美洲商陆中新发现的一种抗菌蛋白基因的克隆和表达

自美洲商陆(PhytolaccaamericanaL.)的种子中发现了一种具有38个氨基酸残基的蛋白(PaAFP),它有明显抑制立枯丝核菌(RhizoctoniasolaniKiihn)作用。依此蛋白的氨基酸序列合成引物,从该种子的mRNA中,通过逆转录PCR,获得了这一基因的具有65个氨基酸的前体蛋白cDNA序列(已在GenBank注册),将这一成熟蛋白的cDNA克隆在pGEX4T1上,并转化到大肠杆菌(E.coli),融合蛋白被大量表达。表达产物经谷胱甘肽Sepharose4B亲合层析,融合蛋白被纯化。纯化后的融合蛋白经凝血酶(thrombin)作用,将谷胱甘肽S转移酶降解,从而获得这一抗真菌蛋白     

美洲商陆抗病毒蛋白-Ⅱ基因的克隆和表达

根据报道的cDNA序列,用RT-PCR的方法从美洲商陆夏季的叶片中克隆美洲商陆抗病毒蛋白-Ⅱ(pokeweedantiviralproteinⅡ,PAP-Ⅱ)基因。将PAP-Ⅱ基因克隆至表达载体pET-28a( )并在大肠杆菌中表达,SDS-PAGE电泳分析结果表明,PAP-Ⅱ蛋白在BL21(DE3)菌中获得表达,表达产物以不溶性包涵体形式存在,经过溶解包涵体、复性和BBSTNTA树脂柱亲和层析纯化,获得高纯度的PAP-Ⅱ蛋白。用非放射性基于ELISA方法检测经过复性纯化后PAP-Ⅱ蛋白和蓖麻毒素A链(RTA)在体外对HIV-1整合酶有较强的抑制活性,其IC50分别约为303μg/mL,220μg/mL。用MTT法分析PAP-Ⅱ蛋白的生物学活性,复性纯化后蛋白对HEP-G2和Hela细胞有细胞毒作用,IC50分别为93μg/mL,102μg/mL,说明了PAP-Ⅱ蛋白能抑制肿瘤细胞的生长。构建的PAP-Ⅱ表达系统所表达的蛋白经复性后具有生物学活性,为进一步研究PAP-Ⅱ的抗HIV-1机制和抗肿瘤作用奠定了基础。     

美洲商陆抗病毒蛋白研究进展

美洲商陆抗病毒蛋白（pokeweed antiviral proteins,PAP)是一类具多种生物功能和活性的蛋白,本在阐述了该类蛋白的生化等特性的同时,综述了该类蛋白在抗植物病毒,抗动物病毒以及用作免疫毒素等方面的研究进展。     

美洲商陆抗病毒蛋白的研究

美洲商陆抗病毒蛋白(pokeweed antiviral proteins.PAP)是一种具有多种生物功能活性的蛋白质,其在广谱抗病毒方面有重要的应用价值。综述美洲商陆抗病毒蛋白的分子结构与功能,抗病毒的分子机理及其在植物基因工程中的应用。     

美洲商陆的组织培养

植物名称:美洲商陆(Phytolacca americana,属商陆科,又名十蕊商陆、垂序商陆和洋商陆,原产北美,为多年生草本植物。材料类别:来自专业户自栽收获的种子。培养条件:培养无菌苗所用培养基为[1]号:     

美洲商陆核基因组抗病毒蛋白基因的克隆及序列分析

通过ＰＣＲ扩增,从美洲商陆（Ｐｈｙｔｏｌａｃａａｍｅｒｉｃａｎａ）核基因组中克隆了商陆抗病毒蛋白基因,序列分析表明,该基因含８８５个核苷酸,与已报道的序列比较,核苷酸同源性为９９３％。     

美洲商陆核基因组抗病毒蛋白基因的克隆及序列分析

通过ＰＣＲ扩增,从美洲商陆（Ｐｈｙｔｏｌａｃａａｍｅｒｉｃａｎａ）核基因组中克隆了商陆抗病毒蛋白基因,序列分析表明,该基因含８８５个核苷酸,与已报道的序列比较,核苷酸同源性为９９．３％。     

美洲商陆抗真菌蛋白转化烟草的研究和抗病性检测

本研究为美洲商陆抗病毒蛋白(PaAFP)基因首次对植物遗传转化的研究,转入烟草中研究此蛋白对烟草立枯病的抗性。从美洲商陆叶片中获得美洲商陆抗真菌蛋白前体蛋白基因cDNA序列,构建植物表达载体pCAMBIA1300-PaAFP,通过三亲杂交法将其导入根癌农杆菌LBA4404受体菌,转染烟草获得了大量再生转基因植株。PCR、Southern杂交、RT-PCR以及Tris-Tricine-SDS-PAGE检测结果表明目的基因已经整合到烟草基因组中,并且已经得到转译。转基因植株苗期抗立枯病试验表明,转基因烟草植株对立枯丝核菌表现出了抗性。     

几种破除美洲商陆种子休眠的方法

选取饱满籽粒的美洲商陆(Phytolacca americana L.)种子,用以下方法破除种子休眠:(1)98%H2SO4浸种20、40、60min;先用98%H2SO4浸泡40min,再分别用100、200、300、400mg·L-1的赤霉素(GA3)浸种60min。(2)用去离     

美洲商陆一种抗真菌蛋白的cDNA克隆及序列分析

根据美洲商陆种子中一种抗真菌蛋白ＰＡＦＰ的Ｎ端部分氨基酸顺序,设计,合成一条５‘端寡核苷酸引物,通过３’－ＲＡＣＥ技术从种子总ＲＮＡ扩增出一约３５０ｂｐ的ｃＤＮＡ片段,成功地克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体系统中。序列分析该,ｃＤＮＡ含有１１４ｂｐ的编码区,由此推导的３８个氨基酸序列有３６个与ＰＡＦＰ的序列相同,仅在第３５,３６位氨基酸分别由Ｃｙｓ,Ｌｙｓ代了后者的Ｇｌｎ和Ｉｌｅ。     

天麻中一种抗真菌蛋白基因的克隆

依据天麻(GastrodiaelataBl.f.flavidaS.Chow)抗真菌蛋白GAFP_1的N端部分氨基酸序列设计简并引物,通过RACE(快速分离cDNA末端)的方法扩增得到GAFP_1全长cDNA。该cDNA包含一个编码171个氨基酸的ORF,推导的多肽序列与测得的蛋白质部分序列相同;在5′端有一个长为55bp的5′非编码区;终止密码子下游有一个141bp长的3′非编码区,其中含有两个加poly(A)信号及长度为26个腺苷酸的poly(A)。经检索发现该推导蛋白序列与火烧兰(Epipactishelloborine)和二叶兰(Listeraovata)的甘露糖结合蛋白以及雪花莲(Galanthusnivalis)中的甘露糖结合凝集素具有很高同源性。     

美洲商陆PaENO基因克隆及其表达分析

烯醇化酶(enolase,ENO)作为糖酵解途径的一个酶,还能够参与植物生长发育以及应对非生物胁迫。该研究以镉超富集植物——美洲商陆(Phytolacca americana L.)为材料,根据美洲商陆转录组数据,设计特异性引物,从叶片中克隆PaENO基因,并进行序列分析、原核表达与纯化、表达模式分析以及抗镉实验,为深入研究PaENO蛋白的酶活性质以及PaENO基因在美洲商陆应对镉胁迫过程的功能机制奠定基础。结果表明：(1)成功克隆获得PaENO基因(GenBank登录号为JN656932.1),该基因开放阅读框为1 335 bp,编码444个氨基酸。(2)多序列比对分析显示,PaENO蛋白与冰叶日中花的ENO蛋白序列一致性最高,为93.47%;系统进化分析表明,PaENO与冰叶日中花、甜菜、菠菜的亲缘关系较近,处于同一进化分支。(3)RT PCR结果显示,PaENO基因在美洲商陆叶中表达量最高为根的2.5倍,茎中表达量最低,仅为根的1/5;Cd胁迫后PaENO基因表达水平显著升高,并于2 h时PaENO基因表达量迅速升高至Cd胁迫前(0 h时)的9.54倍,Cd胁迫12 h、24 h时降低到0 h时的 3.12倍和2.89倍,说明PaENO基因参与了美洲商陆应对Cd胁迫的响应。(4)通过成功构建原核表达载体pET28a PaENO并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后,在50 kD左右出现目的条带,然后用超声破碎大肠杆菌细胞,离心后分别取上清和沉淀,SDS PAGE检测发现,PaENO在上清和沉淀中都有表达,而且在上清中的表达量较高;使用Ni亲和层析试剂盒纯化PaENO蛋白,获得了纯化的PaENO蛋白;镉抗性实验结果初步证实,表达PaENO蛋白能够显著提高大肠杆菌对镉的抗性。研究认为,PaENO蛋白可能以转录因子(PaMBP 1)的形式在美洲商陆应对镉胁迫过程中发挥调控作用。     

红霉素合成蛋白基因的克隆和高表达

文献报道红霉素合成蛋白DEBS2 (6-脱氧红霉内酯B合酶)(374 kD)基因在大肠杆菌(Escherichia coli)中异源表达量比较低,难以开展后续蛋白纯化和结构等研究.为获得该大蛋白基因的异源高表达,本研究通过PCR的方法,对编码红霉素合成蛋白DEBS2的基因起始5'端设计了起始密码子之后的十一个简并密码子序列,随机筛选获得在表达宿主BL21(DE3)中高表达的简并序列质粒,质粒命名为DEBS2-17.结果 表明:mRNA的起始二级结构影响200 kD以上的蛋白质表达水平.本研究为开展红霉素合成蛋白的结构及生化研究提供理论基础,同时对表达分子量200 kD以上蛋白具有一定借鉴意义.     

桑蚕金属硫蛋白基因的克隆和表达

金属硫蛋白（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ,简称ＭＴ）是一类广泛存在于生物体内的低分子量蛋白,由５３～６２个氨基酸组成。ＭＴ具有多种生物活性,参与生物体内微量元素的储存、运输、代谢、抗辐射、清除羟基自由基及重金属解毒等多种作用。ＭＴ的生物学功能与ＳＯＤ极为相似,在某些方面优于ＳＯＤ。由于ＭＴ在医学、农业等方面有着重要的应用前景,ＭＴ的基础研究及应用开发研究已成为一个热门课题。用ＢａｍＨＩ和ＳｅｃＩ双酶切带有酵母ＭＴ基因的质粒ｐＣＭ１－１,获的ＭＴＩ基因片段,用地高辛标记作为探针。提取肥苏蚕卵的总…     

入侵植物美洲商陆的传粉生态学特性

从开花物候、花朵数量性状、花粉活力、花粉组织化学、柱头可授性、花粉在柱头上的萌发状况、杂交指数、花粉胚珠比、传粉媒介以及繁育系统等方面,研究了外来入侵植物美洲商陆(Phytolacca americana)的传粉生态学特性,为揭示该物种成功入侵的机理提供依据.结果表明:美洲商陆种群花期可达45~70 d,单花花期为2~3d,可进一步分为杯状花期、花瓣平展期、花瓣下垂期、花瓣反卷期;花冠直径在下垂期最大且不超过1 cm,花药与柱头间距离在1 ~2.5 mm,有利于自交的发生;花瓣平展期与花瓣下垂期花粉活力差异显著(P<0.05),杯状花期与花瓣平展期花粉活力差异不显著(P>0.05),花瓣平展期花粉活力可达85%;雌蕊柱头可授性在花瓣平展期最强;杯状花期合生柱头开裂,花瓣平展期柱头9~ 10裂,接受花粉的表面积增大;花药散粉时间与合生柱头开裂时间相吻合,有助于柱头接受花粉;扫描电镜下观察到花粉在花瓣平展期的柱头上已萌发;每朵花可提供1667~3222粒花粉,胚珠9~10个,花粉胚珠比(P/O)为340.88±34.99,表现为兼性自交;美洲商陆杂交指数(OCI)为3,花粉粒属于含脂型,主要传粉昆虫有蜜蜂、胡蜂、食蚜蝇、细腰蜂.综上所述,美洲商陆自交亲和,花粉活力高、柱头可授性强,且高花粉活力与强柱头可授性出现在相同的时期,增加了花粉落置柱头及在柱头上萌发的几率;虫媒花,访花者行为与花朵相适应,有利于提高坐果率,这样的繁殖机制与传粉特点是美洲商陆成功入侵的主要因素之一.     

一种新的蛋白酪氨酸磷酸酶基因的克隆、定位和组织表达谱研究

从人胎肝cDNA库分离出一长度为5248bp的cDNA克隆,该基因包含26个外显子和25个内含子,染色体定位于在某些肿瘤细胞中易缺失的3p21.1-21.33。其可读框编码1636个氨基酸,该蛋白属于蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）家族,其C端有一个典型的PTP结构域,N端含有约800氨基酸残基的BRO1样结构域及随后2个可能的SH3结构域结合位点,在这两个结构域之间及C末端还各有一个脯氨酸富集区。Northern杂交和点杂交分析显示,该基因以大约5.4kb的单一转录物广泛表达于人体各种组织,而且在人部分肿瘤细胞中高表达。结果提示,人源PTP－TD14是一个新的蛋白酪氨酸磷酸酶。     

解淀粉芽孢杆菌TF28抗菌蛋白基因TasA克隆与表达

[目的]克隆解淀粉芽孢杆菌TF28抗菌蛋白基因Tas A并进行原核表达和抑菌活性研究。[方法]采用PCR方法扩增抗菌蛋白基因Tas A,连接p ET22b载体,导入E.coli BL21(DE3)菌株,进行IPTG低温诱导表达,用His柱纯化表达产物,采用纸片方法测定其抑菌活性。[结果]从解淀粉芽孢杆菌TF28中克隆了抗菌蛋白基因Tas A,以p ET22b为表达载体构建高效表达抗菌蛋白Tas A的基因工程菌株,该菌株在0.05 mmol/L IPTG 15℃诱导4 h,Tas A蛋白表达率为34.2%,经His柱纯化后获得SDS-PAGE电泳一条带的纯化Tas A蛋白,其含量为67.8 mg/L,收率为90.8%。该蛋白抑制番茄灰霉病和叶霉病、玉米茎基腐病和水稻稻曲病菌生长。[结论]实现抗菌蛋白基因Tas A的原核表达,表达率34.2%,表达蛋白具有广谱抑菌活性,在植病生防方面具有应用潜力。