戊型肝炎病毒感染分子生物学检测方法研究进展

随着戊型肝炎病毒 (ＨＥＶ)分子克隆技术的成功建立 ,ＨＥＶ分子生物学的研究取得了极大进展 ,与之相关的ＨＥＶ检测方法也正在不断完善。该方法包括两方面 ,即采用基因工程重组抗原建立的抗体诊断方法 ,以及采用逆转录———聚合酶链反应 (ＲＴ -ＰＣＲ)建立的基因诊断方法 ,分别检测抗ＨＥＶ及ＨＥＶＲＮＡ。1　抗ＨＥＶ的检测利用体外表达的各种ＨＥＶ重组蛋白 ,已建立了多种抗ＨＥＶ检测方法 ,包括酶联免疫方法 (ＥＩＡ)和蛋白印迹技术 (ＷＢ)等用于ＨＥＶ感染的临床诊断和实验研究。第 1代抗ＨＥＶＥＩＡ检测试剂由 3块酶联反应板组成 …     

戊型肝炎病毒DNA免疫的研究

利用PCR方法获得1163bp的戊型肝炎（Hepatitis E Virus,HEV）开放读码框架（Open Reading Frame,ORF）ORF2之3'大片段和369bp ORF3的完整片段,分别克隆到真核表达载体pcDNA3中,构建两种含有HEV主要抗原表位的质粒DNA：pcE2和pcE3,分别或混合免疫Swiss小鼠三次（0时,第2周,第4周）,观察其在小鼠体内诱发的体液免疫应答。ELISA检测结果表明,pcE2和pcE3在小鼠体内均可诱导出一定水平的HEV IgG抗体,且在第三次免疫接种两周后,100％的小鼠抗体阳转。与两和中质粒单独免疫相比,两者同时注射的抗体水平较高。本研究为HEV DNA疫苗的研究打下一定基础。     

戊型肝炎病毒荧光定量RT-PCR快速检测技术的建立和初步应用

利用DNAMAN软件对GenBank登录的戊型肝炎病毒四个主要基因型代表株的序列进行分析, 选择其高度保守的ORF2区域设计合成引物和探针, 并用包含有扩增区域的核苷酸片段进行体外转录制备标准品cRNA。在对荧光定量RT-PCR的反应条件优化的基础上, 建立了适用于戊型肝炎病毒主要基因型检测的荧光定量RT-PCR检测技术。该检测技术可以有效检测I型和IV型戊型肝炎阳性病料, 而对猪的其它几种疫病阳性病料则为阴性结果, 证实本技术的特异性强、可靠性好。对阳性标准品的检测结果表明, 所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR灵敏度可达2.0×101拷贝/反应, 相比于巢式RT-PCR方法, 其灵敏度高10~100倍以上。在对54份临床样品的检测中, 进一步证实了该方法快速、灵敏且重复性好, 可满足戊型肝炎病毒早期快速诊断的需要。     

戊型肝炎病毒荧光定量RT-PCR快速检测技术的建立和初步应用

利用DNAMAN软件对GenBank登录的戊型肝炎病毒四个主要基因型代表株的序列进行分析, 选择其高度保守的ORF2区域设计合成引物和探针, 并用包含有扩增区域的核苷酸片段进行体外转录制备标准品cRNA。在对荧光定量RT-PCR的反应条件优化的基础上, 建立了适用于戊型肝炎病毒主要基因型检测的荧光定量RT-PCR检测技术。该检测技术可以有效检测I型和IV型戊型肝炎阳性病料, 而对猪的其它几种疫病阳性病料则为阴性结果, 证实本技术的特异性强、可靠性好。对阳性标准品的检测结果表明, 所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR灵敏度可达2.0×101拷贝/反应, 相比于巢式RT-PCR方法, 其灵敏度高10~100倍以上。在对54份临床样品的检测中, 进一步证实了该方法快速、灵敏且重复性好, 可满足戊型肝炎病毒早期快速诊断的需要。     

戊型肝炎病毒DNA免疫的研究

利用PCR方法获得1 163 bp的戊型肝炎（Hepatitis E Virus,HEV）开放读码框架(Open Reading Frame,ORF)ORF2之3’大片段和369bp ORF3的完整片段,分别克隆到真核表达载体pcDNA3中,构建两种含有HEV主要抗原表位的质粒DNApcE2和pcE3,分别或混合免疫Swiss小鼠三次（0时,第2周,第4周）,观察其在小鼠体内诱发的体液免疫应答。ELISA检测结果表明,pcE2和pcE3在小鼠体内均可诱导出一定水平的HEVIgG抗体,且在第三次免疫接种两周后,100%的小鼠抗体阳转。与两种质粒单独免疫相比,两者同时注射的抗体水平较高。本研究为HEVDNA疫苗的研究打下一定基础。     

戊型肝炎检测方法及疫苗研究进展

从ＨＥ及其病原戊肝病毒（ＨＥＶ）研究发现历史开始列举了ＨＥＶ当前主要研究成果。着重论述了有效的检测ＨＥＶ基因、抗原和抗体研究进展。国际上应用于临床诊断、流行病学研究的抗—ＨＥＶ诊断试剂的简况。ＨＥ疫苗的研究已进入临床前阶段,猴体实验结果显示获得高抗体滴度被动免疫可保护试验猴免于ＨＥＶ攻毒后肝炎。主动免疫显示了更完全的保护效果,双剂主动免疫既保护猴免于ＨＥＶ攻毒后肝炎又保护猴免于ＨＥＶ感染     

新疆猪粪便戊型肝炎病毒RNA的检测及序列分析

从戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)IgG检测阳性的新疆某猪场采集70份猪粪便,利用逆转录套式聚合酶链方法(RT-nPCR),检测HEV RNA,其中13份为阳性,阳性率18.57%.将PCR扩增产物克隆到pMD18-T载体上,构建成重组质粒并测序,结果表明,13株猪源HEV分离株在HEV ORF2 348bp核苷酸序列的同源性为97.1%～100%,为同一基因型;与HEV Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的同源性分别为74.1%～77.6%,71.6%～74.1%,73.3%～78.2%和82.8%～91.4%,与ⅣA亚型的同源性同源性最高达89.4%～91.4%.以该核苷酸片段绘制的基因进化树显示13株猪源HEV与HEVⅣT1株在同一分支上,属基因Ⅳ型;与国内其他猪源HEV分离株该片段核苷酸序列的同源性为82.6%～91.3%,提示中国猪源HEV的基因型比较一致,同属HEVⅣ型.     

广西地区野鼠戊型肝炎病毒感染情况调查

从广西壮族自治区5个市采集256份野鼠肝脏和对应的血清211份,采用HEV抗体(HEV-Ab)酶联免疫试剂盒(双抗原夹心法)对血清样本进行抗-HEV检测,并对不同地区HEV抗体阳性率进行χ2检验。采用HEV核酸荧光PCR试剂盒对肝脏样本进行HEV核酸检测。结果显示,211份野鼠血清抗-HEV的抗体阳性率为6.6%,其中百色市的抗体阳性率最高,为14.1%,其他地区抗体阳性率均在10%以下。256份野鼠肝脏中未检测到HEV核酸。由此可见,广西壮族自治区5个市的野鼠中存在HEV感染,但其是否为HEV的自然宿主及在戊型肝炎传播中起何作用需进一步研究。     

检测猪粪便中基因4型戊型肝炎病毒的实时荧光定量RT-PCR方法的建立

针对基因4型戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)基因组ORF3设计特异性引物和探针,建立了一套TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法。评价了该方法的准确性和灵敏性,同时与常规RT-PCR和巢式RT-PCR方法进行了对比分析。结果表明,生成的标准曲线显示各浓度范围内具有良好的线性关系,相关系数(r2)为0.994,斜率为-3.312,PCR效率为100%。组内和组间重复性试验相同稀释度标准质粒Ct值之间差异均不显著,并且能够准确的从HEV阳性猪粪便样品中检测到基因4型HEV RNA,具有较好准确性。可检测到戊型肝炎病毒数量为(1.7×101)copies,比普通RT-PCR的灵敏度高100倍,比Nested RT-PCR高10倍。     

番茄褪绿病毒TaqMan荧光定量PCR快速检测方法的建立与应用

【目的】本研究旨在建立TaqMan实时荧光定量PCR(TaqMan RT-qPCR)技术,快速检测单头烟粉虱Bemisia tabaci体内的番茄褪绿病毒(tomato chlorosis virus, ToCV)。【方法】根据ToCV外壳蛋白保守序列设计了1对特异性引物和1条TaqMan探针,建立了TaqMan RT-qPCR方法;与常规PCR检测进行比较,检测该方法的灵敏度与特异性;并应用该方法对单头烟粉虱成虫体内ToCV进行了快速检测。【结果】本研究构建的TaqMan RT-qPCR检测ToCV的标准曲线,其循环阈值(Ct值)与模板浓度具有良好的线性关系,扩增效率为98%。该方法对ToCV的最低检测浓度为8.3×10 copies/μL,灵敏度是常规RT-PCR的1 000倍。该方法与田间番茄两种重要病毒番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)和番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus, TSWV)检测无交叉反应。单头烟粉虱成虫ToCV检测结果表明,温室内ToCV侵染植株上烟粉虱携毒率为100%,田间烟粉...     

Development of a quantitative method for the detection of enteroviruses in soil.

A method is described for efficiently concentrating enteroviruses from soil. Viruses were eluted from soil by mechanical agitation in high pH glycine buffer containing ethylenediaminetetraacetic acid. The eluted viruses were concentrated on a floc that formed de novo upon adjustment of the soil eluate to 0.06 M aluminum chloride and pH 3.5. Viruses not pelleted with the floc were concentrated by adsorption to and elution from membrane filters. This method yielded an average efficiency of 66% recovery from loamy sand soil for four enteroviruses. Virus recovery from soil was consistently high, with samples ranging in size from 25 to 500 g. The method was used successfully to isolate naturally occurring viruses from soil beneath a wastewater land treatment site. Recovery of enteroviruses by this method form different types of soil was dependent on percentage of clay, surface area, and cation exchange capacity. Recovery was not dependent on soil saturation pH or on percentage of organic matter. This method should prove useful for studying enterovirus migration and survival during the land application of domestic sewage.     

Development of a quantitative method for the detection of enteroviruses in soil.

A method is described for efficiently concentrating enteroviruses from soil. Viruses were eluted from soil by mechanical agitation in high pH glycine buffer containing ethylenediaminetetraacetic acid. The eluted viruses were concentrated on a floc that formed de novo upon adjustment of the soil eluate to 0.06 M aluminum chloride and pH 3.5. Viruses not pelleted with the floc were concentrated by adsorption to and elution from membrane filters. This method yielded an average efficiency of 66% recovery from loamy sand soil for four enteroviruses. Virus recovery from soil was consistently high, with samples ranging in size from 25 to 500 g. The method was used successfully to isolate naturally occurring viruses from soil beneath a wastewater land treatment site. Recovery of enteroviruses by this method form different types of soil was dependent on percentage of clay, surface area, and cation exchange capacity. Recovery was not dependent on soil saturation pH or on percentage of organic matter. This method should prove useful for studying enterovirus migration and survival during the land application of domestic sewage.     

Development of an immunoenzyme method for detection and quantitative determination of microcystins

An indirect competitive immunoenzyme method for the quantitative estimation of microcystins (MCs) in water (MC-ELISA) using prepared MC-specific polyclonal antibodies was developed. The threshold concentration of the most widespread and highly toxic MC-LR, which was reliably detected using MC-ELISA, was 0.05 ± 0.01 ng/mL; the 50% inhibition concentration was 0.41 ± 0.05 ng/mL; and the concentration range for the quantitative estimation of MC-LR was 0.1–5.0 ng/mL. The MC-ELISA made it possible to detect MC-LR in water at concentrations 10–20 times lower than the World Health Organization guideline level for drinking water and 100–200 times lower than the allowable MC concentrations in water bodies. A group of cross-reacting MCs and nodularin was detected using MC-ELISA. This method can be applied for monitoring MC concentrations in water bodies and drinking water.     

犬SLAM受体mRNA荧光定量PCR检测方法的建立和初步应用

目的建立荧光定量PCR方法,检测犬不同组织中SLAM受体mRNA的表达水平。方法以犬GAPDH为内参基因采用△△ct法,分析SLAM受体mRNA在犬体内不同组织中的表达。结果此方法有较高的重复性,变异系数在0．89％-2．35％。以SLAM受体在心脏的表达为1倍值,结果显示受体mRNA在脾脏中表达最高,为38．49倍;肺门淋巴结、肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结中表达次之,分别为9．13、8．58、6．24倍;膀胱中表达最低。结论成功建立了检测SLAM受体mRNA在不同组织中表达水平的荧光定量PCR检测方法。     

白喉类毒素酶联免疫检测法的建立及初步应用

目的建立测定吸附无细胞百白破联合疫苗中白喉类毒素酶联免疫检测(ELISA)方法,并进行验证及初步应用。方法以高效价兔抗DT多克隆抗体和相应酶标抗体建立双抗体夹心ELISA法,确定线性范围同时验证该方法的重复性和特异性等确定检测限度,并初步应用。结果 DT含量在0~0.0160 Lf/m L范围内反应曲线线性关系良好(r0.99)。该方法与破伤风类毒素(Tetanus toxoid,TT)、百日咳毒素(Pertussis toxin,PT)、百日咳丝状血凝素(Filamantous hemagglutinin,FHA)与黏着素(Pertactin,Prn)无明显交叉反应,重复性好、特异性较强,精密度及准确度验证均符合常规质控要求,通过验证确定的准确检测范围为0.000 8~0.016 0 Lf/m L;检测限度为0.000 8 Lf/m L。该方法对DT抗原进行了吸附率的检测,同时检测了10批白喉类毒素原液与《中华人民共和国药典》三部2010年版规定的絮状单位检测方法进行对比,变异系数低于20%。结论建立了白喉类毒素双抗体夹心ELISA检测方法,为吸附无细胞百白破联合疫苗生产过程中白喉类毒素含量的质量控制提供了有效技术手段。     

Rapid and quantitative detection of blood Serratia marcescens by a real-time PCR assay: its clinical application and evaluation in a mouse infection model

Large-scale nosocomial outbreaks of Serratia marcescens septicaemia in Japan have had a fatality rate of 20-60% within 48 h. As a countermeasure, a real-time PCR assay was constructed for the rapid diagnosis of S. marcescens septicaemia. This assay indeed detected S. marcescens in clinical blood specimens (at ca. 10(2)CFU ml(-1)), at a frequency of 0.5% in suspected cases of septicaemia. In mice, the assay provided estimates of blood S. marcescens levels at various infectious stages: namely, 10(7) to 10(8)CFU ml(-1) at a fatal stage (resulting in 100% death), 10(4)-10(5)CFU ml(-1) at a moderately fatal stage (resulting in 50% or more death), and <10(3)CFU ml(-1) at a mild stage (resulting in 100% survival), consistent with actual CFU measurements. Blood bacterial levels could be an important clinical marker that reflects the severity of septicaemia. The simultaneous detection of S. marcescens and the carbapenem resistance gene was also demonstrated.     

山羊痘病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的建立与应用

利用DNAStar分析了GenBank中所有8株羊痘病毒全基因序列,选取位于山羊痘病毒(AY077835)基因组gp064区域约64bp的基因片段,设计并合成了一对PCR引物和一条TaqMan-MGB探针,建立了FQ-PCR和标准曲线,并利用该方法对山羊痘临床皮肤痘疹材料和人工感染动物材料进行GPV核酸检测。结果表明,构建的FQ-PCR具有良好的敏感性、特异性、稳定性和临床应用性。该方法的建立为山羊痘临床快速高效地诊断和山羊痘病毒感染羊只的发生、发展及转归研究提供了一种有效的手段。     

油气田土壤甲烷氧化菌实时荧光定量PCR检测技术的 建立与应用

【目的】建立快速检测甲烷氧化菌含量的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR技术,用于油气微生物勘探。【方法】以含有甲烷氧化菌功能基因pmoA片段的重组质粒为标准品,优化实验条件,建立标准曲线,进行敏感性、重复性和特异性评价,并将该技术用于实际样品的检测。【结果】该技术标准曲线的相关系数R2为0.999 9,扩增效率为99.976%,检测范围为3.897×101-3.897×109 copies/μL,检出限约为40 copies/μL,重复性实验中CT值的变异系数优于3%,对12种非甲烷氧化菌均没有扩增,显示该技术具有很好的敏感性、重复性和特异性。利用该技术对气田、油田和非油气田土样进行了检测,发现气田具有明显的异常高值。【结论】为油气田的勘探建立了一种高效、特异、灵敏、准确的甲烷氧化菌荧光定量PCR检测技术,同时为其它指示菌检测技术的建立提供了参考。