鸡胚睾丸支持细胞的分离、纯化与鉴定

以18天鸡胚睾丸为实验材料,经胶原酶和胰蛋白酶两步酶消化法得到生精上皮细胞悬液.在原代培养过程中经差异贴壁和低渗处理后,获得了纯度约为90%的单层支持细胞.对纯化的培养物染色鉴定,结果显示支持细胞为碱性磷酸酶(AKP)阴性,而混杂在其中的另一种体细胞管周细胞为AKP阳性;油红O染色显示,支持细胞胞质内含有大量的脂肪滴,核内见双极小体;吖啶橙染色证实支持细胞富含RNA;罗丹明123染色显示支持细胞富含线粒体;Hoechst 33342染色显示支持细胞细胞核呈长卵圆形,核的长轴与细胞长轴平行;免疫荧光染色显示支持细胞胞质中表达波形蛋白.建立了一套简单、易行的鸡胚睾丸支持细胞分离纯化与鉴定方法.     

培养大脑皮层神经元的新方法——睾丸支持细胞的应用

In the present study, cerebral cortex neurons were cultured with (named as co-culture group) or without (named as control group) Sertoli cells in vitro, in order to examine the trophic effect of Sertoli cells on the neurons. Our results demonstrated that the growth of the neurons and the viability was enhanced significantly. The increases in the cellular area and number of neurite of the neurons were observed (174.85 +/- 105.18 vs 96.59 +/- 41.63, 2.53 +/- 1.79 vs 1.36 +/- 0.54: P < 0.01). Our study suggests neurons culturing with Sertoli cells is a new and convenient method of obtaining a large number of neurons.     

小鼠睾丸支持细胞体外培养特性

支持细胞是睾丸的重要组成部分,其主要功能是为生精细胞提供适宜的生长环境。从幼鼠睾丸中分离得到支持细胞,并通过苏木精-伊红和Fas-L免疫组化染色对分离得到的细胞进行了鉴定。通过对原代小鼠睾丸支持细胞的贴壁、生长和培养液中葡萄糖、谷氨酰胺、氨基酸等营养底物及其副产物乳酸、铵根离子等的代谢以及培养液渗透压和pH的研究,发现支持细胞的贴壁时间主要集中在接种后2～4h;当培养液中氨根离子浓度高于2.3mmol/L,渗透压高于326mosm/kg,pH≤6.8时支持细胞生长进入衰亡期;在氨基酸代谢方面,发现培养过程中丙氨酸和谷氨酸浓度迅速增加,缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸浓度略有降低,丝氨酸、精氨酸和甘氨酸浓度基本保持不变。因此培养液中铵根离子浓度的过量积累、渗透压和pH的异常和贴壁面积不足是限制支持细胞静态生长的主要因素。研究结果为支持细胞大规模培养及工艺优化奠定了基础。     

嗅神经鞘细胞的培养纯化及体外生长特性

采用原代培养的方法,从2,5月成年大鼠的嗅球分离培养嗅神经鞘细胞（OECs),培养6天后,用阿糖胞苷（Ara-C)抑制,差速贴壁,Forskolin和BPE营养物质处理,根据P75蛋白免疫细胞化学染色和形态学特征分析了所得细胞的纯度,同时对不同培养时期的OECs 的形态进行观察和纯化后的活力测定。实验结果显示：（1）这种纯化方法简单,经济,快捷,所得的OECS纯度可达95％以上,并且随培养时间延长,细胞仍保持较高的纯度。（2）在培养早期2天到5天主要以巨噬细胞状,多极状,不规则状为主,培养中期7天到20天主要以扁平的双极,三极为主。晚期20天以后呈现双极,三极形态,其起上有许多细小的棘突。93）其中以培养早中期细胞的活力较好,培养20天以后,细胞活力较差,本研究为以OECs 作为移植材料对促进神经再生的研究获得丰富的细胞来源奠定了基础。     

睾丸支持细胞紧密连接的动力学调控

在睾丸精子发生的过程中,处于细线期和细线前期的精母细胞必须从生精上皮的基底室进入近腔室,这样形态上发育完全的精子才能在精子释放时进入到生精小管的内腔。显然,构成血-睾屏障的支持细胞间紧密连接的开放和关闭受到一系列信号分子的调节。已经发现的对该过程起调控作用的信号分子包括：转化生长因子β3(TGFβ3)、闭锁蛋白、PKA、PKC等。现就该领域研究的新进展以及可用于研究紧密连接动力学的一些模型进行综述。     

牛胎儿成纤维细胞的分离与体外培养

分别用胶原酶Ⅲ和胰蛋白酶成功地分离了牛胎儿成纤维细胞,并对其进行了体外培养,同时探讨了两种酶消化分离牛胎儿组织的时间对牛胎儿成纤维细胞原代培养的影响。用组织块直接培养也成功得到了牛胎儿成纤维细胞,并探讨了不同组织块大小对牛胎儿成纤维细胞原代培养的影响。通过绘制生长曲线,可以研究牛胎儿成纤维细胞增殖规律;通过制备牛胎儿成纤维细胞的细胞染色体发现,经过传代(12代)、冷冻保存、解冻,牛胎儿成纤维细胞染色体数目不变。     

不同方法分离的成人睾丸支持细胞与胰岛共移植的效果对比

目的比较成人睾丸支持（Sertoli）细胞不同分离方法的效果,建立成人Sertoli细胞简便高效的分离方法。方法将质量相等的睾丸组织按照不同分离方法随机分为3组：A组采用胰蛋白酶、DNA酶、胶原酶和透明质酸酶一步消化法;B组采用胰蛋白酶和DNA酶第一步消化,胶原酶和透明质酸酶第二步消化;C组采用胰蛋白酶和DNA酶第一步消化,透明质酸酶第二步消化,胶原酶第三步消化;D组为对照组。采用形态学观察和免疫组化鉴定Sertoli细胞;MTT法和流式细胞仪法测定3组Sertoli细胞的活性和纯度;应用生存分析方法比较3组Sertoli细胞与胰岛共移植至糖尿病鼠的效果。结果分离获得的细胞经形态学和免疫组化鉴定,具有Sertoli细胞的特征,A、B、C三组Sertoli细胞的纯度分别为（85．17±1．8）％、（92．33±2．5）％和（93．12±2．6）％,B组和C组的Sertoli细胞纯度显著高于A组（t=7．35,t=7．95,P=0．00,P=0．00）。B组Sertoli细胞活性于培养14d时达到峰值,此后缓慢下降。B组Sertoli细胞活性显著高于A组和C组（t=4．02,t=2．77,P=0．00,P=0．01）,且B组Sertoli细胞与胰岛共移植术后胰岛移植物存活时间显著高于A、c、D组（F=165．548,P=0．000）。结论采用两步消化的方法能够获得纯度和活性较高的Sertoli细胞,其与胰岛共移植能够显著延长移植物存活。     

大鼠睾丸曲细精管组织支持细胞/生殖细胞长期共培养与精子发生分析

睾丸体外生殖模型的发展为体外研究睾丸的精子发生分子机制和睾丸毒理学提供了实验工具。很多报道的模型都无法真正地模拟体内复杂的生化分子及功能性相互作用从而导致研究价值有限。该实验拟建立一个体外长期维持睾丸生殖细胞存在,并能持续产生精子细胞的支持细胞/生殖细胞共培养体系。体系中的支持细胞和生殖细胞均由曲细精管组织块迁移到培养皿上,在不添加任何生长因子的情况下维持体外精子发生至圆形精子细胞超过2个月。RT-PCR分析显示,共培养细胞稳定表达cdh1、scp3、tnp2;免疫荧光染色结果显示,CDH1、PLZF、SCP3以及SOX9阳性细胞存在。这些结果例证了体系中同时存在精原干细胞、精母细胞、精子细胞和支持细胞。简单高效的支持细胞/生殖细胞体外共培养体系可用于雄性生殖的分子机制和毒理学研究。     

镉暴露大鼠睾丸支持细胞金属硫蛋白表达的时相研究

啮齿目动物的睾丸较肝脏对镉毒性更为敏感.为阐明不同组织细胞的镉毒性分子机制,对镉暴露大鼠睾丸支持细胞与肝脏金属硫蛋白基因(MT)的表达及镉蓄积进行了时相研究.成年雄性SD大鼠低剂量镉(4.0 μmol/kg)皮下注射后,立即进行睾丸支持细胞和肝脏组织的分离.采用RT-PCR技术分析mRNA,并用光密度扫描作半定量分析,蛋白质定量用ELISA方法,原子分光光度吸收法测定镉浓度.结果显示：镉暴露1 h后肝脏MT mRNA即有明显的诱导表达,3 h达高峰;支持细胞也有明显的诱导表达, 6 h达高峰.镉暴露后肝脏MT有明显的诱导表达,但睾丸支持细胞不但未见MT增加而且还稍有下降.提示：a.镉对MTmRNA的诱导表达具有时间依赖性和组织特异性.b.镉虽然能诱导睾丸MT的转录,但没有促进其MT的合成,这可能是睾丸对镉毒性与致癌作用较肝脏更敏感的重要原因.     

牛卵母细胞体外受精及体外发育的研究

本研究利用从屠宰场收集到的牛卵巢,获取卵母细胞,经体外成熟后进行体外受精,其受精率为73±2％。受精卵分别用发育培养基TCM—199+10％FCS(MA)、颗粒细胞单层(MB)和卵管上皮单层(MC)进行培养,其8—16细胞的发育率分别为52％、54％和61％;而囊胚的发育率分别为20％、28％和42％。相比较而言,MB和MC培养基内突破8—16细胞阻断发育到囊胚的发育率优于MA。     

影响牛胚胎干细胞分离克隆因素的研究

采用与同源胎儿成纤维细胞共同培养及传统饲养层培养方式,以高糖DMEM,添加0.1mM2-巯基乙醇,犊牛血清,细胞因子为培养基,以4-13周龄屠宰牛胎儿为实验材料,探讨影响牛原始生殖细胞分离克隆胚胎干细胞的相关因素,结果发现：当犊牛血清为15%时效果最好;细胞因子添加与否对胚胎干细胞的分离及同源牛胎儿成纤维细胞的贴壁与生长影响并不显著,而在传代过程中中有一定影响;以0.2%胰酶 0.04?TA为细胞消化液效果最佳;以同源胎儿成纤维细胞共培养的方式分离克隆牛胚胎干细胞,本研究观察到效果最好。     

牛乳腺上皮细胞的分离培养及其生物学特性

采用胶原酶消化法和胰蛋白酶选择性消化法分离、培养和纯化牛乳腺上皮细胞。形态学观察表明,培养的细胞具有典型的上皮细胞形态特征;染色体分析结果表明,培养的细胞具有正常的染色体数目。通过荧光免疫细胞染色方法鉴定了培养的细胞表达上皮细胞特异的角蛋白5和8。该细胞在添加胰岛素、氢化可的松以及羊催乳素的无血清培养液中诱导培养时,用RT-PCR方法检测到了β-酪蛋白基因的转录。这些结果表明,分离培养的细胞是乳腺上皮细胞,这些细胞在诱导培养的条件下能够转录表达β-酪蛋白。     

Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes

The testis, and in particular the male gamete, challenges the immune system in a unique way because differentiated sperm first appear at the time of puberty - more than ten years after the establishment of systemic immune tolerance. Spermatogenic cells express a number of proteins that may be seen as non-self by the immune system. The testis must then be able to establish tolerance to these neo-antigens on the one hand but still be able to protect itself from infections and tumor development on the other hand. Therefore the testis is one of a few immune privileged sites in the body that tolerate foreign antigens without evoking a detrimental inflammatory immune response. Sertoli cells play a key role for the maintenance of this immune privileged environment of the testis and also prolong survival of cotransplanted cells in a foreign environment. Therefore primary Sertoli cells are an important tool for studying the immune privilege of the testis that cannot be easily replaced by established cell lines or other cellular models. Here we present a detailed and comprehensive protocol for the isolation of Sertoli cells - and peritubular cells if desired - from rat testes within a single day.     

Ultrastructural details of Sertoli cell junctional complexes in vivo and their modifications in tissue culture

Summary This study was carried out using thin sections, lanthanum tracing, and freeze-cleaving in order to investigate the Sertoli cell junctions of rat testis in vivo and their maintenance in culture. The presence of a new type of membrane specialization has been revealed. This consists of a close association between tight junctions and nexuses. The Sertoli cell contact specializations show a progressive disorganization in vitro correlated with the duration of the period in culture. The relationship between the morphological changes in Sertoli cell junctions and the lack of spermatogenesis in culture is discussed.Research performed under the C.N.R. project Biology of Reproduction     

黄牛表皮细胞分离与体外培养最适条件的探索

为了建立黄牛表皮细胞分离与体外培养的最适条件,比较了组织块法与单细胞悬液法、不同蛋白酶(胰蛋白酶和分离酶)的消化以及有无血清培养基对细胞生长的影响,以克隆形成率来检测细胞生长和存活情况。结果证明：采用分离酶分离表皮细胞进行无血清培养是黄牛表皮细胞体外培养的最适条件。     

不同波段电磁辐射致大鼠睾丸支持细胞的损伤效应

为探讨不同波段电磁辐射对大鼠睾丸支持细胞(Sertoli细胞)损伤效应的异同.将原代培养的Sertoli细胞经场强6×104V/m的电磁脉冲(electromagnetic pulse,EMP)、平均功率密度为100mW/cm2的S-波段高功率微波(S-band high power microwave,S-HPM)和...     

Sertoli细胞饲养层对小鼠精原干细胞增殖的影响

摘要 目的 以小鼠睾丸支持细胞(Sertoli)为饲养层,小鼠胚胎成纤维细胞(STO) 饲养层做对照,研究它对小鼠精原干细胞增殖的影响。方法 用无血清StemPro-34 SFM培养基培养2～5日龄小鼠精原干细胞,分别用相差显微镜观察,免疫组化法研究Sertoli饲养层对精原干细胞生物学行为的影响。结果 发现精原干细胞在Sertoli及STO两种饲养层上的一周内的生物学行为非常相似,但培养1周后,Sertoli细胞作饲养层的培养体系中保留的精原干细胞要比对照组明显增多,约有30%的精原干细胞能存活下来并能维持存活到60d以上。结论 Sertoli细胞作饲养层明显促进精原干细胞的更新增殖。     

体外培养小鼠下颌下腺细胞生长特性的实验研究

目的：研究小鼠下颌下腺细胞的培养方法,探讨下颌下腺细胞培养条件及细胞生长特性,为研究干细胞转分化涎腺腺泡细胞以及涎腺再生研究奠定理论基础和技术支持。方法：取2周龄的小鼠,组织块法和消化法分别进行培养,用活细胞观察法和HE染色法记录细胞形态学特征;免疫荧光染色法鉴定;通过生长曲线和细胞倍增时间来比较两种方法对细胞增殖能力的影响。结果：组织块法和消化法均可以成功的培养下颌下腺细胞,（1）组织块法培养的细胞呈卵圆形或多边形,10天左右成铺路石样;消化法培养细胞亦为上皮样细胞,呈多边形,胞质丰富;（2）HE染色下颌下腺细胞呈多边形,胞核明显;（3）Cytokeratin13和AQP5表达阳性,Wimentin表达阴性;（4）组织块法培养细胞增殖相对较平缓,消化法培养细胞增长较迅速;（5）消化法培养倍增时间（1．3471±0．6071）天比组织块法倍增时间（2．1887±1．1503）明显缩短（P〈0．05）;结论：体外可以成功的培养下颌下腺细胞,但是同时证明下颌下腺细胞长期传代较困难,这为研究干细胞转分化涎腺细胞和涎腺再生体内实验提供了理论和实验基础。