核酸探针技术简介

<正> 核酸探针实质上是DNA或RNA片段,这类片段或参与某种功能或具有某种特征,并往往被连上放射性物质或非放射性物质的指示剂。探针的作用是探查目的DNA或RNA的存在情况,核酸双链分子中各碱基之间有严格的配对原则,就DNA分子说,碱基间的配对总是A-T,C-G,探针的单链只有和与之相对应的称为互补的单链在一起时才能形成新的双链分子,在一个被探测的体系中如果显示     

DNA探针在检测和鉴定植物病原细菌中的应用

一、前言 所谓DNA探针是指能识别特异碱基序列(基因)的有标记的一小段单链DNA分子,即是一段与被测定的核苷酸序列(靶序列),互补的带标记的单股脱氧核糖核苷酸。     

综合遗传学公司推出食品沙门氏菌快速诊断试验盒

综合遗传学(Integrated Genetics)公司最近推出它的第一个产品--检出食品沙门氏菌用的快速诊断试验盒。它被称为GENE-TRAK,是以DNA杂交技术为基础的。目前只能用于沙门氏菌的检出。该公司的科学家已分离出DNA探针,含有与沙门氏菌DNA互补的碱基序列模式。分离出可能存在于食品样品中的任何微生物的DNA链后,将沙门氏菌DNA探针加入样品中,若探针与存在于样品中的DNA单链杂交,则表明其中有沙门氏菌存在。     

酶标DNA探针与Y染色体DNA的探测

 用辣根过氧化物酶标记DNA的技术,制备了酶标基因探针。研究了酶标过程和产物的电泳行为;用斑点杂交和southern印迹杂交探测了单链、双链DNA,灵敏度可达pg水平,以此酶标的Y染色体特异的DNA片段作探针,进行了DNA杂交的性别分析,证明该探针能清楚地区别两性基因组DNA,这对基因的研究和诊断有一定实用价值。     

标志的单链RNA——一种核酸杂交新探针

核酸杂交是进行基因分析的重要技术之一。目前,该技术常规使用的都是DNA探针。近几年来的研究结果表明,RNA也可用作探针成功地用于基因探查。与同类DNA探针比较,它具有更高的敏感性。 单链RNA探针的主要优点是:(1)转录产生的单链RNA探针具有非常高的特异活性。最适条件下其特异活性可大于6×10~(?)cpm/μg。它的应用大大提高了原位杂交的敏感性。Cox等人在应用海胆胚胎的实验中发现不对称的SP6 RNA探针要比对称的RNA探针或DNA探针分别敏感8倍和100倍。在Northern     

古DNA单链测序文库的建立与检测北大核心CSCD

2005年问世的第二代测序技术在古DNA领域的应用,突破了第一代测序技术在绝灭或死亡生物全基因组获取手段上的局限。借助古基因组信息,研究者能够从更为系统的实时分子证据角度,解读诸如人类起源、大型绝灭哺乳动物迁移演化、动植物家养驯化以及早期人类社会生活模式等古生物学、遗传学与演化生物学问题。引入第二代测序技术之后,传统的古DNA研究方法及流程得以改变,剔除了原有的实验流程中耗时的分子克隆步骤,引入了与第二代测序技术紧密相关的古DNA单链测序文库构建环节。古DNA单链测序文库的构建,是将古DNA双链模板变性成单链后,通过向单链古DNA两端添加人工DNA片段,将古DNA分子转变成能被测序仪识别的文库分子。针对古DNA分子微量、高度片段化以及普遍存在碱基损伤的特点,古DNA单链测序文库,能够高效获取古DNA材料中的遗传信息。本文系统介绍古DNA单链测序文库建立流程,以及对文库质量进行检测的方法,为研究者运用第二代测序技术测定绝灭或死亡生物全基因组提供方法借鉴。     

古DNA单链测序文库的建立与检测

2005年问世的第二代测序技术在古DNA领域的应用,突破了第一代测序技术在绝灭或死亡生物全基因组获取手段上的局限。借助古基因组信息,研究者能够从更为系统的实时分子证据角度,解读诸如人类起源、大型绝灭哺乳动物迁移演化、动植物家养驯化以及早期人类社会生活模式等古生物学、遗传学与演化生物学问题。引入第二代测序技术之后,传统的古DNA研究方法及流程得以改变,剔除了原有的实验流程中耗时的分子克隆步骤,引入了与第二代测序技术紧密相关的古DNA单链测序文库构建环节。古DNA单链测序文库的构建,是将古DNA双链模板变性成单链后,通过向单链古DNA两端添加人工DNA片段,将古DNA分子转变成能被测序仪识别的文库分子。针对古DNA分子微量、高度片段化以及普遍存在碱基损伤的特点,古DNA单链测序文库,能够高效获取古DNA材料中的遗传信息。本文系统介绍古DNA单链测序文库建立流程,以及对文库质量进行检测的方法,为研究者运用第二代测序技术测定绝灭或死亡生物全基因组提供方法借鉴。     

DRE顺式作用元件dsDNA芯片制备

DRE顺式作用元件能与DREB转录因子特异结合,在诱导逆境（干旱、高盐、低温）基因表达过程中起重要作用。dsDNA（double strand DNA）微阵列芯片技术能够有效地检测序列特异性DNA结合蛋白质（转录因子）与大量DNA靶点（顺式作用元件）的特异性结合,可有效分析生物分子结合作用。根据DRE顺式作用元件核心序列设计并化学合成含发夹结构的单链DNA探针,采用Taq DNA聚合酶在片延伸,并对其在片延伸体系的反应温度、Mg^2＋浓度以及单链探针是否变性等条件进行了优化。结果表明,50％的反应温度,2．5mmol／L的Mg^2＋浓度和单链不变性是TaqDNA聚合酶在片延伸的最佳条件。优化方法制备的dsDNA芯片将更有利于DRE顺式作用元件与DREB抗逆转录因子相互作用的研究。     

甘油对单链构象多态性分析的影响

单链构象多态性(single strand conformation poly-morphism,SSCP)分析是以PCR技术为基础检测DNA多态性的一种方法。其基本原理是:单链DNA在进行不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)时,迁移率除与DNA单链的长短有关外,更主要取决于DNA单链所形成的具有一定空间结构的构象。这种构象由DNA单链碱基顺序决定,其稳定性靠分子内部局部顺序的相互作用来维持。相同长度的单链因其顺序的不同,甚至单个碱基的不同,所形成的构象不同,导致迁移率的变化而出现泳动变位(mobili-ty shift)。该方法自建立起来不断地发展、完善,应用范围也日益广泛。特别是在人类癌基因和抑癌基因突变的检测、基因诊断、连锁分析、基因作图等领域成效突出。     

用EndoV和碱电泳法检测哺乳动物细胞嘧啶二聚体的切除修复

紫外线(UV)辐射是自然环境中重要的DNA致伤因子。UV辐射在DNA造成的最主要一类损伤产物是环丁烷嘧啶二聚体(pyrim-idine dimer,PD),它是由DNA中一条多核着酸链上两相邻嘧啶碱基各自的C5和C6共价连接形成的环丁烷结构。哺乳动物细胞主要通过切除修复途径移除PD,恢复DNA的正常结构。一种从噬菌体T4感染的E.coli中提取的T4核酸内切酶V(EndoV)能特异识别PD,并在该损伤位点切断磷酸二醋键,造成单链断裂。本文即以EndoV为探针,以其敏感位点(endonuclease-sensitive-site,ESS)     

大白鼠肝实质细胞的分离及其DNA单链区与细胞年龄的关系

本文报告了一个分离同一个体中老年、青年肝实质细胞(Parenchy-mal cell)的方法,并利用S_1酶作探针研究了不同年龄肝实质细胞DNA的单链区多寡与细胞年龄的关系。 用胶原酶溶液灌注活体大白鼠肝脏得到游离肝实质细胞。用Percoll作密度梯度介质对同一个体大白鼠的肝实质细胞进行梯度离心分离,得到比重不同的两部分肝实质细胞。再用S_1酶分别降解不同比重肝实质细胞DNA中的单链区域。结果表明:比重较大的肝实质细胞DNA中所含的单链区较比重小的肝实质细胞DNA中的单链区为多。提示这种差异可能与肝实质细胞的年龄有关。用不同年龄大鼠的肝细胞作对比,也证明老年大白鼠肝实质细胞DNA的单链区较多。     

DNA单链二级结构预测与单链构象多态性分析的一致性研究

单链构象多态性(SSCP)分析是一种简便,快速检测DNA突变的方法,它在基因突变检测、遗传分析、进化研究等领域有着广泛的应用价值.但是这种方法的突变检出率随DNA序列不同而变化,一般只能达到70%～80%.这主要是有的碱基突变对单链DNA的构象影响较小,不能通过SSCP检测出来.将计算机对DNA二级结构的预测结果和实验结果作了对比,发现二者有很高的一致性.这一结果表明计算机的DNA单链二级结构预测分析可用于PCR-SSCP分析的辅助设计,提高SSCP的突变检出率.     

RecA蛋白介导的三链核酸结构形成及其序列提取

人工合成的单链DNA分子经PCR扩增形成双链DNA分子。将RecA蛋白与生物素标记的寡聚核酸探针序列在ATPγS存在的情况下共同哺育,使RecA蛋白包裹寡聚核酸探针,然后加入含同源序列的上述双链DNA分子经适当环境哺育形成了稳定的局部三链核酸结构。通过加入链亲和素包裹的磁珠吸附生物素化的探针,这样同源双链DNA分子与寡聚核酸探针形成的局部三链核酸结构也被吸附在磁珠上。使用磁分离装置提取这一结构,逐步降低盐离子浓度以洗脱双链DNA分子。将洗脱液中残留的蛋白质去除,经PCR扩增可获得目的DNA序列。同时使用同源探针和非同源探针在其它序列中提取目的DNA序列,结果显示目的DNA序列只被同源探针提取。实验结果显示了这一三链核酸结构形成的序列特异性,并且其稳定性随盐离子浓度降低而下降。提示在这一结构中同源的寡聚核酸单链与双链DNA分子形成了氢键结合,同时提示使用文中描述的方法可以提取特异的序列,用以克隆相应的基因。     

核酸分子中碱基含量的计算

关于核酸分子中碱基含量的计算,在遗传学和高中生物教学中相当重要,但在教科书中通常没有专门讲述。我们根据碱基互补配对规律及中心法则进行归纳总结,从DNA结构、DNA复制、转录、翻译等方面探讨了DNA、RNA、蛋白质3者之间的关系,分析了核酸分子中碱基的含量。互核酸分子中碱基含量的计算1．且已知双链DNA分子中一种碱基的含量,推断其他碱基的含量：例1：一双链‘DNA分子中,（A－C）占碱基总量的Zo％。求A、T、G、C各占多少？解：在双链DNA分子中,据规律知,1．2由碱基含量推断核酸分子的结构——单链或双链、DNA或RNA…     

耐热DNA多聚酶的研究与开发

PCR法的发明与耐热DNA多聚酶的应用 DNA多聚酶已广泛应用于基因探针的切口平移标记,双链DNA上的5′单链末端的填补或3′末端标记,cDNA互补链的合成,双脱氧法测定碱基序列以及体外专一性诱变等分子生物学方法。而耐热的DNA多聚酶至少在两个应用领域中比一般DNA多聚酶有其特殊的作用:其一是在体外扩增特定的基因;其二是在DNA核苷酸顺序分析中能消除高级结构的影     

纳米孔测序信号处理及其在DNA数据存储的应用

随着高通量测序技术的不断更新,可以在单个分子水平读取核苷酸序列的第三代测序技术迅速发展,纳米孔测序技术是其具有代表性的单分子测序技术,该技术通过检测DNA单链分子穿过纳米孔时引起的跨膜电流信号的变化,实现碱基识别.纳米孔测序仪在便携性、碱基读取速度、测序读段长度等方面较传统的第一代与第二代测序技术都有明显优势.随着纳米...     

肺炎支原体

<正>前言 一般认为,肺炎支原体(Mycoplasma pneumonice,M·P)引起发病及产生临床症状的主要原因在于宿主,而与M·P的致病性程度无关。因此,在M·P感染的DNA诊断中,关键是采用对M·P有高度特异性的DNA探针,而不必对病原性因子进行DNA诊断。以前有关在感染初期起重要作用的细胞粘着蛋白(PI蛋白)等的DNA的特异性探针曾有过报导,但在菌种鉴定时,如果用核糖体RNA(rRNA)的互补DNA作为探针,则可在很短的碱基链上显示出高度的特异性,故甚有实用价值。本文对以M·P 16S rRNA互补的单链DNA作探针,通过RNk-DNA杂交检测M·P的方法作一介绍。     

核黄素光敏损伤DNA的凝胶电泳

以琼脂糖凝胶电泳研究了波长为427~457nm可见光照射下核黄素(VB₂)光敏诱导的质粒DNA损伤,结果发现DNA光敏损伤主要与照光量、核黄素和DNA浓度比、溶液中的氧气等有关.在无氧条件下光敏损伤更为显著,证明VB₂光敏损伤DNA主要是通过VB₂激发三重态与DNA碱基组分间发生电荷转移导致其产生氧化性损伤实现的.表明核黄素光敏损伤DNA时最佳浓度比为bp∶VB₂ = 3.5∶1.对照结果表明,单链DNA(ssDNA)比双链DNA(dsDNA)的碱基更易被核黄素敏化发生损伤,这可能是由于ssDNA中碱基暴露的原因.     

巨型引物PCR法对抗CD3改型单链抗体

亲和力是影响改型单链抗体应用于临床的重要因素之一.利用巨型引物PCR定点诱变方法,设计并化学合成出两组含多个突变位点的简并引物,在第一轮PCR中使用简并引物分别扩增出含突变碱基的两条特异性的DNA片段,即巨型引物,将其经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后,作为3′和5′的两端引物应用于第二轮PCR反应中.通过改变标准PCR反应条件,调整引物与模板的浓度,扩增出特异性较强的目的DNA条带.PCR产物经回收后,进行DNA测序.测序结果表明利用该方法扩增得到特异的抗CD3改型单链抗体的突变体库.     

DNA探针—测抗微生物抗性的替代方法?

<正>引言 利用DNA探针做传染病的临床诊断在科学文献的许多报告中已有描述。DNA探针方法学的应用首先是为了获得特异性抗菌素抗性基因传播的资料以及作为研究其发展关系的工具,而不是检测抗微生物抗性。然而DNA探针主要优点之一是它能够用于检出微生物特异性基因而不需要先行分离与生长。由于这一技术能在病人原始标本中直接测定传