,表达PaENO蛋白能够显著提高大肠杆菌对镉的抗性。研究认为,PaENO蛋白可能以转录因子(PaMBP 1)的形式在美洲商陆应对镉胁迫过程中发挥调控作用。     

商陆根中抗真菌蛋白的分离和特性研究

从美洲商陆(Phytolacca americana L.)夏天采集的2—4年生宿根中分离了二种抗真菌蛋白,称为PAFP-R_1和PAFP-R_2。分离程序包括用盐溶液提取,经CM-Sephadex离子交换层析、凝胶过滤层析和羟基磷灰石柱层析纯化。在PGA培养基上,0.1mg/ml蛋白明显抑制木霉菌丝的生长;但对细菌的增殖,即使1mg/ml也无抑制作用。用SDS-PAGE测得二者的相对分子量各为13kD和15kD,单多肽链,等电点约为5.8。用酚-硫酸法未测出含糖。二种蛋白均高含半胱氨酸(19mol/mol)。用Edman降解法测得二者的N末端均为Ala。秋天采集的根中,这二种蛋白含量均很低,但富含由二条PAFP-R_1肽链以双硫键联结的二聚体,它无抗真菌活性。冬天宿根中抗真菌蛋白主要成分是Mr为17kD的单肽链蛋白。上述蛋白对于人红血球均无凝集活性,因此不是PWM的成分。以上结果说明,商陆根中有多种具抗真菌活性的蛋白,成分随季节发生变化,它们都是不含糖,高含半胱氨酸,分子量小于20kD的单肽链蛋白。     

Cloning and Expression of a New Gene Encoding an Antifungal Protein in Phytolacca americana

protein (Pa-AFP) with molecular weight about 4 kD was purified from the seeds of Phytolacca americana L. , which obviously inhibits the growth of Rhizoctonia solani Kiihn in vitro. The authors isolated mRNA from the seeds of pokeberry and designed a degenerate PCR primer according to the N-terminal sequence of the purified protein. The full-length cDNA encoding Pa-AFP was cloned by RT-PCR and 5'-RACE and sequenced. The deduced amino acid sequence indicates that a preprotein with 65 amino acid residues is firstly translated and then processed to a mature protein with 38 amino acids. The DNA encoding the mature protein was subcloned into expression vector pGEX-4T1, and expressed efficiently in E. coli BL21 as a GST- Pa-AFP fusion protein. The fusion protein was purified by glutathione-Sepharose 4B affinity colmnn chromatography. The purified fusion protein was specifically digested by thrombin and the Pa-AFP was further purified by filtration column chromatography.     

光对商陆发状根生长和PAP基因表达的影响

利用发根农杆菌菌株Ar1334与美洲商陆(Phytolacca americana)叶片外植体共培养转化体系,共获得58个发状根无性系(SL-1~58).以发根农杆菌Ri质粒TL-DNA上的rol C基因设计特异引物,对发状根进行PCR检测,得到了预期的560 bp目的片段,表明Ri质粒T-DNA整合到发状根基因组中.将筛选出的株系SL-7接种在MS培养基上分别置于光、暗条件下进行培养.结果发现:SL-7在暗培养条件下呈乳白色,具有多分枝、多根毛、无向地性等典型的发状根特性;在光培养条件下,发根呈粉红色,少分支且生长缓慢;以商陆抗病毒蛋白(pokeweed antiviral protein,PAP)cDNA片段为探针,分别对光、暗条件下的发状根进行Northern blot检测,发现光对PAP基因的转录具有一定抑制作用;将发状根粗蛋白提取液与TMV病毒液混合后,摩擦接种于心叶烟(Nicotiana glutinosa)离体叶片,发现暗培养的发状根粗蛋白提取液对TMV抗性明显提高.表明商陆发状根的生长及PAP基因的表达都受到光的负向调控.该结果为商陆发状根的规模化培养和PAP蛋白的离体合成优化体系的建立奠定了基础.     

Accumulation and detoxification of manganese in hyperaccumulator Phytolacca americana

Pokeweed ( Phytolacca americana ) has recently received much attention because of its ability to hyperaccumulate manganese (Mn). The internal mechanism of detoxification of Mn, however, is not fully understood. In the present study, we investigated Mn accumulation, subcellular distribution, chemical speciation and detoxification through oxalate in pokeweed. The plant accumulated excess Mn in the leaves, mainly in the water-soluble fraction, and over 80% of Mn was in a water-soluble form, while accumulation of excess Mn in the cellular organelle and membrane fraction caused phytotoxicity. In addition, pokeweed has an intrinsically high oxalate content. In all experiments, there was sufficient oxalate to chelate Mn in leaf water extracts at all different levels of Mn application. Phase analysis of X-ray diffraction detected oxalate–Mn chelate complexes, and gel chromatography further confirmed the chelation of Mn by oxalate. In conclusion, pokeweed accumulates excess Mn in the soluble fraction of leaf cells, most likely in vacuoles, in which detoxification of Mn could be achieved by chelation with oxalate.     

锰超富集植物垂序商陆(Phytolacca americana L.)的认定

针对目前国内锰超富集植物商陆属（Phytolacca）植物名称混乱的状态,在重新审查锰超富集植物——商陆（Phytolaccaacinosa Roxb．）的野外标本和温室培养植物的基础上,比对中国科学院昆明植物所标本馆的腊叶标本,并查阅相关文献资料。以期正确认定锰超富集累植物的学名。结果表明,湘潭锰矿尾矿废弃地原生的锰超富集植物实为垂序商陆（Phytolacca americana L）,国内外相关研究论文中出现的商陆和美洲商陆实为垂序商陆的同物异名。这一植物名称的认定,将对避免锰超富集植物研究重复进行、保证相关研究正常有序开展具有重要意义。     

商陆生物学特性的初步研究

本文介绍了商陆(Phytolacca americana L.)芽萌发、叶展开、枝梢及叶生长、开花及幼果生长与果实成熟等定期观测结果,探索了其规律及相互关系.     

Molecular Cloning of GAFP-1, an Antifungal Protein from Gastrodia elata

The cloning and sequencing of a full length cDNA of GAFP-1 ( Gastrodia antifungal protein), an antifungal protein from Gastrodia elata BI. f. fiavida S. Chow is reported. Degenerate primers were designed based on the N-terminal partial sequence from purified GAFP-1 to amplify the corresponding cDNA by rapid amplification of cDNA ends (RACE). A cDNA was obtained that contains an open reading frame for a peptide of 171 amino acids which matches the known peptide sequences. A 5'UTR (untranslated region) of 55 bp was found upstream from the translation initiation site. Two poly(A) adenylation sites were located downstream the stop codon. GAFP-1 cDNA and its deduced amino acid sequence share high homology with the mannose binding lectins from Epipactis helloborine, Listera ovata and snowdrop ( Galanthus nivalis ). The cDNA can now be used for testing the potential of GAFP-1 for engineering fungal resistance in crop plants.     

锰胁迫对垂序商陆生长发育的影响

以垂序商陆为试验材料,采用温室溶液培养方法,在生长介质中添加不同浓度(1、5、8、12和15mmol·L-1)的锰离子,研究锰胁迫对垂序商陆生长发育的影响。结果表明:随着生长介质中锰含量的升高,垂序商陆种子的发芽率、发芽势和有丝分裂指数逐渐降低,幼苗根的生长逐渐受到抑制,根系活力呈下降趋势,植物体各器官的生物量减少。当锰胁迫浓度≥12mmol·L-1时,锰对垂序商陆的生长发育产生非常明显的毒害效应,导致种子的发芽、根尖有丝分裂和幼苗根的生长受到严重抑制,生物量显著减少。锰胁迫对垂序商陆幼苗的芽影响较小,而对生殖器官影响较大,严重降低了垂序商陆的结实数量与质量。     

商陆种子主要内含物的研究

本文以美洲商陆风干种子为材料,在检测基本特性--千粒重、壳仁比和含量的基础上,进一步测定其营养成分--脂肪、含氮物质和糖类特质,及主要功能成分--多糖和皂甙.结果表明:商陆种仁与壳之比为2∶1;种子中脂肪含量为20.27%,可溶性糖为3.06%,淀粉为3.57%,含氮物质为1.06%;多糖为1.70%,皂甙为6.65%.     

GC—MS法分析比较垂序商陆根不同提取物的脂溶性成分研究

采用GC—MS联用技术分析比较垂序商陆根不同提取物的脂溶性化学成分。色谱柱为：DB-5毛细管柱,载气为氦气(1mL／min),柱温初始温度50℃,先以20℃／min的升温速率升至170℃,再以2℃／min的升温速率升至210℃;质谱用EI离子源。鉴定了8种相对百分含量大于0．5％的化学成分,其中的3种成分(2-甲氧基-4丙烯基苯酚、带状网翼甾醇、邻苯二甲酸二丁酯)与商陆根中的3种脂溶性成分相同;乙醚提取物与CO2超临界萃取物含有的主要化学成分种类相同,但含量不同;石油醚提取物含有的化学成分种类较少,石油醚萃取物所含成分种类相对较多,且两者有较大差异。