黑曲霉bgl基因的cDNA克隆及序列分析

通过一步法提取黑曲霉AS3．796的总RNA,利用依据其他黑曲霉β-葡萄糖苷酶（bgl）基因序列设计的一对特异性引物,采用RT-PCR方法扩增得到了该菌bgl基因cDNA片段。将目的片段与pGEM-T载体连接并转入大肠杆菌。序列测定结果表明该cDNA片段大小为2583bp,其基因序列与已公布的其它黑曲霉bgl基因的同源性最高可达99％。蛋白质分析结果表明该β-葡萄糖苷酶属于糖苷水解酶家族3成员。     

天祝白牦牛IGF-2基因的cDNA克隆

旨在克隆天祝白牦牛胰岛素样生长因子2(IGF-2)基因编码区全长cDNA序列,为研究该基因的生理功能奠定基础。运用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得天祝白牦牛IGF-2基因全长cDNA序列。扩增获得天祝白牦牛IGF-2基因全长cDNA序列为1 060 bp(GenBank登录号:KF682139),ORF长540 bp,编码179个氨基酸。其编码的氨基酸与已报道哺乳动物IGF-2氨基酸序列同源性在80%-92%之间。天祝白牦牛IGF-2基因的成功克隆为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

一种新的短链脱氢/还原酶家族新成员:NADP(H)-依赖的视黄醇脱氢酶基因的克隆和分析

从牛的肝脏中快速抽提总RNA,根据GenBank已发表NADP(H)-依赖的视黄醇脱氢酶基因(NRDR)的cDNA序列,设计并合成特异引物,利用cDNA末端快速扩增(RACE)方法和反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),得到牛肝内的NRDR cDNA的全长序列。经测序证实,牛肝NRDR的全长cDNA序列为1266bp,其开放读码框架在24～806bp,编码260个氨基酸(GenBank登录号：AF487454)。根据NRDR基因推导出的氨基酸序列与人、鼠、兔有高度同源性,并含有SDR超家族成员的两个高度保守的模序,在其C-端含有过氧化物酶体的靶向序列为SHL。结果表明,牛的NRDR应属于过氧化物酶体内SDR超家族成员并在维甲酸合成的限速步骤起作用的酶,也为维甲酸合成的传统通路提供一个补充。     

海栖热袍菌耐高温β-半乳糖苷酶基因的克隆和表达

本文主要研究了在大肠杆菌中克隆和表达海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8的一个β-半乳糖苷酶基因 (TM_0310).以海栖热袍菌基因组 DNA(GenBank登录号 AE000512)为模板,设计特异性引物带有 NcoI-HindⅢ酶切位点,克隆得到的该基因全序列为2019 bp,编码672个氨基酸,分子量为78.972 kD.该基因编码的蛋白质属于42族,根据氨基酸同源性分析,该β-半乳糖苷酶与 Thermotoga petrophila RKU-1 来源的假想的β-半乳糖苷酶(GenBank 登录号 ABQ46628.1)以及Thermotoga sp.RQ2来源的β-半乳糖苷酶(GenBank 登录号 EDQ29256.1)同源性最高,均为95%.重组转化子经诱导酶比活可达2.08 U/mg 蛋白.粗酶液经过80℃热处理10 min,酶活残留70%以上,表明该酶有很好的耐热性,在高温工业环境中有良好应用前景.     

葡萄果实(E)-β-丁香烯合酶基因的克隆及其表达分析

利用生物信息学方法,通过电子克隆获得葡萄(Vitis vinifera Linn.) (E)-β-丁香烯合酶基因的cDNA序列;以从葡萄品种‘德引84-1’(‘Deyin 84-1’)果肉中提取的mRNA为cDNA模板,利用特异PCR技术克隆得到1个全长1 880 bp的基因,被命名为Vv-ECar(GenBank登录号JF808010),该基因序列包括开放阅读框1 674 bp、3’非翻译编码区209 bp和poly+ (A) 28 bp,可编码557个氨基酸.比对结果显示:葡萄Vv-ECar基因的核苷酸序列与葡萄VvGwECar2基因的同源性达93％,二者编码的氨基酸序列同源性达90.8％,均含有植物萜类合酶家族共有的保守域DDXXD;葡萄Vv-ECar与茶[Camellia sinensis (Linn.)0.Kuntze]和杨(Populus balsamifera subsp.trichocarpa×P.deltoids)的萜类合酶相关基因同源性均在73％以上;分子进化树的分析结果也显示葡萄Vv-ECar基因编码的氨基酸序列与其他植物的同源序列具有高度保守性.半定量RT-PCR和荧光定量PCR分析结果显示:在葡萄果实发育的不同阶段均有Vv-ECar基因的表达,但其相对表达量随果实的发育呈先低后高的趋势,其中在幼果期相对表达量最高.     

烟草烟酰胺酶基因的克隆及序列分析

烟酰胺酶是烟草中烟碱合成途径中的关键酶之一.在植物中,通过烟酰胺酶的催化作用,烟酰胺转化成烟酸,烟酸是合成烟碱的一个重要底物.从烤烟品种南江3号(Nicotiana tobacum cv.Nanjiang-3)均一化全长cDNA文库中克隆获得烟草烟酰胺酶基因cDNA全长序列(命名为T-nic1),GenBank中的登录号为HQ448853,该基因全长为841 bp.利用ORF finder和ProtParam软件分析显示,它包含一个完整的开放读码框,编码一个含有162个氨基酸、等电点为4.94、分子量为18.2 kD的小分子量蛋白.Blast搜索结果及进化分析结果表明,该基因编码的蛋白与毛果芍药、拟南芥中的烟酰胺酶序列具有较高的同源性,其氨基酸序列一致性分别为71%、67%.     

玉米异戊烯基焦磷酸异构酶基因的克隆及其功能分析

以玉米嫩叶为材料,采用RT-PCR技术克隆了植物萜类物质前体生物合成过程最后一个关键酶--异戊烯基焦磷酸异构酶(IPI)基因的全长cDNA,命名为ZmlPI(GenBank登录号为AY738148),该基因cDNA全长为1 382 bp,包含1 104 bp的开放阅读框,编码367个氨基酸残基.颜色互补分析表明ZmlPI能推动工程菌XLI-Blue pTreZmlPI pAC-BETA超量表达β-胡萝卜素,证实ZmIPI具有典型的IPI基因的功能.     

柽柳金属硫蛋白基因的克隆及序列分析

用木麻黄(Casuarina glauca)的金属硫蛋白基因(metallothionein 1)氨基酸序列对柽柳ESTs序列本地数据库进行tBlastn检索,获得了柽柳金属硫蛋白基因全长cDNA序列,去除polyA后该基因全长366 bp,其中5′非翻译区97 bp,3′非翻译区59 bp,开放读码框(ORF)长210 bp,编码70 个氨基酸组成的多肽,蛋白分子量为6.793 kD,理论等电点为4.99,含10个Cys,集中分布在肽链的N端和C端。BlastP同源性分析表明该基因与花生同源性最高,与小豆同源性最低。该基因的EST序列在GenBank登录(登录号：CV792539)。     

黑曲霉C112纤维二糖酶基因的克隆与生物信息学分析

以紫外诱变获得的高产纤维素酶黑曲霉C112菌株为模板,采用RT-PCR技术克隆黑曲霉C112的纤维二糖酶基因bgl(Gen Bank登录号:KP307454);该基因全长2 934 bp,含有非编码序列,编码860个氨基酸,等电点为4.70,核酸序列与数据库的Aspergillus niger(Gen Bank登录号JX982101.1)同源性达到了99%;生物信息学分析表明,纤维二糖酶为具有一定亲水性的稳定酸性分泌蛋白;二级结构以α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲为结构元件;该基因经IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE检测结果表明,重组表达产物的相对分子量约为93.3 k D,与预期相符;纤维二糖酶在大肠杆菌BL21中胞内融合表达,重组蛋白p NPG酶活为5.847U/m L,最适反应温度为50℃,最适p H值为5.0。     

菜心苯丙氨酸解氨酶基因克隆与序列分析

通过同源克隆和RACE相结合的方法,首次从菜心中克隆了苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因的全长cDNA,命名为BcPAL1(GenBank登录号为GU245694).BcPAL1全长2 476 bp,开放阅读框2 166 bp,编码721个氨基酸.经氨基酸序列多重比较发现,BcPAL1编码的氨基酸序列与拟南芥、烟草、甘蓝型油菜等植物的PAL氨基酸序列同源性大于90%,BcPAL1编码的氨基酸序列包含与拟南芥、烟草PAL蛋白质相同的脱氨基位点和催化活性位点.基于氨基酸序列的PAL系统进化树分析结果显示,BcPAL1编码的氨基酸序列与十字花科类植物(如拟南芥)的PAL聚为一支,说明两者的亲缘关系较近.     

粘虫β-actin基因cDNA的克隆、序列分析及表达量检测

β-actin基因作为actin家族的一员,在基因定量实验中常用作内参基因。本实验运用RT-PCR和RACE技术,以粘虫Mythimna separata(Walker)cDNA为模板,对β-actin基因进行克隆获得全长cDNA序列,并利用生物信息学方法,对β-actin基因全长cDNA序列及推测得到的β-actin蛋白序列进行分析。结果表明,获得的粘虫核β-actin基因cDNA序列长度为1 472 bp,其中包括68 bp的5′非编码区、273 bp的3′非编码区和1 131 bp的开放阅读框,编码一个376个氨基酸蛋白,具有actin蛋白家族典型特征。推测得到的粘虫β-actin蛋白理论分子量为41.7497 ku,等电点为5.29,富含6种类型的特定功能位点。该蛋白序列与其他动物β-actin蛋白序列具有97.9%～99.7%高度同源性。β-actin表达量检测结果显示β-actin在6种不同组织间表达无显著差异(P>0.05),表明β-actin可作为研究粘虫不同基因表达水平高低的可靠内参基因。该基因的cDNA序列已经递交GenBank并获得登录号为GQ856238。     

一个新的茶树黄酮醇合酶基因的克隆和表达分析

Cs—COR113（GenBank登录号：FE942098）为一受冷诱导的茶树黄酮醇合酶基因的cDNA片段,采用RACE技术克隆了这一基因的全长cDNA,命名为CsFLS（GenBank登录号：FJ577509）。CsFLScDNA序列全长为1303bp,5＇-UTR和3’-UTR分别长91bp和175bp,包含一个编码336个氨基酸的完整开放阅读框。序列分析显示,CsFLS与烟草、矮牵牛、欧芹、拟南芥的黄酮醇合酶的同源性分别为74％、75％、75％和63％,含有2-酮戊二酸依赖性双加氧酶家族2个保守的基序,以及与黄酮醇合酶正确折叠有关的2个保守的甘氨酸残基。CsFLS的表达受低温诱导,但不受ABA诱导。     

茶树花粉特异蛋白基因CsPSP1的分离及序列分析

利用cDNA-AFLP技术比较了茶树[Camellia sinensis(L.)O.Kuntze cv.Wulong]花蕾发育早期和晚期的基因表达,结果表明存在明显差异。以E12和M20为引物对在晚期发育花蕾中筛选出一条281 bp特异表达的差异条带TDF53(transcipt-derived-fragment,TDF)。RT-PCR分析表明该片段只在晚期发育花蕾中特异表达。用RACE方法延伸其末端序列,克隆并测序获得全长cDNA序列(GenBank登录号:DQ887753)。该基因全长2079 bp,开放阅读框1701 bp,编码567个氨基酸,其分子量为63 kDa。序列和结构的同源性分析表明:该基因编码的氨基酸序列与烟草、油菜的花粉特异蛋白等同源性较高,由此推定,该基因为编码茶树花粉特异蛋白的基因,并将分离到的花粉特异蛋白基因命名为CsPSP1。     

柿果实多聚半乳糖醛酸酶基因克隆与序列分析

以'富平尖柿'(Diospyros kaki L.cv.Fuping Jianshi)为材料,采用RACE方法,首次获得了柿果实多聚半乳糖醛酶(PG)基因的3个全长cDNA(登录号为EU816197、EU816198、EU816199),分别命名为DKPG1、DKPG2、DKPG3.DKPG1全长1 616 bp,DKPG2全长1 654 bp,DKPG3全长1 545 bp.3个基因均含有一个1 326 bp的开放阅读框,共编码441个氨基酸.通过Blast比对发现该基因核苷酸序列与其他植物已报道的PG基因具有74%～78%的相似性;其氨基酸序列与其他植物的相似性为60%～73%.对GenBank同源性搜索获得的其他植物PG基因氨基酸序列进行系统进化分析,发现其与葡萄、猕猴桃、桃的亲缘关系近,与大豆亲缘关系较远.     

苦荞中查尔酮合成酶全长基因的克隆及其序列分析

选用乌克兰伊琳娜苦荞为试验材料,以从叶片中提取的RNA为模板,应用RACE技术结合CODEHOP引物设计方法成功克隆出苦荞中查尔酮合成酶cDNA序列后,将其序列电子合并其全长后设计基因全长特异性引物.以DNA为模板进行PCR扩增出基因序列.通过生物信息学分析表明,该基因金长为1 906 bp,具有一个463 bp的内含子序列,编码区长度为1188 bp,编码395个氨基酸.Blastn序列比对发现本试验所获得的CHS基因序列与相近物种Rheum palmatum(登录号:DQ205352.1)的CHS基因同源性达86％.将得到的序列命名为RaCHS并提交GenBank,登录号为HQ434624.应用Clustalxl.81和MEGA4软件构建系统进化树,并进行了同源性分析.     

甜菜ATP合酶β亚基基因atpB的克隆、序列分析及进化

atpB基因编码ATP合酶β亚基,是光合作用中的重要基因。ATP合酶是生物体内能量代谢的关键酶,参与氧化磷酸化和光合磷酸化反应。利用植物叶绿体基因组在进化过程中高度保守的特点,根据已知植物烟草、水稻和菠菜等的叶绿体基因组全序列,设计并合成了一对引物,以甜菜叶绿体DNA为模板,PCR扩增得到包含atpB完整基因(GenBank登录号为DQ067451)在内的一段序列,测序与序列分析表明:该克隆片段全长2 293 bp,其中包括有1 497 bp的编码区序列,推测编码498个氨基酸。同源性比较,该克隆基因与烟草、菠菜、油菜、水稻atpB基因的核苷酸序列同源性分别为90.92%、95.79%、87.71%和86.37%,推测的氨基酸序列同源性分别为94.58%、97.19%、92.17%和91.97%。同时,建立了几种植物的氨基酸序列系统进化树。     

西伯利亚蓼钙调蛋白基因的克隆及其在盐胁迫下的表达

已从西伯利亚蓼叶中cDNA文库中获得的钙调蛋白EST序列,采用cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆了具有完整编码区的钙调蛋白基因的cDNA序列（GenBank登录号GQ988382）,命名为PsCaM。该基因全长615bp,编码区为450bp,编码149个氨基酸,5＇非翻译区为63bp,3＇非翻译区为102bp。同源性分析表明,该蛋白与其他植物钙调蛋白高度保守,氨基酸同源性高达98%。用实时荧光定量PCR研究3%NaHCO3胁迫下西伯利亚蓼基因表达的结果显示,自然条件下,该基因在叶中表达量最高,地下茎次之,茎中最低;盐胁迫下CaM在西伯利亚蓼的地下茎、茎和叶中均有表达,表达模式不同。     

西伯利亚蓼硫堇基因的克隆和序列分析

根据西伯利亚蓼抑制消减文库(SSH)中获得的硫堇(THI)基因的部分序列,应用RACE技术克隆了具有PolyA的全长cDNA序列。基因全长789bp,5'非翻译区90bp,3'非翻译区276bp,开放阅读框编码140个氨基酸。序列分析表明,该编码蛋白与大多数植物THI蛋白前体高度相似,N端具24个氨基酸的信号肽,中间46个氨基酸为成熟THI部分,C端的70个氨基酸为酸性多肽部分。西伯利亚蓼THI蛋白与丹参等双子叶植物THI蛋白有较高的同源性,具保守的植物THI标签序列C-C-X(5)-R-X(2)-[FY]-X(2)-C。此成熟THI蛋白带正电荷,偏碱性,推定可能具有抗病原微生物活性,为一种新的植物THI蛋白,GenBank登录号为DQ981482。     

异色瓢虫过氧化氢酶(Catalase)的基因克隆及序列分析

【目的】克隆异色瓢虫Harmonia axyridis保护酶系中过氧化氢酶(Catalase,CAT)的全长cDNA序列,并分析该基因的基本特性。【方法】采用同源克隆和锚定PCR技术,从异色瓢虫中克隆到HaraxCAT基因的cDNA全序列(GenBank登录号KC991026),并采用生物信息学的相关方法进行了分析。【结果】HaraxCAT的cDNA序列全长1 781 bp,其包含110 bp的3′非编码区域和45 bp的5′非编码区域,可读框长1 626 bp,编码541个氨基酸。预测该基因编码蛋白的分子量为61.55 ku,理论等电点为8.33,包含3个糖基化位点,无信号肽序列和跨膜结构。并且该基因包含了一个长达18个氨基酸的潜在的活性位点序列FDRERIPERVVHAKGAGA和血红素配体信号序列RIFSYGDTH。同源比对不同昆虫的CAT蛋白序列,发现昆虫CAT非常保守,HaraxCAT与其他昆虫的同源性高达65%及以上,与赤拟谷盗Tribolium castaneum同源性最高,达75.25%;系统发育分析表明其与鞘翅目赤拟谷盗和白星金花龟Protaetia brevitarsis亲缘关系最近。【结论】获得异色瓢虫catalase基因的cDNA全长序列,证实昆虫CAT蛋白非常保守。     

星星草脱氢抗坏血酸还原酶（PtDHAR）cDNA的克隆及表达分析

脱氢抗坏血酸还原酶是抗坏血酸代谢循环中的关键酶,在多种植物中与抗胁迫相关。为了获得抗盐碱植物星星草中该基因序列,利用RACE技术,从星星草中克隆出脱氢抗坏血酸还原酶基因（PtDHAR）的cDNA全长序列,其GenBank登录号为HM125046。PtDHAR cDNA核苷酸序列长度为987bp,开放阅读框为639bp,编码213个氨基酸。该基因编码的氨基酸序列与水稻、小麦等禾本科作物具有很高的同源性。Northern杂交分析表明,该基因在盐碱胁迫下表达量显著升高。